阅读说明：本技术 通过分子标志物辨识激素性股骨头坏死的中医证型的系统 (System for identifying traditional Chinese medicine syndrome type of hormonal femoral head necrosis through molecular marker ) 是由 陈卫衡 林娜 张彦琼 王荣田 李泰贤 于 2019-02-03 设计创作，主要内容包括：本公开涉及一种通过分子标志物辨识激素性股骨头坏死的中医证型的系统,其中,所述分子标志物包括CD28、CD4、PLCG1、PRKCA、PTGS2、SOS2、STAT6、TLR4、IFIT1、IRF7、ISG15、MAPK14和RHOU。本公开可以应用于通过检测分子标志物的表达量对激素性股骨头坏死的不同中医证型进行区分,并协助作出较早期诊断,为指导临床诊疗提供有效依据。(The present disclosure relates to a system for identifying traditional Chinese medicine evidence of hormonal femoral head necrosis by molecular markers, wherein the molecular markers include CD28, CD4, PLCG1, PRKCA, PTGS2, SOS2, STAT6, TLR4, IFIT1, IRF7, ISG15, MAPK14 and RHOU. The method can be applied to distinguishing different traditional Chinese medicine syndrome types of the hormonal femoral head necrosis by detecting the expression quantity of the molecular marker, assist in making early diagnosis and provide an effective basis for guiding clinical diagnosis and treatment.)

通过分子标志物辨识激素性股骨头坏死的中医证型的系统

技术领域

本公开涉及临床检测技术领域，具体地，涉及一种通过分子标志物辨识激素性股骨头坏死的中医证型的系统。

背景技术

股骨头坏死(Osteonecrosis of the Femoral Head,ONFH)作为骨伤科的一种常见病，目前我国的发病人数已超一千万人，每年新增患者为15～30万。根究病因不同股骨头坏死可分为创伤性股骨头坏死与非创伤性股骨头坏死(Nontraumatic Osteonecrosis ofthe Femoral Head,NONFH)，前者多因股骨颈骨折、股骨头脱位等外伤因素引起，后者多因接受糖皮质激素类药物治疗，嗜酒等原因引起。

激素性股骨头坏死(Steroid-induced osteonecrosis of the femoral head,SONFH)是长时间使用激素而引起的一种非创伤性股骨头坏死，其发病率目前已超过了外伤所致的股骨头坏死。

目前诊断股骨头坏死最有效的方法为MRI检查，早期诊断率达到90％以上，然而确诊后却很难阻止坏死进一步发展。因此针对SONFH高危人群，预测骨坏死出现并提前做出预防，显得尤为重要。

发明内容

本公开的目的是提供一种涉及分子标志物在辨识激素性股骨头坏死的中医证型中的用途和通过分子标志物辨识激素性股骨头坏死的中医证型的试剂盒和系统。

为了实现上述目的，本公开第一方面：提供一种辨识激素性股骨头坏死的中医证型的系统，该系统包括计算装置、用于输入激素性股骨头坏死患者个体的分子标志物的表达量的输入装置和用于输出激素性股骨头坏死的中医证型的输出装置；其中，所述分子标志物包括CD28、CD4、PLCG1、PRKCA、PTGS2、SOS2、STAT6、TLR4、IFIT1、IRF7、ISG15、MAPK14和RHOU，所述激素性股骨头坏死的中医证型包括痰瘀阻络证、经脉痹阻证和肝肾亏虚证；所述计算装置包括存储器和处理器；所述存储器中存储有计算机程序，以实现建模算法和如式(1)、式(2)以及式(3)所示的判别函数的算法；所述建模算法为最小偏二乘算法；

