一种与肿瘤细胞对索拉非尼耐药性相关的microRNA及其应用

文档序号：1308666 发布日期：2020-08-11 浏览：6次 >En<

阅读说明：本技术 一种与肿瘤细胞对索拉非尼耐药性相关的microRNA及其应用 (MicroRNA related to sorafenib drug resistance of tumor cells and application thereof ) 是由徐俊杰蔡秀军林中杰季琳岑栋梁霄姜是夏顺杰陶力野于 2020-04-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种与肝细胞性肝癌索拉菲尼耐药相关的microRNA及其应用,本发明选取Huh7和HCC-LM3野生及其索拉非尼耐药细胞系作为研究对象,通过二代测序、验证及优选,获得在索拉非尼耐药细胞中低表达的microRNA-378a-3p通过建立荷瘤小鼠的索拉非尼治疗模型结合qPCR方法,进一步确定了miR-378a-3p的表达量与肿瘤细胞对索拉非尼耐药性程度负相关。利用miR-378a-3p的转录因子LXRα激动剂GW3965对细胞耐药性、IGF1R基因的表达程度以凋亡及的影响,确定了GW3965可以促进miR-378a-3p的转录并抑制IGF1R,逆转肿瘤细胞对索拉非尼的耐药。本发明的提出为肿瘤治疗提供新的靶点,为有效地对抗索拉非尼耐药提供了有效技术手段。(The invention discloses a microRNA related to liver cell liver cancer sorafenib drug resistance and application thereof, wherein the invention selects Huh7 and HCC-LM3 wild and sorafenib drug-resistant cell lines thereof as research objects, obtains the microRNA-378a-3p with low expression in sorafenib drug-resistant cells through second-generation sequencing, verification and optimization, and further determines that the expression quantity of miR-378a-3p is negatively related to the sorafenib drug resistance degree of tumor cells by establishing a sorafenib treatment model of tumor-bearing mice and combining a qPCR method. By utilizing the transcriptional factor LXRalpha agonist GW3965 of miR-378a-3p to resist cell drug resistance and the expression degree and apoptosis influence of IGF1R gene, the GW3965 is determined to promote the transcription of miR-378a-3p, inhibit IGF1R and reverse the drug resistance of tumor cells to sorafenib. The invention provides a new target for tumor treatment and provides an effective technical means for effectively resisting sorafenib drug resistance.)

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体地，本发明涉及抗肿瘤耐药相关的microRNA及其应用。

背景技术

肝癌是我国也是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。全球每年约有50万新增病例，其中肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占85％。我国是乙肝大国，HCC发生率约为 30.1/10万，新发病例数和死亡例数均占全球50％以上。尽管随着肿瘤标志物与影像学检查的推广、外科手术水平和多种新型治疗方式如动脉内化疗栓塞(Transcatheter arterial chemoembolization，TACE)等的发展，HCC的5年生存率有所改善。但总体来说，HCC的预后仍然不尽如人意。外科手术是HCC患者唯一的治愈方式，除此之外，其他治疗方式如 TACE、射频消融(radio-frequency ablation,RFA)、化疗等也有一定疗效。对于无法手术治疗的进展期HCC患者，靶向药物治疗是目前可以选择的一种有效治疗方式。其中，多靶点络氨酸激酶抑制剂索拉非尼(sorafenib)是目前临床上第一个被美国FDA批准在临床上治疗晚期肝癌的靶向药物。既往研究发现，索拉非尼一方面能抑制肿瘤细胞生长，另一方面也能抑制肿瘤血管生成。这为延长晚期肝癌患者的生命提供了希望。但是，由于肿瘤患者的异质性，在临床应用过程中，索拉非尼存在着明显的耐药现象。许多研究表明，索拉非尼仅能延长晚期肝癌患者2-3个月的生存时间。之后，多数患者容易发生索拉非尼耐药。

