一种在筛选新生抗原疫苗或药物时评价动物模型的方法及应用

文档序号：1308658 发布日期：2020-08-11 浏览：5次 >En<

阅读说明：本技术 一种在筛选新生抗原疫苗或药物时评价动物模型的方法及应用 (Method for evaluating animal model in screening of neoantigen vaccine or drug and application ) 是由冷国庆张琪苏宏健郝淮杰田辉王丽莉杨文龙余荣熹冷宁王艳张凤莲于 2020-05-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种在筛选新生抗原的疫苗或药物时评价动物模型的引物和探针,创建了其检测方法,并将其制作成试剂盒,该试剂盒通过检测人源肿瘤细胞来筛选和评价新抗原多肽疫苗、核酸疫苗及新抗原反应性细胞药物等动物模型的规范化和一致性,试剂盒操作简单、灵敏度高,灵敏度可达到单细胞水平。(The invention discloses a primer and a probe for evaluating an animal model when screening vaccines or drugs of neoantigens, a detection method is established, and the kit is manufactured into a kit.)

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种在筛选新生抗原疫苗或药物中评价动物模型的方法及应用。

背景技术

目前，在筛选新生抗原疫苗和药物过程中，通常采用荧光素酶动物成像和循环肿瘤细胞定量检测检测结果，来评价实验动物模型的规范化和一致性。

荧光素酶动物成像是将荧光素酶基因整合到肿瘤细胞中，培养出能稳定表达荧光素酶的肿瘤细胞株，将标记好的肿瘤细胞接种到实验动物体内后，通过检测设备观察外源肿瘤细胞位置来观测实验动物模型的肿瘤状态。

循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)是指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞。大量研究证实，外周血CTCs检测操作简单、准确定高，目前被认为最好及最客观的检测手段之一。CTCs的检测方法分为两类，基于玻片的免疫细胞化学技术(immunocytochemistry,ICC)和基于PCR(包括RT-PCR，巢式PCR等)的分子生物学技术。

ICC法被称为评价CTC检测方法的金标准，其优点包括：直观、简便，但肿瘤细胞表面抗原表达不均一、淋巴细胞的部分交叉反应等因素影响检测的特异性和敏感性。

基于PCR的检测技术是利用组织或肿瘤特异性mRNA的表达或某些基因改变后RNA水平异常的原理，这些mRNA标志不表达于正常外周血细胞，达到检测CTC的目的。该方法高效、特异、灵敏且操作简便，结果判定客观，是目前检测CTC最有效的方法。

肿瘤新抗原是体细胞基因由于理化损伤因素诱发或自发突变而产生的具有免疫原性的新生抗原。肿瘤新抗原只存在于肿瘤细胞而不存在于正常细胞，正是由于这些特点，肿瘤新抗原可以引发有效、安全和高度特异性的抗肿瘤免疫反应。因此，个性化新抗原疫苗目前被认为是一种极其有效且安全的免疫治疗。通过比较肿瘤组织和正常组织的全外显子和转录组数据，结合机器学习算法，国际上已开发出多种预测新抗原的软件工具，如pVAC-seq、TSNAD、Neopepsee等。这些软件预测新抗原的免疫原性需要通过各种体外和体内免疫学实验来验证，如酶联免疫斑点实验(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)、胞内因子染色实验(intracellular cytokine staining，ICS)、突变体-HLA分子四聚体(pHLAmultimer)、靶细胞杀伤或动物模型体内实验等方法。其中荷瘤动物模型如将人源的肿瘤细胞系接种到免疫缺陷小鼠体内的CDX模型(cell-line-derived xenograft)和将来源于患者的肿瘤组织块接种到免疫缺陷小鼠体内的PDX模型(patient-derivedxenograft)更能全面评价新抗原预测软件的预测准确率。

由于肿瘤细胞的异质性，现有技术中，在异源肿瘤细胞评价试验中，免疫细胞化学技术和分子生物技术均可以用于循环肿瘤细胞的鉴定。但免疫细胞化学技术依赖特异性的抗肿瘤抗原抗体，而且由于技术的局限性，免疫细胞化学技术只能使用2-3个肿瘤marker，且判断依赖人工，容易出现主观偏差；分子生物学技术，主要通过肿瘤细胞基因的特异性表达来评价肿瘤细胞的发展情况，但特异性表达基因的差异区段碱基差异性小、表达量不稳定状况，致使检测结果不稳定。