F(c-1)＝sgn[f₁(c₁)+f₂(c₂)+f₃(c₃)+f₄(c₄)-b₁]式(1)，

F(c-2)＝sgn[f₅(c₅)+f₆(c₆)+f₇(c₇)+f₈(c₈)-b₂]式(2)，

F(c-3)＝sgn[f₉(c₉)+f₁₀(c₁₀)+f₁₁(c₁₁)+f₁₂(c₁₂)+f₁₃(c₁₃)-b₃]式(3)，

其，F(c-1)表示痰瘀阻络证诊断结果，F(c-1)返回值为1表示痰瘀阻络证成立，返回值为-1时表示痰瘀阻络证不成立；F(c-2)表示经脉痹阻证诊断结果，F(c-2)返回值为1表示经脉痹阻证成立，返回值为-1时表示经脉痹阻证不成立；F(c-3)表示肝肾亏虚证诊断结果，F(c-3)返回值为1表示肝肾亏虚证成立，返回值为-1时表示肝肾亏虚证不成立；c₁～c₁₃依次分别表示CD28、CD4、PLCG1、PRKCA、PTGS2、SOS2、STAT6、TLR4、IFIT1、IRF7、ISG15、MAPK14和RHOU的相对表达量；所述相对表达量是指相对于内参的表达量比值；f₁(c₁)～f₁₃(c₁₃)分别为依据所述建模算法训练得到的核函数，b₁～b₃为依据所述建模算法训练得到的临界打分值。

可选地，该系统还包括分子标志物的表达量的检测装置；所述检测装置包括分子标志物表达量检测芯片和芯片信号读取器，分子标志物表达量检测芯片包括分别检测CD28、CD4、PLCG1、PRKCA、PTGS2、SOS2、STAT6、TLR4、IFIT1、IRF7、ISG15、MAPK14和RHOU的表达量的探针。

可选地，所述分子标志物表达量检测芯片还包括内参探针，所述内参探针为检测GAPDH或β-Actin的表达量的探针。

可选地，所述检测装置包括实时定量PCR仪和分子标志物的实时定量PCR引物，所述分子标志物的实时定量PCR引物包括分别检测CD28、CD4、PLCG1、PRKCA、PTGS2、SOS2、STAT6、TLR4、IFIT1、IRF7、ISG15、MAPK14和RHOU的表达量的实时定量PCR引物。

可选地，所述分子标志物的实时定量PCR引物还包括内参引物，所述内参引物为检测GAPDH或β-Actin的实时定量PCR引物。

可选地，所述内参为GAPDH，f₁(c₁)＝-0.6986×c₁，f₂(c₂)＝-0.6991×c₂，f₃(c₃)＝-0.1527×c₃，f₄(c₄)＝-0.1148×c₄，f₅(c₅)＝0.7766×c₅，f₆(c₆)＝0.41×c₆，f₇(c₇)＝-0.4784×c₇，f₈(c₈)＝-0.1515×c₈，f₉(c₉)＝0.5584×c₉，f₁₀(c₁₀)＝0.4779×c₁₀，f₁₁(c₁₁)＝0.433×c₁₁，f₁₂(c₁₂)＝0.3835×c₁₂，f₁₃(c₁₃)＝0.3539×c₁₃，b₁＝0.226，b₂＝0.0246，b₃＝0.1587；或者，

所述内参为β-Actin，f₁(c₁)＝-0.6192×c₁，f₂(c₂)＝-0.7702×c₂，f₃(c₃)＝0.1533×c₃，f₄(c₄)＝0.7519×c₄，f₅(c₅)＝0.5037×c₅，f₆(c₆)＝0.4773×c₆，f₇(c₇)＝-0.7201×c₇，f₈(c₈)＝-0.6149×c₈，f₉(c₉)＝0.554×c₉，f₁₀(c₁₀)＝0.4149×c₁₀，f₁₁(c₁₁)＝0.4048×c₁₁，f₁₂(c₁₂)＝0.5222×c₁₂，f₁₃(c₁₃)＝0.2906×c₁₃，b₁＝0.0091，b₂＝0.0218，b₃＝0.0547。

本公开第二方面：提供一种定量检测分子标志物的试剂在制备用于辨识激素性股骨头坏死的中医证型的产品中的用途，其中，所述分子标志物包括CD28、CD4、PLCG1、PRKCA、PTGS2、SOS2、STAT6、TLR4、IFIT1、IRF7、ISG15、MAPK14和RHOU。

可选地，定量检测分子标志物是通过以下步骤进行的：

1)获得激素性股骨头坏死患者的血清样本；

2)确定所述血清样本中分子标志物的表达量。

本公开第三方面：提供一种用于辨识激素性股骨头坏死的中医证型的试剂盒，其中，所述试剂盒包括定量检测分子标志物的试剂，所述分子标志物包括CD28、CD4、PLCG1、PRKCA、PTGS2、SOS2、STAT6、TLR4、IFIT1、IRF7、ISG15、MAPK14和RHOU。

