阅读说明：本技术 Pk11195的新用途 (New application of PK11195 ) 是由 吕金鹏 姜松周 杨莹 安晓虹 高榕荫 曹妍 宋国强 恽常军 于 2019-11-01 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,涉及PK11195的新用途,具体涉及PK11195或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防色素增多性疾病的药物/化妆品的用途,特别是在制备治疗和/或预防雀斑、妊娠斑、黄褐斑、咖啡斑、色痣等各种遗传性、紫外线、炎症因素诱导的色素沉着的药物/化妆品的用途。(The invention belongs to the technical field of medicines, relates to a new application of PK11195, and particularly relates to an application of PK11195 or a pharmaceutically acceptable salt thereof in preparing medicines/cosmetics for treating and/or preventing hyperpigmentation diseases, in particular to an application in preparing medicines/cosmetics for treating and/or preventing pigmentation induced by various hereditary, ultraviolet rays and inflammatory factors such as freckles, cyasma, chloasma, coffee spots, pigmented nevi and the like.)

PK11195的新用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及PK11195的新用途。

背景技术

皮肤黑色素在人们正常社会交往和保护人们免受紫外线辐射等方面发挥着重要的作用。体内外多种因素如α-促黑激素(α-MSH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、紫外线均可以诱导黑色素合成。但是皮肤中黑色素如果大量累积会导致色素增多性疾病，比如雀斑、妊娠斑、黄褐斑、咖啡斑、色痣、紫外线诱导的色素沉着、遗传性黑皮肤。色素增多性疾病不仅严重影响患者的容貌，对其造成很大的精神压力，甚至会诱发皮肤癌症，如黑色素瘤等。当前随着生活水平的提高，人们更重视这类疾病的防治。

目前，有多种抑制色素合成的化合物应用于色素增多性疾病领域的防治，如氢醌及熊果苷(氢醌衍生物)作为美白剂已广泛应用于药品/化妆品中。此外，对苯二酚、曲酸等也都是目前广泛应用的美白剂。但是上述美白剂在实际应用中均存在一定的毒副作用，其中曲酸在空气中极易被氧化，因此性质很不稳定。氢醌由于对黑色素细胞具有高度毒性作用，因此很容易引起皮肤毒性反应，此外，如果长期应用会引起黄褐斑及精神方面的问题，因此在临床方面，它已经逐渐被禁止使用。熊果苷做为氢醌衍生物，也会引起皮肤毒性反应。因此，开发作用方式新颖，疗效确切的抑制色素合成的药物/化妆品的需求日趋紧迫。

PK11195(CAS：85532-75-8)，化学名为1-(2-氯苯基)-N-甲基-N-(1-甲基丙基)-3-异喹啉羧酰胺。分子是为C₂₁H₂₁ClN₂O，分子量为352.86。为白色固体；无臭，味微苦。在乙醇、甲醇、二氯甲烷、DMSO中溶解。熔点为136～138℃。化学结构式如下：

PK11195是一种异喹啉羧酰胺，可以与外周型苯二氮卓受体(PBR)选择性结合。PK11195与PBR具有nM浓度级的亲和力，是目前应用最广的PBR配体之一。PBR在神经受损过程中表达明显上调，因此PK11195广泛应用于中枢神经系统疾病的早期诊断。此外，PK11195也被报道具有抗炎的作用，但是目前国内外未见有其抑制色素合成作用的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了PK11195的新用途，具体涉及PK11195用于制备治疗和/或预防色素增多性疾病的药物/化妆品的用途，特别是在制备治疗和/或预防雀斑、妊娠斑、黄褐斑、咖啡斑、色痣、紫外线诱导的色素沉着、遗传性黑皮肤的药物/化妆品的用途。

一方面，本发明提供了PK11195在制备治疗和/或预防色素增多性疾病的药物/化妆品的用途。进一步的，所述色素增多性疾病为雀斑、妊娠斑、黄褐斑、咖啡斑、色痣、紫外线诱导的色素沉着、遗传性黑皮肤。

另一方面，本发明提供了PK11195药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防色素增多性疾病的药物/化妆品的用途。进一步的，所述色素增多性疾病为雀斑、妊娠斑、黄褐斑、咖啡斑、色痣、紫外线诱导的色素沉着、遗传性黑皮肤。

另一方面，本发明提供了一种药物组合物在制备治疗和/或预防色素增多性疾病的药物/化妆品的用途，所述药物/化妆品组合物含有治疗有效量的PK11195或其药学上可接受的盐。进一步的，所述色素增多性疾病为雀斑、妊娠斑、黄褐斑、咖啡斑、色痣、紫外线诱导的色素沉着、遗传性黑皮肤。

本发明通过大量的现代药理科学研究，体内外药效学试验证明PK11195可以抑制正常状态的黑色素的合成，同时也可以抑制内源性因子(α-MSH、ACTH)、环境因素(紫外线)诱导的黑色素合成，具有治疗色素增多性疾病的功效，特别是治疗雀斑、妊娠斑、黄褐斑、咖啡斑、色痣、紫外线诱导的色素沉着、遗传性黑皮肤。

一：PK11195对正常人原代黑素细胞黑色素合成的影响

实验表明：PK11195对人原代黑素细胞增殖无显著影响，且显示出较低的毒性。

实验表明：PK11195可显著抑制人原代黑素细胞黑素的合成。

实验表明：PK11195可通过抑制人原代黑色素细胞中黑素合成关键蛋白(MITF、TYR)的表达而抑制黑色素的合成。

二：PK11195对斑马鱼黑色素合成的影响

实验表明：PK11195可以显著抑制斑马鱼的黑色素合成

三：PK11195对紫外线诱导的豚鼠背部皮肤色素沉着的影响

实验表明：PK11195可显著减少紫外线导致豚鼠背部皮肤的色素沉着。

有益效果：本发明提供了PK11195或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防色素增多性疾病的药物/化妆品的用途，特别是制备治疗和/或预防雀斑、妊娠斑、黄褐斑、咖啡斑、色痣、紫外线诱导的色素沉着、遗传性黑皮肤的药物/化妆品的用途。实验证明PK11195可通过抑制黑色素细胞中黑素合成重要蛋白(MITF、TYR)的表达而抑制黑色素合成；PK11195可以抑制斑马鱼、豚鼠皮肤的黑色素合成。为色素增多性疾病提供了一种新的有效的治疗选择。

附图说明

图1是PK11195对人原代黑色素细胞生长的影响。

图2是PK11195对α-MSH诱导的人原代黑色素细胞中黑色素合成的影响。

图3是PK11195对ACTH诱导的人原代黑色素细胞中黑色素合成的影响。

图4是PK11195对紫外线诱导的人原代黑色素细胞中黑色素合成的影响。

图5是PK11195对人原代黑色素细胞中黑色素合成关键蛋白MITF、TYR表达的影响。

图6是PK11195对斑马鱼黑色素合成的影响。

图7是PK11195对豚鼠背部皮肤黑色素合成的影响(背部皮肤照片)。

图8是PK11195对豚鼠背部皮肤黑色素合成的影响(背部皮肤黑色素的氨银染色)。

图9是PK11195与对照组随时间的推移对豚鼠背部皮肤影响的色差值图。

具体实施方式

为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

下面是本发明的部分药效学试验及结果：

第一部分：PK11195对人原代黑素细胞黑色素合成的影响

一、PK11195对人原代黑素细胞增值的影响

取处于指数生长期状态良好的正常人原代黑素细胞，消化、计数，将细胞接种于96孔培养板中，接种密度为5×10⁴个/ml，接种量为180μl/孔，置37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；加入不同浓度的PK11195，培养48小时；每孔加入20μl MTT，37℃培养箱中反应4小时；吸除上清液，每孔加入200μl DMSO，平板摇床上振摇10分钟；用微孔板测读仪在波长为570nm处测定每孔的吸光值，计算细胞增殖率。结果见图1。

实验结果：与空白对照组相比，PK11195给药组对正常人原代黑素细胞生长无显著性影响(P﹥0.05)。

实验结论：PK11195对人原代黑素细胞增殖无显著影响，且显示出较低的毒性。

二、PK11195对人原代黑素细胞黑色素合成的影响

取处于指数生长期状态良好的人原代黑素细胞，消化，计数，将细胞接种于6孔板中，接种浓度约1×10⁵个/ml，接种量为2ml/孔，置37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；分别应用α-MSH、ACTH、紫外线处理黑色素细胞，之后加入不同浓度PK11195，培养48小时；收集上述给药处理后的细胞，加入100μl非变性裂解液(含1nM PMSF)，4℃裂解20min；4℃，12000r/min离心10min，取上清用于蛋白定量(BCA法)，计算总蛋白含量；下层黑色素沉淀加入100μlNaOH(含10％DMSO)，置于80℃水浴箱中裂解2小时；将溶解完全的黑素以100μl/孔加入96孔板中，405nm处测定吸光度值，结果见图2，图3，图4。图2中与空白对照组相比，^*P﹤0.05，^***P﹤0.001；与α-MSH处理组相比，^###P﹤0.001。图3，图4中分别于与ACTH处理组，紫外线处理组相比，^*P﹤0.05，^**P﹤0.01，^***P﹤0.001。

实验结果：与空白对照组相比，PK11195可以显著抑制人原代黑素细胞的黑素合成；与α-MSH处理组、ACTH处理组、紫外线处理组相比，PK11195可以显著抑制以上因素诱导的黑色素合成作用，并且具有剂量依赖性。

实验结论：PK11195可显著抑制人原代黑色素细胞黑素的合成。

三、PK11195对人原代黑素细胞中黑素合成重要蛋白MITF、TYR表达的影响

取处于指数生长期状态良好的人原代黑素细胞，消化，计数，将细胞接种于6孔板中，应用α-MSH处理黑色素细胞，之后加入不同浓度PK11195，48小时后收集细胞，加入细胞裂解液，离心取上清BCA法测定蛋白浓度后，调整蛋白裂解液到相同浓度，与等体积的2倍上样缓冲液混匀，煮沸5分钟后进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳；电泳完毕后，用100V电压转移1小时将蛋白转至测NC膜上，用含5％脱脂牛奶的TBST(0.05％Tween-20)封闭1小时；将膜分别与溶于封闭液中的MITF、TYR、β-actin一抗(1：200)4℃孵育过夜，TBST洗5分钟，3次；后加入HRP标记的二抗体以结合一抗，室温孵育膜1小时。取出膜，用TBST洗涤4次，每次5分钟。化学发光法检测，将预先混合好的发光液滴加到膜上，用凝胶成像系统拍照成像。并采用Bio-Rad公司Quantity one软件分析结果。结果见图5。

实验结果：与空白对照组相比，PK11195可显著抑制人原代黑色素细胞中MITF、TYR的蛋白表达，差异具显著性(*P﹤0.05)；与α-MSH处理组相比，PK11195可显著抑制人原代黑色素细胞中MITF、TYR的蛋白表达，差异具显著性(^###P﹤0.001)

实验结论：PK11195可通过抑制人原代黑色素细胞中黑素合成重要蛋白(MITF、TYR)的表达而抑制黑色素合成。

第二部分：PK11195对斑马鱼黑色素合成的影响

斑马鱼饲养方法按照《The Zebrafish Book》进行。保持循环系统水温为28.5℃，每天固定光照时间为14小时、黑暗时间为10小时，每天早晚各喂食一次。收集胚胎的前一天下午将一尾雌鱼和一尾雄鱼放置入产卵缸中，并且以隔板隔开。第二日灯光开启后将隔板抽开，20分钟后可收集胚胎。清洗胚胎，并将胚胎培养在egg water中，放置于28.5℃的光照培养箱里。将同一时期的斑马鱼胚胎置于6孔板中，胚胎发育至35小时洗去加入不同浓度的PK11195。继续培养25小时后，用体视镜拍照观察斑马鱼黑色素合成的变化。结果见图6。

实验结果：与空白对照组相比，PK11195给药组显著抑制斑马鱼黑色素的合成。

实验结论：PK11195显著抑制斑马鱼黑色素的合成。

第三部分：PK11195对紫外线诱导的豚鼠背部色素沉着的影响

豚鼠适应性饲养后(10只，雌雄各半)，用剪刀剪除豚鼠背部长毛，电动剃须刀剃尽短毛，用SH4B紫外线光疗仪照射豚鼠背部皮肤，总面积为6*6cm²。灯管距豚鼠背部距离15cm，一次性照射剂量为500mJ/cm²，连续一周。豚鼠背部皮肤照光后一周，局部形成稳定的色素沉着，将照光区分为两处用药区，一处涂抹PK11195(1％)，一处涂抹空白基质，每处用药面积为1cm直径的圆，两处用药区间隔0.5cm，每日凃药两次。持续三周，用药前用电动剃须刀剃尽短毛。分别在紫外线照射前、照射后1周、用药后1周、2周、3周时用CR-400色彩色差仪测量豚鼠背部皮肤各部分的颜色变化，色差值＝每次测量值-紫外线照射前的测量值，并拍摄照片以便进行客观比较。四周之后，取皮肤组织，4％的多聚甲醛溶液固定，常规石蜡切片。Masson-Fontana胺银染色法测定豚鼠背部皮肤黑色素的变化。结果见图7，图8，图9。图9中与对照组相比，^*P＜0.05。

实验结果：与空白对照组相比，PK11195对抑制紫外线诱导的豚鼠背部皮肤中黑色素的合成。

实验结论：PK11195减少紫外线诱导的豚鼠背部皮肤的黑色素沉着。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。