因此，如何提供一种操作简单、灵敏度高、稳定性强评价荷瘤动物模型一致性的方法是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明公开了一种人源循环肿瘤细胞的检测探针和引物，可对荷瘤动物模型进行准确、规范的评价。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于检测人源循环肿瘤细胞的引物和探针，其特征在于，引物包括PF1：SEQID NO.1、PR1：SEQ ID NO.2、PF2：SEQ ID NO.4、PR2：SEQ ID NO.5所述核苷酸序列，探针包括P1：SEQ ID NO.3、P2：SEQ ID NO.6所示核苷酸序列，且探针的5’端有荧光基团，3’端有淬灭基团；

所述PF1：CGGTCTGTACTTCTGTAC，SEQ ID NO.1；

所述PR1：GACAGAGATCTGGTAATTCA，SEQ ID NO.2；

所述P1：CACTGTCTTGCTCCACGCTG，SEQ ID NO.3；

所述PF2：AGCCTAAGATGAGAGTTC，SEQ ID NO.4；

所述PR2：CACAGAACTAGAACATTGATA，SEQ ID NO.5；

所述P2：ATCTGGAGTCCTATTGACATCGCC，SEQ ID NO.6；

其中，PF1、PR1和P1配套使用，PF2、PR2和P2配套使用；

一种检测循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的引物和探针在动物实验模型中检测循环肿瘤细胞的应用；

一种检测循环肿瘤细胞的方法，具体包括：

(1)提取动物血液样本中的RNA；

(2)将提取的RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板；以PF1/PR1为引物，以P1为探针或以PF2/PR2为引物，以P2为探针；进行实时荧光PCR扩增反应；

(3)根据荧光PCR扩增仪的结果计算血液样本中存在人源肿瘤细胞的数量；

一种在筛选新生抗原疫苗或药物时评价动物模型的方法，在筛选新生抗原疫苗或药物过程中建立动物模型，利用上述引物和探针检测模型动物中循环肿瘤细胞，评价动物模型的规范化和一致性；

动物模型包括人源肿瘤细胞系异种移植动物模型和人源肿瘤组织来源移植瘤模型；

新生抗原疫苗包括多肽疫苗、核酸疫苗、新抗原反应性细胞；

一种用于检测人源循环肿瘤细胞的试剂盒，包括：上述配套使用的引物、探针，还包括：RNA逆转录反应液、RT-PCR反应液；

RNA逆转录反应液包括：反转录引物、dNTPs、反转录缓冲液、DTT、MgCl₂、RNA酶抑制剂、反转录酶、RNase H；

优选的，反转录引物为oligo(dT)；

优选的，RNA酶抑制剂为重组RNA酶抑制剂；

RT-PCR反应液包括：上游引物、下游引物、探针、Taqman Universal Master MixⅡ和DEPC水；

上下游引物浓度为400M，探针浓度为200nM；

一种用于检测人源循环肿瘤细胞的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)提取检测样本中的RNA；

(2)将提取的样本RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增反应；

(3)根据荧光PCR扩增仪的结果对样本存在人源肿瘤细胞的数量；

反应条件为：94-98℃预运行2-15分钟；94-98℃运行5-20秒，58-60℃运行40-80分钟，运行重复40-45个循环；

优选的，反应条件为：95℃预运行10分钟；95℃运行15秒，60℃运行1分钟，运行重复40个循环；

根据不同数目肿瘤细胞与检测引物的Ct值之间的关系，建立标准曲线，标准曲线。基于标准曲线，通过实时定量PCR检测的Ct值，推出样品中肿瘤细胞的数目。

所述试剂盒用于评价筛选新生抗原疫苗或药物时所用动物模型的规范化和一致性；

所述新生抗原疫苗包括：多肽疫苗、核酸疫苗、新抗原反应性细胞等；

一种用于检测人源循环肿瘤细胞试剂盒的构建方法，包括以下步骤：

(1)选取人源高效、稳定的表达基因与动物模型基因组进行差异分析，获得差异位点；

(2)通过差异位点筛选荧光定量PCR的引物和探针；

(3)对荧光定量PCR反应体系进行优化，建立检测反应试剂盒；

(4)通过试剂盒对物种模型组织样品进行荧光定量PCR检测分析，检测试剂盒效果；

在异源肿瘤细胞实验模型中，物种模型体内存在的人源细胞，只有人工接种的肿瘤细胞，选择高效表达的人源特异基因，其具有表达量高、稳定的特性，将其表达量作为评标准，结果稳定、准确度高。