目前关于索拉非尼的耐药机制并不明确，部分观点认为EGFR、c-JUN、VEGFR等位点存在突变的肿瘤患者可能对索拉非尼容易产生先天耐药。另外一些观点认为，许多与细胞生存息息相关的信号通路关键分子，如：PI3K/AKT、IGF/FGF、NF-κB等可能与索拉非尼的耐药形成相关。同时，自噬、肿瘤微环境改变、表观遗传学等也被认为可能与肝癌索拉非尼耐药相关。但主导机制或者说关键基因仍然是目前困扰肝癌对索拉非尼耐药研究的主要难题。对于索拉非尼耐药的HCC患者，目前缺乏行之有效的治疗方法，如何克服索拉非尼耐药对于改善HCC患者预后有重要意义。

最新研究表明，microRNA的表达差异在肝癌对索拉非尼耐药形成过程中发挥了关键作用。microRNA是其中一类长度只有18～25个核苷酸的单链非编码RNA，由细胞内源产生的发卡结构转录本加工而来，能通过结合特定靶基因mRNA的3’或5’UTR区，直接降解或抑制其翻译，起到转录后调控的作用。比如miR-221能通过结合Caspase-3基因mRNA的3‘UTR区域参与索拉非尼耐药。此外，最新又有文献报道肝癌细胞通过降低miR-122水平，导致下游IGF-1R表达异常，从而促进肝癌细胞对索拉非尼耐药。这些研究均表明，在肝癌对索拉非尼耐药形成过程中，microRNA发挥着重要作用。但是到目前为止，尤其是在肝癌的研究中，还没有文章系统地分析过在人类众多的microRNA当中，哪些是调控耐药性的关键因子，也不清楚如何利用microRNA进行个性化治疗。

因此，本领域迫切需要寻找能够增强肝癌细胞对化疗药物敏感性的方法，并开发相应的治疗药物。

发明内容

本发明的目的就是寻找提高肝癌细胞对抗索拉非尼药物敏感性的关键microRNA并开发相应的治疗药物。

本发明的目的在于针对肿瘤治疗药物索拉非尼在治疗过程中常常产生耐药而导致靶向治疗失败甚至疾病复发的现象，提供了一种作为判断生物体对索拉菲尼耐药性的分子标记 miR-378a-3p，miR-378a-3p在血清中的表达量可反映原位肿瘤中miR-378a-3p相对表达情况， miR-378a-3p在血清中的表达较低时，生物体对索拉非尼的耐药性也较高。同时，本发明也提供了一种利用miR-378a-3p逆转肿瘤细胞对索拉非尼耐药性的药物，具体涉及miR-378a-3p的转录因子的激动剂在制备通过下调IGF1R基因表达进而逆转肿瘤细胞对索拉非尼耐药性的药物中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明选取Huh7和HCC-LM3野生及其索拉非尼耐药细胞系进行microRNA-seq，分析获得在Huh7和HCC-LM3索拉非尼耐药细胞中低表达的miR-378a-3p。然后，将miR-378a-3p mimic 转染耐药细胞后，应用CCK8增殖曲线及IC50分析，Real-time PCR，flowcytometry，Western Blot等技术方法，检测细胞转染前后的生长、耐药、IGF1R基因的表达程度等变化情况，明确干扰miR-378a-3p可否通过抑制IGF1R，逆转肿瘤耐药；随后，利用miR-378a-3p独立的转录因子LXRα的激动剂GW3965在Huh7和HCC-LM3索拉非尼耐药细胞中与索拉非尼联用，检测联合用药的CI值确定两药联用的效果；接下来建立HCC-LM3野生细胞及PDX荷瘤小鼠的索拉非尼治疗模型，检测小鼠在GW3965和索拉非尼联合治疗下，检测肿瘤体积、血清ALT、 Real-time PCR、Immunohistochemistry、明确两药联用是否能提高索拉非尼的抑制作用，逆转肿瘤耐药。

在上述研究的基础上，本发明找到了一种与肿瘤细胞对索拉非尼耐药性相关的microRNA，为miR-378a-3p，所述的miR-378a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，本发明还提出了一种上述microRNA的检测试剂在制备检测肿瘤细胞对索拉非尼耐药性程度的试剂盒中的应用。