本公开第四方面：提供一种用于辨识激素性股骨头坏死的中医证型的分子标志物组合，其中，该分子标志物组合包括CD28、CD4、PLCG1、PRKCA、PTGS2、SOS2、STAT6、TLR4、IFIT1、IRF7、ISG15、MAPK14和RHOU。

通过上述技术方案，本公开可以应用于通过检测分子标志物的表达量对激素性股骨头坏死的不同中医证型进行区分，协助作出较早期诊断，为指导临床诊疗提供有效依据。

本公开的其他特征和优点将在随后的

具体实施方式

部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1是实施例中采用本公开的分子标志物诊断激素性股骨头坏死(痰瘀阻络证)得到的ROC曲线图。

图2是实施例中采用本公开的分子标志物诊断激素性股骨头坏死(经脉痹阻证)得到的ROC曲线图。

图3是实施例中采用本公开的分子标志物诊断激素性股骨头坏死(肝肾亏虚证)得到的ROC曲线图。

具体实施方式

以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开第一方面：提供一种辨识激素性股骨头坏死的中医证型的系统，该系统包括计算装置、用于输入激素性股骨头坏死患者个体的分子标志物的表达量的输入装置和用于输出激素性股骨头坏死的中医证型的输出装置；其中，所述分子标志物包括CD28、CD4、PLCG1、PRKCA、PTGS2、SOS2、STAT6、TLR4、IFIT1、IRF7、ISG15、MAPK14和RHOU，所述激素性股骨头坏死的中医证型包括痰瘀阻络证、经脉痹阻证和肝肾亏虚证；所述计算装置包括存储器和处理器；所述存储器中存储有计算机程序，以实现建模算法和如式(1)、式(2)以及式(3)所示的判别函数的算法；所述建模算法为最小偏二乘算法；

F(c-1)＝sgn[f₁(c₁)+f₂(c₂)+f₃(c₃)+f₄(c₄)-b₁]式(1)，

F(c-2)＝sgn[f₅(c₅)+f₆(c₆)+f₇(c₇)+f₈(c₈)-b₂]式(2)，

F(c-3)＝sgn[f₉(c₉)+f₁₀(c₁₀)+f₁₁(c₁₁)+f₁₂(c₁₂)+f₁₃(c₁₃)-b₃]式(3)，

其，F(c-1)表示痰瘀阻络证诊断结果，F(c-1)返回值为1表示痰瘀阻络证成立，返回值为-1时表示痰瘀阻络证不成立；F(c-2)表示经脉痹阻证诊断结果，F(c-2)返回值为1表示经脉痹阻证成立，返回值为-1时表示经脉痹阻证不成立；F(c-3)表示肝肾亏虚证诊断结果，F(c-3)返回值为1表示肝肾亏虚证成立，返回值为-1时表示肝肾亏虚证不成立；c₁～c₁₃依次分别表示CD28、CD4、PLCG1、PRKCA、PTGS2、SOS2、STAT6、TLR4、IFIT1、IRF7、ISG15、MAPK14和RHOU的相对表达量；所述相对表达量是指相对于内参的表达量比值；f₁(c₁)～f₁₃(c₁₃)分别为依据所述建模算法训练得到的核函数，b₁～b₃为依据所述建模算法训练得到的临界打分值。

根据本公开，根据《北京地区中医常见病证诊疗常规》和文献“陈卫衡,刘道兵,张洪美,等.股骨头坏死的三期四型辨证思路[J].中国中医基础，医学杂志,2003,9(12):51-52”中公开的股骨头坏死的“三期四型”辨证思路，可以将激素性股骨头坏死(SONFH)按早期(痰瘀阻络证)、中期(经脉痹阻证)、晚期(肝肾亏虚证)进行三期分型。痰瘀阻络证是指疾病早期骨破坏为主的病理过程；经脉痹阻证为疾病中期，病人疼痛加重、功能受限；肝肾亏虚证是指疾病后期坏死骨修复的病理过程。根据“三期四型”辨证思路治疗股骨头坏死具有良好的临床疗效。

根据本公开，CD28在NCBI数据库中的参考编号为940；CD4在NCBI数据库中的参考编号为920；PLCG1在NCBI数据库中的参考编号为5335；PRKCA在NCBI数据库中的参考编号为5578；PTGS2在NCBI数据库中的参考编号为5743；SOS2在NCBI数据库中的参考编号为6655；STAT6在NCBI数据库中的参考编号为6778；TLR4在NCBI数据库中的参考编号为7099；IFIT1在NCBI数据库中的参考编号为3434；IRF7在NCBI数据库中的参考编号为3665；ISG15在NCBI数据库中的参考编号为9636；MAPK14在NCBI数据库中的参考编号为1432；RHOU在NCBI数据库中的参考编号为58480。

根据本公开，该系统还可以包括分子标志物的表达量的检测装置。所述检测装置包括分子标志物表达量检测芯片和芯片信号读取器，分子标志物表达量检测芯片包括分别检测CD28、CD4、PLCG1、PRKCA、PTGS2、SOS2、STAT6、TLR4、IFIT1、IRF7、ISG15、MAPK14和RHOU的表达量的探针。或者所述检测装置包括实时定量PCR仪和分子标志物的实时定量PCR引物，所述分子标志物的实时定量PCR引物包括分别检测CD28、CD4、PLCG1、PRKCA、PTGS2、SOS2、STAT6、TLR4、IFIT1、IRF7、ISG15、MAPK14和RHOU的表达量的实时定量PCR引物。

根据本公开，所述分子标志物表达量检测芯片还包括内参探针，所述内参探针为检测GAPDH或β-Actin的表达量的探针。所述分子标志物的实时定量PCR引物还包括内参引物，所述内参引物为检测GAPDH或β-Actin的实时定量PCR引物。

根据本公开，当所述内参为GAPDH时，作为训练得到的一组参考值，f₁(c₁)＝-0.6986×c₁，f₂(c₂)＝-0.6991×c₂，f₃(c₃)＝-0.1527×c₃，f₄(c₄)＝-0.1148×c₄，f₅(c₅)＝0.7766×c₅，f₆(c₆)＝0.41×c₆，f₇(c₇)＝-0.4784×c₇，f₈(c₈)＝-0.1515×c₈，f₉(c₉)＝0.5584×c₉，f₁₀(c₁₀)＝0.4779×c₁₀，f₁₁(c₁₁)＝0.433×c₁₁，f₁₂(c₁₂)＝0.3835×c₁₂，f₁₃(c₁₃)＝0.3539×c₁₃，b₁＝0.226，b₂＝0.0246，b₃＝0.1587；也就是说，判别函数可以简化为如式(4)～(6)所示：

F(c-1)＝sgn[-0.6986×c₁-0.6991×c₂-0.1527×c₃-0.1148×c₄-0.226]式(4)，

F(c-2)＝sgn[0.7766×c₅+0.41×c₆-0.4784×c₇-0.1515×c₈-0.0246]式(5)，

F(c-3)＝sgn[0.5584×c₉+0.4779×c₁₀+0.433×c₁₁+0.3835×c₁₂+0.3539×c₁₃-0.1587]式(6)。

或者，当所述内参为β-Actin时，作为训练得到的一组参考值，f₁(c₁)＝-0.6192×c₁，f₂(c₂)＝-0.7702×c₂，f₃(c₃)＝0.1533×c₃，f₄(c₄)＝0.7519×c₄，f₅(c₅)＝0.5037×c₅，f₆(c₆)＝0.4773×c₆，f₇(c₇)＝-0.7201×c₇，f₈(c₈)＝-0.6149×c₈，f₉(c₉)＝0.554×c₉，f₁₀(c₁₀)＝0.4149×c₁₀，f₁₁(c₁₁)＝0.4048×c₁₁，f₁₂(c₁₂)＝0.5222×c₁₂，f₁₃(c₁₃)＝0.2906×c₁₃，b₁＝0.0091，b₂＝0.0218，b₃＝0.0547；也就是说，判别函数可以简化为如式(7)～(9)所示：

F(c-1)＝sgn[-0.6192×c₁-0.7702×c₂+0.1533×c₃₃+0.7519×c₄-0.0091]式(7)，

F(c-2)＝sgn[0.5037×c₅+0.4773×c₆-0.7201×c₇-0.6149×c₈-0.0218]式(8)，

F(c-3)＝sgn[0.554×c₉+0.4149×c₁₀+0.4048×c₁₁+0.5222×c₁₂+0.2906×c₁₃-0.0547]式(9)。

需要说明的是，f₁(c₁)～f₁₃(c₁₃)和b可能会随着分子标志物的表达量的检测手段的偏性而发生改变，也可能会随着训练数据集的数据规模大小等因素发生改变。式(4)～(9)所示的判别函数是本公开的发明人依据实施例中的数据以最小偏二乘的建模算法进行训练得到的，并不限制本公开的范围。

本公开第二方面：提供一种定量检测分子标志物的试剂在制备用于辨识激素性股骨头坏死的中医证型的产品中的用途，其中，所述分子标志物包括CD28、CD4、PLCG1、PRKCA、PTGS2、SOS2、STAT6、TLR4、IFIT1、IRF7、ISG15、MAPK14和RHOU。

根据本公开，所述CD28、CD4、PLCG1和PRKCA为辨识痰瘀阻络证激素性股骨头坏死患者的分子标志物。

根据本公开，所述PTGS2、SOS2、STAT6和TLR4为辨识经脉痹阻证激素性股骨头坏死患者的分子标志物。

根据本公开，所述IFIT1、IRF7、ISG15、MAPK14和RHOU为辨识肝肾亏虚证激素性股骨头坏死患者的分子标志物。

进一步地，定量检测分子标志物是通过以下步骤进行的：

1)获得激素性股骨头坏死患者的血清样本；

2)确定所述血清样本中分子标志物的表达量。

其中，步骤2)的方法可以为qPCR方法。

本公开所提供的系统和用途可以应用于通过检测分子标志物的表达量对激素性股骨头坏死的不同中医证型进行区分，协助作出较早期诊断，诊断结果准确率高、稳定性好，为指导临床诊疗提供有效依据，也为激素性股骨头坏死辨证分型的科学内涵提供了客观依据。

本公开第三方面：提供一种用于辨识激素性股骨头坏死的中医证型的试剂盒，其中，所述试剂盒包括定量检测分子标志物的试剂，所述分子标志物包括CD28、CD4、PLCG1、PRKCA、PTGS2、SOS2、STAT6、TLR4、IFIT1、IRF7、ISG15、MAPK14和RHOU。

进一步地，所述试剂可以为qPCR试剂。

本公开第四方面：提供一种用于辨识激素性股骨头坏死的中医证型的分子标志物组合，其中，该分子标志物组合包括CD28、CD4、PLCG1、PRKCA、PTGS2、SOS2、STAT6、TLR4、IFIT1、IRF7、ISG15、MAPK14和RHOU。

其中，CD28、CD4、PLCG1和PRKCA可以用于判定痰瘀阻络证；

PTGS2、SOS2、STAT6和TLR4可以用于判定经脉痹阻证；

IFIT1、IRF7、ISG15、MAPK14和RHOU可以用于判定肝肾亏虚证。

本公开所提供的试剂盒以及分子标志物组合可以应用于通过检测分子标志物的表达量对激素性股骨头坏死的不同中医证型进行区分，协助作出较早期诊断，诊断结果准确率高、稳定性好，为指导临床诊疗提供有效依据，也为激素性股骨头坏死辨证分型的科学内涵提供了客观依据。

以下对通过实施例对本公开进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

实施例中，采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料用均数±标准差表示。计数资料两组间比较采用χ2检验，计量资料两组间比较采用t检验，ROC曲线用于分析分子标志物的诊断效能，预测准确性通过ROC曲线下面积进行计算，p<0.05为差异有统计学意义。

实施例

本实施例用于说明本公开的生物标志物的发现以及预测模型的建立和验证。

收集2014年1月至2017年10月于中国中医科学院望京医院与郑州中医骨伤病医院诊断为SONFH的患者60例(包括痰瘀阻络证组、经脉痹阻证组、肝肾亏虚证组各20例)作为疾病组；同时收集于中国医学科学院血液病医院接受激素治疗未发生股骨头坏死患者20例为对照组。将80例患者随机分为训练集(n＝40，痰瘀阻络证、经脉痹阻证、肝肾亏虚证、对照组各10例)和验证集(n＝40，疾病组与对照组分组同验证集)。

股骨头坏死的诊断参照文献“Mont MA,Hungerford DS.Non-traumaticavascular necrosis of the femoral head[J]J Bone Joint Surg(Am),1995,77(3):459-474.”提出的诊断标准，辨证标准参考《北京地区中医常见病证诊疗常规》和文献“陈卫衡,刘道兵,张洪美,等.股骨头坏死的三期四型辨证思路[J].中国中医基础，医学杂志,2003,9(12):51-52”中公开的股骨头坏死的“三期四型”辨证思路。

纳入标准：符合非创伤性股骨头坏死诊断标准的患者；接受激素治疗随访1年未发生股骨头坏死患者。排除标准：原发病病情严重，需其它治疗替代激素治疗者。

按DME要求设计调查表，调查年龄、性别、身高、体重、病程、使用激素时间、临床表现与体征、原发病病史。

训练集与验证集患者性别、体重指数、年龄、使用激素时间等一般临床资料比较见表1，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

表1

训练集与验证集患者均于治疗前清晨空腹抽取静脉血2.5ml入PAXgene BloodRNA Tubes中，上下颠倒混匀后，放一20℃冰箱保存。

血清：用促凝剂加分离胶试管抽取，3500r/m离心10min分离血清后-80℃保存，备用。

对RNA的提取与质检、芯片检测委托上海伯豪生物技术有限公司完成。

采用GeneChip Scanner 3000图像分析软件与用Command Console Software 4.0(美国Affymetrix公司)对芯片进行扫描并读取原始数据，采用微阵列显著性分析软件(Significance Analysis of Microarrays，SAM)筛选出SONFH不同证型与对照组之间有统计学意义的基因。根据FDR(False Discovery Rate)值来鉴定这些基因的百分率范围。

基于不同中医证型与对照组样本相比的差异基因的相互作用信息，建立其相互作用网络，并计算网络节点的拓扑特征值包括节点连接度(即网络中某一节点i与其他节点的相互作用数)，节点介度(即所有的节点对之间通过某一节点i的最短路径条数)、节点紧密度(即是网络图中某一节点i的中心性度量，即节点i到其它可达节点的平均距离)。

具体地，训练集疾病组(痰瘀阻络证、经脉痹阻证、肝肾亏虚证)与对照组之间，以及疾病组三种证型之间的具有显著差异表达特征的基因数汇总(筛选标准：foldchange大于1.5，P值小于0.05)见表2。

表2

组别	差异表达基因总数	上调表达基因数	下调表达基因数
				痰瘀阻络证vs对照组	3044	1864	1180
经脉痹阻证vs对照组	5290	3382	1908
				肝肾亏虚证vs对照组	5212	3400	1812
经脉痹阻证vs痰瘀阻络证	195	36	159
				肝肾亏虚证vs痰瘀阻络证	521	273	248
肝肾亏虚证vs经脉痹阻证	208	121	87

对各组间差异表达标志物所参与的生物学反应和通路信息进行富集分析可以发现，与对照组相比，检测痰瘀阻络证的分子标志物主要具有蛋白激酶活性，且参与Osteoclast differentiation,HIF-1signaling pathway,NF-kappa B signalingpathway,Apoptosis,Hematopoietic cell lineage,TNF signaling pathway,Estrogensignaling pathway,Notch signaling pathway,Platelet activation等通路；与对照组相比，检测经脉痹阻证的分子标志物主要具有核苷酸结合活性和激素应激反应活性，且参与Platelet activation,Inositol phosphate metabolism,Metabolism of xenobioticsby cytochrome P450,NF-kappa B signaling pathway,HIF-1signaling pathway,FoxOsignaling pathway,Apoptosis,Notch signaling pathway,Osteoclastdifferentiation,Hematopoietic cell lineage,TNF signaling pathway,Leukocytetransendothelial migration,Estrogen signaling pathway,Thyroid hormonesignaling pathway等通路；与对照组相比，检测肝肾亏虚证的分子标志物主要具有水解酶活性和脂质转运体活性，且参与Chondroitin sulfate metabolic process,Chondroitinsulfate biosynthetic process,Osteoclast differentiation,Lipoproteintransport,Amyloid precursor protein metabolic process,Amyloid precursorprotein biosynthetic process,Amyloid precursor protein catabolic process,Regulation of myeloid cell differentiation,Regulation of lipidcatabolicprocess,Podosome assembly等通路。与痰瘀阻络证相比，检测经脉痹阻证的分子标志物主要参与免疫系统调节，与多种免疫系统疾病相关；与痰瘀阻络证相比，检测肝肾亏虚证的分子标志物主要参与血小板脱粒(plateletdegranulation)和成骨过程的调节(regulation of ossification)；与肝肾亏虚证相比，检测经脉痹阻证的分子标志物主要参与炎症反应(inflammatoryresponse)和脂肪酸代谢(fatty acid binding)。

针对上述各证型差异表达基因，建立各证型相关基因互作网络，通过网络计算，筛选各证型候选标志基因。以痰瘀阻络证为例：(1)利用痰瘀阻络证组VS.对照组的1908个差异基因建立其相互作用网络，包含1247个节点和5833对相互作用。(2)通过筛选连接度(Degree)大于网络连接度平均值的节点作为hub节点，获得340hub基因。(3)建立上述hub基因的直接相互作用网络，包含340个节点和3261对相互作用。(4)通过计算上述hub基因网络的节点拓扑特征值(Degree，Closeness，Betweenness，Coreness)，筛选出101关键hubs，并从中去除“经脉痹阻VS.对照组”“肝肾亏虚VS.对照组”差异基因，同时选取与“痰瘀阻络VS.经脉痹阻”和“痰瘀阻络VS.肝肾亏虚”差异基因的交集，最终得到4个痰瘀阻络证候选标志物(CD28，CD4，PLCG1，PRKCA)。同理，分别得到4个经脉痹阻证候选标志物(PTGS2，SOS2，STAT6，TLR4)和5个肝肾亏虚证候选标志物(IFIT1，IRF7，ISG15，MAPK14.RHOU)。

基于上述三种不同证型的分子标志物在SONFH患者外周血中的表达量信息，采用偏最小二乘法建立痰瘀阻络证、经脉痹阻证和肝肾亏虚证三种不同证型的辨证模型，计算各候选分子标志物在模型中的权重值及模型得分卡值。该模型如式(1)、式(2)以及式(3)所示。

F(c-1)＝sgn[f₁(c₁)+f₂(c₂)+f₃(c₃)+f₄(c₄)-b₁]式(1)，

F(c-2)＝sgn[f₅(c₅)+f₆(c₆)+f₇(c₇)+f₈(c₈)-b₂]式(2)，

F(c-3)＝sgn[f₉(c₉)+f₁₀(c₁₀)+f₁₁(c₁₁)+f₁₂(c₁₂)+f₁₃(c₁₃)-b₃]式(3)。

其中，F(c-1)表示痰瘀阻络证诊断结果，F(c-1)返回值为1表示痰瘀阻络证成立，返回值为-1时表示痰瘀阻络证不成立；F(c-2)表示经脉痹阻证诊断结果，F(c-2)返回值为1表示经脉痹阻证成立，返回值为-1时表示经脉痹阻证不成立；F(c-3)表示肝肾亏虚证诊断结果，F(c-3)返回值为1表示肝肾亏虚证成立，返回值为-1时表示肝肾亏虚证不成立；c₁～c₁₃依次分别表示CD28、CD4、PLCG1、PRKCA、PTGS2、SOS2、STAT6、TLR4、IFIT1、IRF7、ISG15、MAPK14和RHOU的相对表达量；所述相对表达量是指相对于内参的表达量比值；f₁(c₁)～f₁₃(c₁₃)分别为依据所述建模算法训练得到的核函数，b₁～b₃为依据所述建模算法训练得到的临界打分值。

基于上述各证型的候选标志标志物在各组SONFH患者外周血中的表达量，采用十倍交叉验证，评价指标包括预测准确性(accuracy,ACC)，接受者操作特性曲线(receiveroperating characteristic curve，简称ROC曲线)下面积(area under the curve,AUC)，结果如表3所示。可见，针对经脉痹阻证的分子标志物的检测性能最优，ACC达到80％以上；针对痰瘀阻络证和肝肾亏虚证的分子标志物的ACC分别为72.40％和76.50％；三种证型检测的AUC均大于0.800，表明检测性能良好且稳定。

表3

针对训练集样本，开展qPCR检测。将总RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板行实时定量PCR扩增，同时以β-Actin与GAPDH为参照组。采用Power SYBR Green PCR Master MitKit用ABI 7900HT实时焚光定量PCR仪(美国ABI公司)进行QPCR。反应条件：50℃孵育2min，然后95℃，10min：接着进行40个循环：95℃，15秒；60℃，1min，反应结束后，确认QPCR的扩增曲线和融解曲线

基于独立样本集，采用qPCR法检测CD28、CD4、PLCG1、PRKCA、PTGS2、SOS2、STAT6、TLR4、IFIT1、IRF7、ISG15、MAPK14和RHOU在患者外周血中的表达量(基于GAPDH和β-Actin两个内参，产出两组表达量数据)。经过随机分组，采用独立测试集验证，重复验证100次，三种证型的检测结果见表4，ACC和AUC(图1-3)与十倍交叉验证结果相符。

表4

进而，基于独立样本集的候选标志物表达量，计算三种证型辨证预测模型中各标志物的最优权重值和模型得分的最优卡值。

具体地，当所述内参为GAPDH时，作为训练得到的一组参考值，f₁(c₁)＝-0.6986×c₁，f₂(c₂)＝-0.6991×c₂，f₃(c₃)＝-0.1527×c₃，f₄(c₄)＝-0.1148×c₄，f₅(c₅)＝0.7766×c₅，f₆(c₆)＝0.41×c₆，f₇(c₇)＝-0.4784×c₇，f₈(c₈)＝-0.1515×c₈，f₉(c₉)＝0.5584×c₉，f₁₀(c₁₀)＝0.4779×c₁₀，f₁₁(c₁₁)＝0.433×c₁₁，f₁₂(c₁₂)＝0.3835×c₁₂，f₁₃(c₁₃)＝0.3539×c₁₃，b₁＝0.226，b₂＝0.0246，b₃＝0.1587；也就是说，判别函数可以简化为如式(4)～(6)所示：

F(c-1)＝sgn[-0.6986×c₁-0.6991×c₂-0.1527×c₃-0.1148×c₄-0.226]式(4)，

F(c-2)＝sgn[0.7766×c₅+0.41×c₆-0.4784×c₇-0.1515×c₈-0.0246]式(5)，

F(c-3)＝sgn[0.5584×c₉+0.4779×c₁₀+0.433×c₁₁+0.3835×c₁₂+0.3539×c₁₃-0.1587]式(6)。

或者，当所述内参为β-Actin时，作为训练得到的一组参考值，f₁(c₁)＝-0.6192×c₁，f₂(c₂)＝-0.7702×c₂，f₃(c₃)＝0.1533×c₃，f₄(c₄)＝0.7519×c₄，f₅(c₅)＝0.5037×c₅，f₆(c₆)＝0.4773×c₆，f₇(c₇)＝-0.7201×c₇，f₈(c₈)＝-0.6149×c₈，f₉(c₉)＝0.554×c₉，f₁₀(c₁₀)＝0.4149×c₁₀，f₁₁(c₁₁)＝0.4048×c₁₁，f₁₂(c₁₂)＝0.5222×c₁₂，f₁₃(c₁₃)＝0.2906×c₁₃，b₁＝0.0091，b₂＝0.0218，b₃＝0.0547；也就是说，判别函数可以简化为如式(7)～(9)所示：

F(c-1)＝sgn[-0.6192×c₁-0.7702×c₂+0.1533×c₃₃+0.7519×c₄-0.0091]式(7)，

F(c-2)＝sgn[0.5037×c₅+0.4773×c₆-0.7201×c₇-0.6149×c₈-0.0218]式(8)，

F(c-3)＝sgn[0.554×c₉+0.4149×c₁₀+0.4048×c₁₁+0.5222×c₁₂+0.2906×c₁₃-0.0547]式(9)。

计算上述模型预测准确率和ROC曲线下面积列于表5，结果表明上述3种模型预测性能良好且稳定。

表5

可见，上述分子标志物可以用作辨识激素性股骨头坏死中医证型的分子标志物，且本公开的分子标志物为SONFH辨证分型的科学内涵提供了客观依据。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。