综上所述，本发明的检测试剂盒可以在动物模型中检测到人源肿瘤细胞，实验操作简单、灵敏度高，灵敏度可达到单细胞水平，提供了一种评价瘤动物模型的规范化和一致性的方法。

附图说明

图1：GUSB引物浓度优化实验；横坐标为循环数，纵坐标ΔRn值；

图2：GUSB探针浓度优化实验；横坐标为循环数，纵坐标ΔRn值；

图3：HPRT1引物浓度优化实验；横坐标为循环数，纵坐标ΔRn值；

图4：HPRT1探针浓度优化实验；横坐标为循环数，纵坐标ΔRn值；

图5：不同人源肿瘤细胞数目的扩增曲线；横坐标为循环数，纵坐标ΔRn值；扩增曲线从左右到，细胞数目依次为10⁴、10³、10²、10¹、10⁰和10^-1；

图6：GUSB和HPRT1的Ct值与细胞数目相关曲线；A为GUSB的Ct值与细胞数目相关曲线，横坐标为log(细胞数目)，纵坐标为Ct值；B为HPRT1的Ct值与细胞数目相关曲线，横坐标为log(细胞数目)，纵坐标为Ct值；

图7：荧光素酶小动物成像和循环肿瘤细胞定量检测；A图为三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231荷瘤小鼠的活体成像图；B图为HPRT1基因实时定量PCR检测结果，纵坐标为循环肿瘤细胞数，横坐标b1为未转移组，b2为肺转移组。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

引物的设计：

1)选择高效稳定表达的人源基因，拷贝GUSB(NM_000181)和HPRT1(NM_000194)参考基因的cDNA序列；

2)选择扩增子长度为70-150bp，引物长度为18-25bp，Tm值为59℃±5℃；探针长度为20-27bp，Tm值为引物Tm值+10℃±5℃的候选引物和探针；

3)将候选引物和探针进行序列特异性比对，确定候选引物和探针(表1)。

表1.引物和探针序列

引物浓度优化：

20μL的反应体系，2×Taqman Universal Master Mix II为10μL；探针浓度为250nM；模板浓度为100ng；将GUSB和HPRT1基因引物(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5)的上、下游浓度分别设定：100nM，200nM，400nM，800nM，进行正交实验进行引物浓度优化；由扩增曲线可以发现上下游引物浓度至少为400nM时，获得的Ct值最小，ΔRn最大。因此，上下游引物浓度400nM为最优引物对(图1、图3)。

探针浓度优化：

20μL的反应体系，2×Taqman Universal Master Mix II为10μL，游引物终浓度400nM；模板浓度为100ng；将GUSB和HPRT1基因探针(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6)的浓度设定为50nM，100nM，150nM，200nM，250nM，在引物浓度和模板量一定的情况下，评价在不同探针浓度情况下ΔRn的变化。如图2、图4所示：在200nM探针浓度下，获得最大的ΔRn和最小的Ct值，为最优探针浓度。

实施例2

试剂盒的建立：

一种用于检测人源循环肿瘤细胞的试剂盒，主要包括：

1)逆转录引物：Oligo(dT)₂₀；

2)特异性引物：PF1：CGGTCTGTACTTCTGTAC(SEQ ID NO.1)，PR1：GACAGAGATCTGGTAATTCA(SEQ ID NO.2)；PF2：AGCCTAAGATGAGAGTTC(SEQ ID NO.4)，PR2：CACAGAACTAGAACATTGATA(SEQ ID NO.5)；

3)特异性探针：P1：CACTGTCTTGCTCCACGCTG(SEQ ID NO.3)，序列5’端修饰有FAM荧光基团，3’端修饰有NFQ-MGB；P2：ATCTGGAGTCCTATTGACATCGCC(SEQ ID NO.6)，序列5’端修饰有VIC荧光基团，3’端修饰有NFQ-MGB；

4)逆转录反应液：包括RNA逆转录酶、10×缓冲液、DTT、dNTPs、RNaseOUTRecombinant RNase Inhibitor、RNase H；

5)qPCR反应液：AmpliTaq Gold DNA聚合酶、dUTP、dNTPs、ROX荧光对照、PCR反应缓冲液。

实施例3

1)RNA的提取、DNA的消化：

根据样本性质，使用相应的RNA提取试剂盒进行样本RNA提取，并进行基因组消除，取1μL进行核酸定量，5μL进行核酸电泳鉴定，使用DEPC水将提取的RNA稀释至10-100ng/μL备用。

2)cDNA的制备：

将提取的样本RNA按照如下体系分别配置反应液：

3)实时定量RT-PCR反应：

分别使用上述设计的GUSB、HPRT1引物和探针，对制备的人源肿瘤细胞MDA-MB-231，SK-BR-3，SMMC-7721，Hep G2，HT-29，Caco-2，A549，NCI-H2227和鼠源细胞RAW 264.3，MEL，L7912 cDNA进行实时定量PCR检测，步骤如下：

鼠源细胞RAW264.3，MEL，L7912使用GUSB、HPRT1引物进行实时定量PCR检测后无扩增，而人源肿瘤细胞出现明显的扩增曲线(图5)。证明本申请设计的GUSB、HPRT1实时定量PCR检测方法可在鼠源细胞中区分出人源肿瘤细胞；检测灵敏度可达单细胞(表2)。

表2.不同数量的人源肿瘤细胞中GUSB和HRPT1基因转录水平

实施例4：循环肿瘤细胞实时定量RT-PCR方法在肿瘤新抗原疫苗荷瘤小鼠筛选中的应用

1)CDX荷瘤转移小鼠模型的建立：

6周龄SCID(重度免疫缺陷小鼠，购自维通利华公司)雌鼠，15只，备用。胰蛋白酶消化表达荧光素酶基因MDA-MB-231(购自北京协和细胞资源中心)细胞5×10⁶，重悬在50μLPBS中，皮下接种于SCID小鼠腹部脂肪垫。

肿瘤细胞接种10周后，按150mg/kg体重的量腹腔注射荧光素Luciferin，5min后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉(50mg/kg)，使用活体成像系统观察肿瘤的荧光强度和转移情况。

2)细胞总RNA的制备：

小鼠心脏采血100μL，加入0.9ml PBS并混匀。取0.125ml Dynabeads CD45，加入到上述离心管中，用HulaMixer样品混匀仪室温上下颠倒混匀30min。取10ml新离心管，加入0.5ml细胞分离液Ficoll-Paque Plus(购自GE Healthcare公司)于管底，小心将上述血样全部转移到分离液液面上面，350g离心5min。将上层液体全部转移到2ml离心管中，650g离心5min，吸弃上清后迅速加入1ml TRIzol试剂，室温裂解5min后，12000g离心5min，取上清。加200μL氯仿，涡旋30秒，室温放置3分钟；4℃12000g离心15min，取上层水相，加500μL冰异丙醇混匀；室温下放置10min后，4℃12000g离心10min，弃掉上清；加1ml 75％乙醇涡旋混匀，4℃7500g离心5min，弃掉上清；将沉淀的RNA室温干燥10至15min(不可完全干燥)，用无RNase、DNase极纯水溶解，置于58℃恒温金属浴15min。取1μL用NanoDrop 2000进行核酸定量。

3)基因组消化：

将上述提取的样本RNA按照如下体系分别配置反应液：

4)cDNA的制备：

同实施例3。

5)实时定量RT-PCR反应：

同实施例3。

15只三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231接种的荷瘤小鼠，在接种肿瘤细胞10周，通过小动物活体成像系统进行观察，发现有8只小鼠有明显的肺转移，而7只未有明显的肺转移(图7A)。抽取每只小鼠的血后，通过HPRT1基因实时定量PCR检测，

根据不同数目的MDA-MB-231细胞与GUSB和HPRT1的Ct值之间的关系，建立标准曲线(图5、6)，基于上述标准曲线，通过实时定量PCR检测的Ct值，计算每微升血中循环肿瘤细胞的数目，结果如图7B所示，未转移组循环肿瘤细胞数与肺转移组差异明显。结果表明，我们建立的基于GUSB和HPRT1基因的实时定量PCR方法可以用于人源肿瘤接种小鼠是否发生转移的筛选和评价，保证用于评价肿瘤新抗原预测软件预测效率的小鼠状况的一致性。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 哈尔滨吉象隆生物技术有限公司

<120> 一种在筛选新生抗原疫苗或药物时评价动物模型的方法及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA