脯氨酰羟化酶抑制剂在改善肝豆状核变性疾病症状中的用途
阅读说明：本技术 脯氨酰羟化酶抑制剂在改善肝豆状核变性疾病症状中的用途 (Use of prolyl hydroxylase inhibitors for ameliorating symptoms of hepatolenticular degeneration diseases ) 是由 芈肖肖 施军平 于 2020-05-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了脯氨酰羟化酶抑制剂在改善肝豆状核变性疾病症状中的用途,本发明所使用的脯氨酰羟化酶抑制剂可以稳定HIF-1α,并激活其转录活性；肝脏灰度减弱,脂质代谢因子的表达显著降低,肝脏H&E染色显示脯氨酰羟化酶抑制剂可以有效改善肝脏病理,减轻肝脏铜积累；同时检测到与γ-氨基丁酸能神经元信号以及多巴胺能神经元信号相关因子的表达得到改善,运动能力得到改善。(The invention discloses an application of prolyl hydroxylase inhibitor in improving symptoms of hepatolenticular degeneration diseases, the prolyl hydroxylase inhibitor used in the invention can stabilize HIF-1 alpha and activate the transcriptional activity thereof; the gray level of the liver is weakened, the expression of lipid metabolism factors is obviously reduced, and H & E staining of the liver shows that the prolyl hydroxylase inhibitor can effectively improve liver pathology and reduce liver copper accumulation; meanwhile, the expression of the factor related to the GABAergic neuron signal and the dopaminergic neuron signal is improved, and the motor ability is improved.)
技术领域
本发明涉及医疗技术领域，尤其涉及脯氨酰羟化酶抑制剂在改善肝豆状核变性疾病症状中的用途。
背景技术
肝豆状核变性(又称Wilsondisease，OMIM#277900)是由于ATP7B基因突变导致的一种常染色隐性遗传的代谢性疾病。ATP7B基因突变会造成铜离子在肝细胞过量蓄积，过多的铜离子还可沉积在大脑豆状核、角膜以及肾脏，造成相应脏器的损伤。该疾病的全球发病率约为1/30,000，亚洲人群的发病率高于欧美人群，中国人群的发病率约为1/17,000。该疾病是青少年原因不明肝硬化的常见病因。肝豆状核变性患者的临床表现以肝脏病变和神经精神症状为主，肝脏早期病理和临床表现主要为脂肪变，随后可进展为肝炎和肝硬化。
肝豆状核变性患者以中青年为主，同时越来越多学龄前患儿被相继报道。该疾病必须及早发现并给予治疗，现有驱铜类治疗药物会带来严重神经退化副作用以及患者依从性差，这使得该疾病的治疗目前依然存在很大瓶颈。
我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术已成功构建了ATP7B-/-肝豆状核变性斑马鱼模型，该模型可模拟肝豆状核变性肝脏和神经症状指症。由于在发育5天后即可达到消化器官成熟，因此该模型相比啮齿类动物模型可缩短研究周期。
前期我们通过对数据库中肝豆状核变性疾病模型的转录组分析，发现HIF-1信号位于显著改变的行列。HIF(Hypoxia-induciblefactor)是对氧气水平敏感的转录复合体，可调节肝脏葡萄糖和脂质代谢。HIF是异源二聚体，包括调节型α亚基和组成型β亚基。
HIF-1α转录调节的下游因子包括两类，一类是血红素生成因子和血管生成因子，它们可以增加对氧气利用；另一类是能量代谢调节因子，它们可以减少对氧气消耗。敲除肝细胞HIF-1α会加剧酒精诱导的小鼠肝脏脂质聚集。体外人肝癌细胞系HepG2细胞株的研究也发现，敲低HIF-1α会加剧脂质聚集，而过表达HIF-1α则减轻脂质沉积。HIF-1α可以干扰肝癌细胞中的脂肪酸β氧化。肝细胞特异性敲除HIF-1α会加剧胆碱缺乏性饮食诱导的小鼠肝脏脂肪变和肝内甘油三酯含量，同时阻断了核内lpin1升高。
发明内容
本发明的提供脯氨酰羟化酶抑制剂在改善肝豆状核变性疾病症状中的用途。
本发明的方案是：
脯氨酰羟化酶抑制剂在改善肝豆状核变性疾病症状中的用途。
作为优选的方案，所述脯氨酰羟化酶抑制剂可以显著增强HIF-1α的转录活性，使脂质代谢因子的表达显著降低，改善肝脏病理，减轻肝脏铜积累。
作为优选的方案，所述脯氨酰羟化酶抑制剂可以使γ-氨基丁酸能神经元信号以及多巴胺能神经元信号相关因子的表达得到改善。
作为优选的方案，所述脯氨酰羟化酶抑制剂为FG-4592与DMOG其中的一种。
本发明还公开了一种改善肝豆状核变性疾病症状的药物组合物，含有权利要求1的所述脯氨酰羟化酶抑制剂与药学上可接受的盐及药学上可接受的辅料。
本发明还公开了脯氨酰羟化酶抑制剂在肝豆状核变性斑马鱼模型上的方法：
1)通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建肝豆状核变性斑马鱼模型，培育出构建ATP7B-/-斑马鱼品系；
2)通过步骤1)中的ATP7B-/-斑马鱼，利用CRISPR/Cas9构建ATP7B-/-HepG2细胞稳定株；
3)收集步骤1)中的斑马鱼与步骤2)中的HepG2细胞分别用所述脯氨酰羟化酶抑制剂培育24h；
4)将步骤3)培育完成的斑马鱼标本与ATP7B-/-HepG2细胞分别进行表型分析鉴定。
作为优选的方案，所述3)中所述脯氨酰羟化酶抑制剂包括FG-4592或DMOG其中一种。
作为优选的方案，所述步骤4)斑马鱼标本的表型分析鉴定包括突变体肝脏组织学分析、突变体铜沉积分析、突变体运动轨迹检测、荧光定量QPCR。
作为优选的方案，所述步骤4)ATP7B-/-HepG2细胞的表型分析鉴定包括基因敲除情况检测、铜蓄积、细胞油红染色、荧光定量QPCR。
由于采用了上述技术方案，脯氨酰羟化酶抑制剂在改善肝豆状核变性疾病症状中的用途。
本发明的优点：
可以稳定HIF-1α，并激活其转录活性；肝脏灰度减弱，脂质代谢因子的表达显著降低，肝脏H&E染色显示有效改善肝脏病理，同时减轻肝脏铜积累；与γ-氨基丁酸能神经元信号以及多巴胺能神经元信号相关因子的表达得到改善，运动能力得到改善。
附图说明
图1为脯氨酰羟化酶抑制剂对ATP7B-/-斑马鱼肝脏症状影响的明场显微镜所示肝脏灰度；
图2为脯氨酰羟化酶抑制剂对ATP7B-/-斑马鱼肝脏症状影响的肝脏灰度定量比较；
图3为脯氨酰羟化酶抑制剂对ATP7B-/-斑马鱼肝脏症状影响的QPCR显示HIF-1信号的转录活性；
图4为脯氨酰羟化酶抑制剂对ATP7B-/-斑马鱼肝脏症状影响的QPCR显示脂质代谢因子变化；
图5为脯氨酰羟化酶抑制剂对ATP7B-/-斑马鱼肝脏症状影响的H&E染色显示肝脏病理；
图6为脯氨酰羟化酶抑制剂对ATP7B-/-斑马鱼肝脏症状影响的ICP-MS定量肝脏铜沉积量；
图7为添加脯氨酰羟化酶抑制剂对ATP7B-/-斑马鱼神经症状影响的运动轨迹追踪图；
图8为添加脯氨酰羟化酶抑制剂对ATP7B-/-斑马鱼神经症状影响的运动距离统计；
图9为添加脯氨酰羟化酶抑制剂对ATP7B-/-斑马鱼神经症状影响的QPCR显示GABAergic信号因子变化与dopaminergic信号因子变化；
图10为添加脯氨酰羟化酶抑制剂对ATP7B-/-HepG2细胞脂质代谢的影响的CRISPR/Cas9建立ATP7B-/-HepG2细胞；
图11为添加脯氨酰羟化酶抑制剂对ATP7B-/-HepG2细胞脂质代谢的影响的突变细胞株基因型鉴定；
图12为添加脯氨酰羟化酶抑制剂对ATP7B-/-HepG2细胞脂质代谢的影响的QPCR显示突变株和野生株ATP7B表达情况；
图13为添加脯氨酰羟化酶抑制剂对ATP7B-/-HepG2细胞脂质代谢影响的突变细胞株基因型比对结果；
图14为添加脯氨酰羟化酶抑制剂对ATP7B-/-HepG2细胞脂质代谢影响的QPCR显示脂质代谢因子变化；
图15为添加脯氨酰羟化酶抑制剂对ATP7B-/-HepG2细胞脂质代谢影响的油红染色显示胞内脂质沉积；
图16为添加脯氨酰羟化酶抑制剂对ATP7B-/-HepG2细胞脂质代谢影响的胞内铜含量变化。
具体实施方式
为了弥补以上不足，本发明提供了脯氨酰羟化酶抑制剂在改善肝豆状核变性疾病症状中的用途以解决上述背景技术中的问题。
脯氨酰羟化酶抑制剂在改善肝豆状核变性疾病症状中的用途。
所述脯氨酰羟化酶抑制剂可以显著增强HIF-1α的转录活性，使脂质代谢因子的表达显著降低，改善肝脏病理，减轻肝脏铜积累。
所述脯氨酰羟化酶抑制剂可以使γ-氨基丁酸能神经元信号以及多巴胺能神经元信号相关因子的表达得到改善并改善运动能力。
所述脯氨酰羟化酶抑制剂为FG-4592与DMOG其中的一种。
本发明还公开了一种改善肝豆状核变性疾病症状的药物组合物，含有权利要求1的所述脯氨酰羟化酶抑制剂与药学上可接受的盐及药学上可接受的辅料。
本发明还公开了脯氨酰羟化酶抑制剂在肝豆状核变性斑马鱼模型上的方法：
1)通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建肝豆状核变性斑马鱼模型，培育出构建ATP7B-/-斑马鱼品系；
2)通过步骤1)中的ATP7B-/-斑马鱼，利用CRISPR/Cas9构建ATP7B-/-HepG2细胞稳定株；
3)收集步骤1)中的斑马鱼与步骤2)中的HepG2细胞分别用所述脯氨酰羟化酶抑制剂培育24h；
4)将步骤3)培育完成的斑马鱼标本与ATP7B-/-HepG2细胞分别进行表型分析鉴定。
所述3)中所述脯氨酰羟化酶抑制剂包括FG-4592或DMOG其中一种。
所述步骤4)斑马鱼标本的表型分析鉴定包括突变体肝脏组织学分析、突变体铜沉积分析、突变体运动轨迹检测、荧光定量QPCR。
所述步骤4)ATP7B-/-HepG2细胞的表型分析鉴定包括基因敲除情况检测、铜蓄积、细胞油红染色、荧光定量QPCR。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例CRISPR/Cas9构建ATP7B-/-斑马鱼品系及表型分析：
通过CRISPR/Cas9构建ATP7B-/-斑马鱼品系：根据ATP7B基因序列，将gRNA靶点序列设计在exon2(编码MBD结构域)，合成引物，以pMD19-gata5_gRNAscaffold载体为模板制备gRNA体外转录模板。体外转录及纯化回收获得gRNA。将Cas9mRNA(300-600pg)和gRNA(200pg)新鲜混合后显微注射入单细胞期斑马鱼胚胎，每个靶点注射200枚左右。取48小时后注射胚胎(30枚，5枚/管)，提取基因组，PCR得到目标序列，测序。测序结果为双峰的注射批次胚胎进入饲养系统，待性成熟时(三个月)通过筛选其下一代胚胎检测有效突变类型。
突变体肝脏组织学分析：斑马鱼样本经4％多聚甲醛固定过夜，第二天取出后经以下溶液逐步洗涤，1×PBS(15分钟)-75％酒精(1小时)-90％酒精(1小时)-95％酒精(1小时)-100％酒精(1小时)。二甲苯透明20分钟，于60℃浸蜡1小时，包埋，4μm厚度切片，用H&E染色显示肝脏病理。
突变体铜沉积分析：使用ICP-MS(Inductively coupled plasma massspectrometry)定量肝脏铜含量。具体操作流程为：取斑马鱼样本，麻醉，去除尾部组织，收集100mg-200mg样本，加入HNO3和HF消化，后经HClO4孵育过夜，使用仪器Agilent 7500inductively coupled plasma masss pectrometer进行铜含量测定。
突变体运动轨迹检测：运动轨迹的观察方法简述如下：将鱼放入活动盒中，用迷宫视频追踪软件记录每条鱼每2分钟的运动路径，实验时间固定为下午1点到5点。使用EthoVision XT program(Noldus,Netherlands)进行运动轨迹分析。
实施例CRISPR/Cas9构建ATP7B-/-HepG2细胞株及表型鉴定：
CRISPR/Cas9构建ATP7B-/-HepG2细胞稳定株：
在exon2上下游设计一对sgRNA，sgRNA靶序列如下：5’端：sgRNA1-ttgggatattttgacaccag，3’端：sgRNA2-gtcttatagctcctggatgg。PCR扩增目的片段，通过BsmbI酶切PCR产物和Lenti-U6-sgRNA-mCherry质粒，将酶切产物通过T4连接酶连接到载体中，转化感受态细胞，提取质粒，测序鉴定阳性质粒。慢病毒包装、感染，收集感染后72小时细胞，用流式细胞仪进行分选。分选后的单克隆细胞在37℃培养箱中培养7-10天后，电泳及测序鉴定，阳性的单克隆细胞株进行扩大培养。
ATP7B-/-HepG2细胞株表型鉴定：
基因敲除情况检测：收集细胞，提取总RNA，反转cDNA,用如下引物进行QPCR扩增：F：5’-CATCAGGGAGGAGCAAGT-3’，R：5’-GAGCCAAAGTGGTGTCATT-3’。
铜蓄积：细胞种植在6孔板，用含铜培养基(0.25μM Cu)处理24小时。PBS洗涤，加入500μl胰蛋白酶37℃孵育3分钟，加入含血清培养基终止胰酶反应。离心，收集上清，重悬于PBS，加入RIPA裂解液，取1-2μl测蛋白浓度，其余送检测，通过ICP-MS测量细胞内铜含量。
细胞油红染色：收集加Cu培养基处理24小时细胞，预冷PBS洗涤，4％多聚甲醛固定，洗涤，加入60％过滤Oil Red O染液(Merck，O0625)，室温染色15分钟。苏木精染核1分钟，洗涤，于显微镜下明场成像。
荧光定量QPCR(Quantitative RT-qPCR)：
收集50-60条斑马鱼样本或106细胞，提取总RNA，使用M-MLV试剂盒(Invitrogen，C28025)反转成cDNA，以cDNA为模板，斑马鱼以EFL1-α为内参，HepG2细胞以GAPDH为内参，使用Green Quantitative RT-qPCR试剂盒(Invitrogen，A25780)进行QPCR反应，相关基因引物如下：
小分子化合物孵育：
斑马鱼样本用2.5μM FG-4592(S1007,Selleck Chemicals)或20μM DMOG(S7483,Selleck Chemicals)孵育24小时。HepG2细胞用5μM FG-4592或20μM DMOG孵育24小时。
⑤统计分析：
所有数值以平均值±SEM表示，当样本数>50时，以平均值±SD表示。差异性比较采用非配对t检验(双尾检验)。肝脏灰度测量使用Image J进行灰度分析，结果表示为每组相对于wildtype Cu组的变化倍数。P值<0.05为差异有统计学意义。
结果：
添加脯氨酰羟化酶抑制剂对ATP7B-/-斑马鱼肝脏症状的影响：我们利用CRISPR/Ca9已成功构建ATP7B-/-斑马鱼，该模型可以表现出肝豆状核变性的肝脏和神经症状。当外源添加脯氨酰羟化酶抑制剂FG-4592或者DMOG时，可以观察到肝脏灰度减弱(图1和图2)，脯氨酰羟化酶抑制剂可以显著增强HIF-1α的转录活性(图3)，脂质代谢因子的表达显著降低(图4)，肝脏H&E染色显示脯氨酰羟化酶抑制剂可以有效改善肝脏病理(图5)，同时减轻肝脏铜积累(图6)。
添加脯氨酰羟化酶抑制剂对ATP7B-/-斑马鱼神经症状的影响：当外源添加脯氨酰羟化酶抑制剂FG-4592或者DMOG时，可以观察到突变型斑马鱼的运动能力得到改善(图7和图8)，同时检测到与γ-氨基丁酸能神经元信号以及多巴胺能神经元信号相关因子的表达得到改善(图9)。
添加脯氨酰羟化酶抑制剂对ATP7B-/-HepG2细胞脂质沉积的影响：我们利用CRISPR/Cas9构建ATP7B-/-HepG2细胞株，在ATP7B基因外显子2上下游设计sgRNA(图10)，突变细胞株(KO株)表现为ATP7B基因外显子2完全缺失(图11和图13)，突变株ATP7B基因表达显著性降低(图13)。当外源添加脯氨酰羟化酶抑制剂FG-4592或者DMOG时，可以观察到突变型HepG2细胞脂质合成相关因子表达显著降低(图14)，油红染色显示添加脯氨酰羟化酶抑制剂可以改善突变型HepG2细胞脂质沉积(图15)，同时可以显著降低胞内铜含量(图16)。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界。