其中，优选的，所述的用于检测所述的microRNA的试剂为引物，所述的引物由上游引物和通用引物组成，优选的，所述的上游引物序列如SEQ ID NO.2所示，所述的通用引物序列如 SEQ ID NO.3所示。

其中，miR-378a-3p的表达量与肿瘤细胞对索拉非尼耐药性程度成反比。

更进一步的，本发明还提出了miR-378a-3p的转录因子LXRα的激动剂GW3965在制备逆转肿瘤细胞对索拉非尼耐药性药物中的应用。

其中，优选的，所述的肿瘤细胞为人肝癌Huh7和HCC-LM3细胞。更优选的，所述的肿瘤细胞为人肝癌Huh7和HCC-LM3细胞索拉非尼耐药细胞。

在本发明所述的应用中，所述的药物通过结合IGF1R的3‘UTR区域、抑制翻译，从而达到逆转肿瘤细胞对索拉非尼耐药性的目的。

更进一步的，本发明还提供了一种上述的microRNA的转录因子LXRα激动剂在制备抗肝癌药物中的应用。

其中，所述肝癌为肝细胞性肝癌。

其中，所述抗肝癌药物包括LXRα激动剂和索拉非尼。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

本发明通过建立荷瘤小鼠的索拉非尼治疗模型探究miR-378a-3p作为索拉非尼耐药标志物的可能性；同时通过瞬时干扰miR-378a-3p，探究miR-378a-3p与耐药基因表达之间的关系。从而为寻找新的诊断标志物、揭示新的治疗靶点、更加有效对抗索拉非尼耐药提供科学的依据。

miR-378a-3p在血清中的表达情况能够相对客观的反应其在原位肿瘤中的表达情况，并且当miR-378a-3p在血清中表达相对较低时，生物体对索拉非尼的耐药性也较高。这为通过血液途径的无创诊断判定患者对索拉非尼的耐受程度提供了新的途径，对临床的个性化用药具有重要的意义。同时，针对索拉非尼耐药且IGF1R基因高度表达的恶性肿瘤细胞，使用GW3965 特异性地激动LXRα，能够增加miR-378a-3p表达程度、减少细胞内的IGF1R，抑制PI3K/AKT 通路，从而逆转肿瘤耐药，提高肿瘤治疗的效率。更重要的是，使用这种microRNA激动剂机制，更具有临床转化价值，对于深入了解索拉非尼耐药的本质以及寻找个体化治疗的耐药靶点都有非常积极的意义。

本发明发现的microRNA能够提示患者对索拉非尼治疗的效果，并且通过该microRNA的转录因子的激动剂能够增加索拉非尼的治疗效果，更具有临床转化价值。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明；

图1A为在Huh7野生细胞和Huh7索拉非尼耐药细胞中差异表达的miRNA的热图，图1B为在Huh7野生细胞和Huh7索拉非尼耐药细胞中差异表达的miRNA的火山图；

图2是在三组野生细胞和索拉非尼耐药细胞中5种差异miRNA的验证结果图，A为Huh7细胞的结果图、B为HCC-LM3细胞的结果图，C为SK-Hep-1细胞的结果图；图中，WT表示野生型细胞，SR表示耐药细胞；

图3是Huh7和HCC-LM3耐药细胞株转染miR-378a-3p mimic的效率验证结果图；

图4是CCK8法检测miR-378a-3p干扰前后细胞对药物半数抑制浓度(IC50)结果图，其中， A为Huh7细胞的结果图、B为HCC-LM3细胞的结果图；

图5是CCK8法检测miR-378a-3p干扰前后细胞在6μmol/L索拉非尼作用下的增殖情况结果图，其中，A为Huh7细胞的结果图、B为HCC-LM3细胞的结果图；

图6是过表达miR-378a-3p后对索拉非尼的凋亡作用的影响结果图；

图7是分析寻找miR-378a-3p下游靶点流程图；

图8A是Huh7和HCCLM3索拉非尼耐药细胞中过表达miR-378a-3p导致细胞内IGF1R表达量下降的Western Blotting图；图中，WT表示野生型细胞，SR表示耐药细胞，miR-C表示转染了miR-378a-3p mimic ctrl的耐药细胞，378a-3p表示转染了miR-378a-3p mimic的耐药细胞；B 图为IGF1R-3’UTR荧光报告基因结果图；C图为索拉非尼耐药细胞中野生型IGF1R 3'UTR和突变型IGF1R 3'UTR荧光霉素活性检测结果图；

图9是在各组细胞中miR-378a-3p相对表达量结果图；

图10是在Huh7和HCCLM3索拉非尼耐药细胞中GW3965与索拉非尼联合用药的CI值结果图,A为Huh7索拉非尼耐药细胞结果图，B为HCCLM3索拉非尼耐药细胞结果图；

图11是HCC-LM3肿瘤细胞荷瘤小鼠模型中联合使用GW3965与索拉非尼后在VIS下肿瘤示意图，其中，A为生理盐水组，B为单用GW3965组，C为单用索拉非尼组，D为联合用药组，每组4只；

图12为HCCLM3肿瘤细胞荷瘤小鼠模型中联合使用GW3965与索拉非尼后各组肿瘤体积 (图12A)、血清中ALT含量(图12B)、miR-378a-3p表达量(图12C)、小鼠体重(图12D)图；

图13为各组肿瘤组织IHC结果图；

图14是PDX荷瘤小鼠模型中联合使用GW3965与索拉非尼后各组肿瘤示意图，其中A为肿瘤组织，B为小鼠肝脏；

图15为是PDX荷瘤小鼠模型中联合使用GW3965与索拉非尼后各组肿瘤组织IHC结果图。

具体实施方式

下面通过实验并结合实例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

本实施例所涉及实验材料及试剂：

人肝癌细胞系Huh7、HCC-LM3和SK-Hep-1购自上海细胞库。

索拉非尼、GW3965等试剂均为市售。

实施例1：miR-378a-3p在索拉非尼敏感及耐药细胞中的差异表达

1.在Huh7野生细胞及Huh7索拉非尼耐药细胞中筛选差异表达的microRNA

(1)细胞培养

用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养Huh7野生细胞系，用索拉非尼终浓度为6μmol/L 的培养基培养Huh7索拉非尼耐药细胞系。所有细胞均培养在5％CO₂、37℃细胞培养箱中。

委托上海康成生物工程有限公司对Huh7野生细胞及Huh7索拉非尼耐药细胞系(每种细胞提供三个独立的生物学重复)进行microRNA独立建库，随后进行二代测序。采用基于负二项分布的DESeq2对样本间microRNA的表达情况进行差异表达分析，从差异倍数(Foldchange)和 p-value两个水平进行评估。差异microRNA的筛选条件为：fold change>1.5and p value<0.01。经筛选，共获得5个差异表达的microRNA，microRNA的具体名称、差异表达倍数及相应padj 值如表1所示。以差异表达倍数及相应fold change值为横纵坐标绘制的差异表达环状RNA的火山图如图1所示。

表1在Huh7野生细胞及Huh7索拉非尼耐药细胞中差异表达的microRNA

ID	Foldchange	p-value
			miR-23b-5p	-1.555555556	0.007490434
miR-342-3p	1.835443038	0.00536155
			miR-378a-3p(SEQID NO.1)	-1.61160578	0.00512598
miR-708-3p	-1.824390244	0.003570751
			miR-7977	-1.699999999	0.007762603

2.检测microRNA在Huh7野生细胞及Huh7索拉非尼耐药细胞中的差异表达

将已用药48小时的三组野生和耐药细胞(Huh7野生细胞及Huh7索拉非尼耐药细胞、 HCC-LM3野生细胞及HCC-LM3索拉非尼耐药细胞、SK-Hep-1野生细胞及SK-Hep-1索拉非尼耐药细胞)用胰酶消化处理5分钟，随后用培养基重悬成单细胞悬液，用PBS洗涤3次后，吸干残液，并加入1ml Trizol，反复吹打充分裂解细胞。随后，将Trizol细胞溶液转移到1.5ml Eppendorf管中，加入200μl氯仿，用力颠倒10次混匀，室温静置10分钟后以12000转/分的速度4℃离心15分钟。离心结束后，小心吸取上层无色水相，约400μl，并将其转移至新的1.5ml Eppendorf管中。随后，加入等体积的异丙醇，轻柔地颠倒10次混匀，并在室温静置10分钟。随后，以12000转/分的速度4℃离心10分钟。此时可见管底有白色沉淀。弃去上清后，加入1ml 预冷的75％乙醇(由DEPC水配置)，室温静置10分钟。随后，以12000转/分的速度4℃离心10 分钟。小心吸去上清后，将Eppendorf管开盖放于室温干燥10分钟。随后，每管加入10μl DEPC 水，获得细胞内总RNA。用Nanodrop进行样本RNA浓度的测定。

所得RNA溶液进行浓度测定后，采用All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Reagent Kits试剂盒，按照说明书方法进行逆转录及qPCR，逆转录反应体系如下：

表2逆转录反应体系

组分	体积	质量
			总RNA	/	500ng
2.5U/μl Poly A Polymerase	1μl	/
			RTase Mix	1μl	/
5X PAP/RT Buffer	5μl	/
			dd水	补足至25μl	/

反应条件，37℃60分钟；85℃5分钟；4℃恒定；随后获得cDNA。

获得cDNA后，进行qPCR，qPCR反应体系如下：

表3qPCR反应体系

组分	体积	终浓度
			2X All-in-One qPCR Mix	10μl	1X
miRNA qPCR引物(2μM)	2μl	0.2μM
			通用PCR引物(2μM，SEQ ID NO.3)	2μl	0.2μM
First-strand cDNA(1:5稀释)	2μl
			dd水	4μl
终体积	20μl

每种miRNA所使用的特定引物序列如表4所示：

表4miRNA引物序列

基因	上游引物序列
		microRNA-378a-3p	actggacttggagtcagaaggc(SEQ ID NO.2)
microRNA-342-3p	tctcacacagaaatcgcaccc(SEQ ID NO.4)
		microRNA-23b-5p	tgggttcctggcatgctgat(SEQ ID NO.5)
microRNA-7977	ttcccagccaacgcacca(SEQ ID NO.6)
		microRNA-708-3p	gggcccaactagactgtgagc(SEQ ID NO.7)
5s	gggaataccgggtgctgtaggct(SEQ ID NO.8)

反应条件如表5所示:

表5qPCR反应条件

结果如图2所示，与野生细胞相比，miR-378a-3p在三组耐药细胞中均低表达，依据t检验统计学方法，*P<0.05。表明，通过检测肿瘤细胞中miR-378a-3p的表达可以判断肿瘤细胞对索拉非尼耐药性程度，miR-378a-3p的表达越低，肿瘤细胞对索拉非尼的耐药性程度越高。

据此，本发明还提供了一种检测肿瘤细胞对索拉非尼耐药性程度的试剂盒，该试剂盒中包括microRNA的qPCR检测引物，所述qPCR检测引物的序列如SEQ ID NO.2所示。此外，优选地，试剂盒中还可以包含RNA提取试剂、逆转录试剂等。

实施例2：干扰miR-378a-3p对细胞耐药性的影响

1.Huh7和HCC-LM3耐药细胞株转染miR-378a-3p mimic及验证

(1.1)Huh7和HCC-LM3耐药细胞株转染miR-378a-3p mimic

将处于对数增长期的Huh7和HCC-LM3耐药细胞用胰酶消化处理5分钟，随后用培养基重悬成单细胞悬液，经细胞计数后，以每孔2*10⁵个细胞的密度接种到6孔板，十字交叉法晃匀，放入孵箱中培养使其贴壁。待贴壁后加入预先混合好的购自广州市锐博生物科技有限公司的 miR-378a-3p mimic和ctrl转染试剂(见表6)，8小时后更换10％胎牛血清的DMEM培养基。16 小时后，获得转染miR-378a-3p mimic的Huh7和HCC-LM3耐药细胞。在实验组(转染 miR-378a-3p mimic的耐药细胞)和对照组(转染ctrl的耐药细胞株)中均加入等量索拉非尼，使培养基中索拉非尼终浓度为6μmol/L。加药48小时后，分别提取miR-378a-3p mimic组和ctrl 组的总RNA，并结合q-PCR验证转染效率(primer:5’-ACTGGACTTGGAGTCAGAAGGC -3’(SEQ ID NO.2))，如图3所示，实验组中的miR-378a-3p表达量显著高于对照组，说明获得了转染miR-378a-3p mimic的Huh7和HCC-LM3耐药细胞株并在后续继续进行实验。

表6miR-378a-3p mimic转染试剂配方(6孔板体系)

2.干扰miR-378a-3p对细胞索拉非尼耐药性的影响

(2.1)CCK8法检测miR-378a-3p干扰前后细胞对药物半数抑制浓度(IC50)。

用倍比稀释法以2倍稀释，分别配置32μmol/L、16μmol/L、8μmol/L、4μmol/L、2μmol/L、 0μmol/L(未加入索拉非尼，作为对照组)浓度的索拉非尼，每个浓度设置6个副孔，将相应药物加入96孔板中。随后，取处于生长对数期的转染miR-378a-3p mimic/ctrl的耐药细胞，胰酶消化并制备成单细胞悬液。以4500个细胞每孔的浓度接种到已加药的96孔板中。37℃，5％CO₂孵箱里连续培养48小时。弃掉孔内培养基，每孔加入100μl的新鲜培养基和10μl的cck8溶液， 37℃培养1小时。培养结束后，将板子放入酶标仪中，以OD450nm读取每孔的吸光度值。根据对照孔(未加入索拉非尼)及加药孔的吸光度值计算索拉非尼对细胞的生长抑制率，进而计算出索拉非尼对细胞的半数抑制浓度，从而分析细胞耐药性的改变情况，综合三次重复实验结果，并运用统计学方法进行分析。如图4所示，索拉非尼对转染了miR-378a-3p mimic的索拉非尼耐药细胞的IC50明显下降，即过表达miR-378a-3p导致Huh7耐药细胞对索拉非尼的药物敏感性升高。

(2.2)CCK8法检测miR-378a-3p干扰前后细胞在6μmol/L索拉非尼作用下的增殖情况。

取处于生长对数期的转染miR-378a-3p mimic/ctrl的耐药细胞，胰酶消化并制备成单细胞悬液。以1000个细胞每孔的浓度接种于96孔板中，并加入6μmol/L索拉非尼浓度的培养基培养。分别在培养后1天、2天、3天、4天时，利用cck8方法进行读数。具体方法如下，将原培养基从96板中抽出，加入110μlcck8与新鲜培养基的混合液(混合体积比例为1:10)。随后，在37℃培养1小时。培养结束后，将板子放入酶标仪中，以OD450nm读取每孔的吸光度值。根据数据计算并绘制细胞的生长曲线，并结合统计学方法分析两种细胞的增殖能力是否存在差异。如图5所示，与ctrl相比，在6μmol/L索拉非尼作用下，转染了miR-378a-3p mimic的索拉非尼耐药细胞的增殖速度显著减慢(t检验，*P<0.05；**P<0.01)，即过表达miR-378a-3p可导致索拉非尼耐药细胞在原药物浓度下增殖减慢。

(2.3)过表达miR-378a-3p后对索拉非尼的凋亡作用的影响

取处于生长对数期的转染miR-378a-3p mimic/ctrl的耐药细胞，胰酶消化并制备成单细胞悬液。以2*10⁶个细胞每孔的浓度接种于6孔板中，贴壁后加入6μmol/L索拉非尼浓度的培养基培养。48小时后，收集细胞及上清培养液，离心，弃上清，用预冷PBS离心洗涤两次，弃上清。按照联科生物的Annexin V-FITC/PI apoptosis kit说明书，每管加入500μL预冷 1×Binding Buffer重悬，然后每管加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI，避光孵育5分钟后进行流式分析，并结合统计学方法分析两种细胞的增殖能力是否存在差异。如图6所示，与 ctrl相比，在6μmol/L索拉非尼作用下，miR-378a-3p mimic的凋亡比例显著增加(t检验， *P<0.05；**P<0.01)，即过表达miR-378a-3p可导致索拉非尼耐药细胞在原药物浓度下凋亡增加。表明逆转了肿瘤细胞对索拉非尼耐药性。

3.干扰miR-378a-3p对IGF1R的影响

如图7所示流程，通过相关网络数据库(miRWalk 2.0)分析寻找miR-378a-3p下游靶点，发现miR-378a-3p可结合一系列与索拉非尼耐药作用机制相关基因，通过WesternBlot检测这些耐药相关下游基因发现，IGF1R在耐药细胞株中显著增高(图8A)，且过表达miR-378a-3p后 IGF1R蛋白水平显著降低(图8A)。且miR-378a-3p能够下调带有野生型IGF1R 3'UTR的荧光报告基因的活性，而不影响带有突变型IGF1R 3'UTR的荧光报告基因的活性，见图8B和图8C。这些数据提示miR-378a-3p通过IGF1R调控PI3K/AKT通路影响肝癌索拉非尼耐药。

4.在耐药肿瘤细胞中使用LXRα激动剂GW3965与索拉非尼联用

(1)使用GW3965后增加miR-378a-3p的表达量

取处于生长对数期的耐药肿瘤细胞，胰酶消化并制备成单细胞悬液。以2*10⁶个细胞每孔的浓度接种于6孔板中，贴壁后分别加入1μmol/L浓度的GW3965、2μmol/L浓度的GW3965， 6μmol/L的索拉非尼、1μmol/L浓度的GW3965联合6μmol/L的索拉非尼和2μmol/L浓度的 GW3965联合6μmol/L的索拉非尼。48小时后，分别提取各组总RNA，并结合q-PCR验证miR-378a-3p表达量。如图9所示，加入GW3965后，miR-378a-3p的表达量显著提升。

(2)计算GW3965与索拉非尼联合用药的CI值

取处于生长对数期的耐药肿瘤细胞，胰酶消化并制备成单细胞悬液。以1000个细胞每孔的浓度接种于96孔板中，并以加入相应药物浓度的培养基培养(具体如表1-2所示)。48小时后，将原培养基从96板中抽出，加入110μlcck8与新鲜培养基的混合液(混合比例为1:10)。随后，在37℃培养1小时。培养结束后，将板子放入酶标仪中，以OD450nm读取每孔的吸光度值。根据数据计算生长抑制率及CI值。如图10所示，联合用药的CI值小于1，这表示GW3965与索拉非尼联合用药具有极好的协同作用，可以显著抑制肿瘤细胞的生长。

表1：Huh7耐药细胞中GW3965与索拉非尼联合用药浓度及CI值

表2：HCC-LM3耐药细胞中GW3965与索拉非尼联合用药浓度及CI值

5.荷瘤小鼠模型的建立并联合使用GW3965与索拉非尼。

(5.1)HCC-LM3细胞裸鼠荷瘤小鼠荷瘤模型的建立并联合用药。

收集16组HCC-LM3细胞，每组10⁷个细胞。1000转/分，离心5分钟，并用PBS清洗2遍。随后加入100μl无血清MEM培养基重悬细胞沉淀。取裸鼠16只，随机分为4组。本实验采用10％水合氯醛腹腔注射的方法进行麻醉。具体方法是，左手拇指食指固定小鼠头颈部，无名指和小指固定小鼠尾巴，以充分暴露小鼠腹部。随后用1ml注射器吸取70μl 10％水合氯醛对小鼠进行腹腔注射。针尖与腹部成45度夹角，感觉针尖有落空感时注射麻药。约15分钟后，待小鼠出现醉酒步态，且基本丧失自主行动能力时，打开腹腔，游离出一叶肝脏，1ml注射器吸取100μl细胞悬液，并排除气泡，在肝脏包膜下处，倾斜45度角进针，慢慢向前推进，待针头进入后，缓慢推进细胞悬液。出针时，保持针头平行缓慢，下压针头以避免细胞悬液流出，压迫止血后关腹。整个注射过程应尽量快速完全，以减少小鼠痛苦。

自接种日算起，每天观察小鼠状态及成瘤状况。约2周后，待4组小鼠均成瘤，第一组每天只腹腔注射生理盐水；第二组每天腹腔注射GW3965 30mg/kg；第三组每天灌胃索拉非尼30 mg/kg；第四组每天腹腔注射GW3965 30mg/kg和灌胃索拉非尼30mg/kg。

喂药四周后，进行IVIS成像，结果如图11所示，发现联合用药组肿瘤体积与其他三组相比存在明显差异，瘤块解剖下来并测量，也可以发现存在明显差异(*P<0.05)，这表示GW3965 和索拉非尼联合使用可以显著抑制肿瘤生长。检测小鼠体重及血清ALT后，四组小鼠之前并没有显著差异，这表明联合用药没有明显的副作用(图12)。随后提取了瘤块的RNA，并进行逆转录和q-PCR，发现使用GW3965后，瘤块内miR-378a-3p的表达量显著提高。对小鼠肿瘤组织进行IHC染色后发现，IGF1R表达量在联合用药组同样明显下降，并且Tunnel染色也显示联合用药组凋亡比例明显上升(图13)。以上结果表明，GW3965与索拉非尼联用，通过增加miR-378a-3p的表达，抑制IGF1R，达到抑制肿瘤生长和增加肿瘤细胞凋亡。

(5.2)病人肝癌组织来源的裸鼠荷瘤小鼠荷瘤模型的建立并联合用药

取裸鼠6只，随机分为2组。本实验采用10％水合氯醛腹腔注射的方法进行麻醉。具体方法是，左手拇指食指固定小鼠头颈部，无名指和小指固定小鼠尾巴，以充分暴露小鼠腹部。随后用1ml注射器吸取70μl 10％水合氯醛对小鼠进行腹腔注射。针尖与腹部成45度夹角，感觉针尖有落空感时注射麻药。约15分钟后，待小鼠出现醉酒步态，且基本丧失自主行动能力时，打开小鼠左腋下间隙将一小块来源于人肝癌PDX荷瘤小鼠的肿瘤组织(约1mm³)塞入间隙内，压迫止血后缝合。整个过程应尽量快速完全，以减少小鼠痛苦。

自接种日算起，每天观察小鼠状态及成瘤状况。约3周后，待4组小鼠均成瘤，第一组每天灌胃索拉非尼30mg/kg；第二组每天腹腔注射GW3965 30mg/kg和灌胃索拉非尼30mg/kg。

喂药四周后，取下完整肿瘤组织，结果如图14所示，发现联合用药组肿瘤体积与单用索拉非尼组相比存在明显差异，这表示GW3965和索拉非尼联合使用可以显著抑制肿瘤生长。表明，GW3965和索拉非尼可联合作为抗肝癌药物。对小鼠肿瘤组织进行IHC染色后发现， IGF1R表达量在联合用药组同样明显下降，并且Tunnel染色也显示联合用药组凋亡比例明显上升，并且在肝脏上的转移灶也更少(图15)。以上结果表明，GW3965与索拉非尼联用，通过增加miR-378a-3p的表达，抑制IGF1R，达到抑制肿瘤生长和增加肿瘤细胞凋亡。表明， miR-378a-3p的转录因子LXRα激动剂GW3965可以用于制备逆转肿瘤细胞对索拉非尼耐药性药物。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种与肿瘤细胞对索拉非尼耐药性相关的microRNA及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

acuggacuug gagucagaag gc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA