一种根据精浆mRNA预测无精子症者睾丸中有无精子的方法
阅读说明：本技术 一种根据精浆mRNA预测无精子症者睾丸中有无精子的方法 (Method for predicting sperms in testis of azoospermia patient according to seminal plasma mRNA ) 是由 闫威 唐运革 于 2020-05-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种根据精浆mRNA预测无精子症者睾丸中有无精子的方法,以睾丸活检为“黄金标准”,将无精子症患者精液标本分为睾丸有精子组和睾丸无精子组,应用深度测序技术确定两组精液exRNA表达谱差异,然后与现有生精细胞转录组数据库进行比较,寻找具有判定生精细胞种类的,差异表达的exRNA,用于判定无精子症患者睾丸内是否存在单倍体精子细胞。本发明的方案在临床中的应用将极大提高无精子症患者取精成功率,也有助于指导无精子症患者选择经济,无痛苦,有效的治疗方法来解决其不育的难题。(The invention discloses a method for predicting the existence of sperms in the testis of a patient without spermatids according to seminal plasma mRNA, which takes testis biopsy as 'gold standard', divides a semen sample of the patient without spermatids into a testis spermatid group and a testis spermatid group, determines the difference of expression profiles of two groups of semen exRNA by applying a deep sequencing technology, compares the difference with the existing spermatid transcriptome database, and searches for the exRNA which has the function of judging the types of the spermatids and is differentially expressed, and is used for judging whether haploid spermatids exist in the testis of the patient without spermatids. The application of the scheme of the invention in clinic can greatly improve the sperm collection success rate of patients with azoospermia, and is also helpful for guiding the patients with azoospermia to select an economical, painless and effective treatment method to solve the problem of infertility.)
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种根据精浆mRNA预测无精子 症者睾丸中有无精子的方法。
背景技术
男性不育患者中约10％-20％为无精子症，无精子症又分为梗阻性无精子症 (OA)与非梗阻性无精子症(NOA)。无精子症患者如果睾丸内有精子，可通 过睾丸精子抽吸术(TESE)等外科技术取到精子并接受辅助生殖技术从而可能 获得自己血缘关系的后代，OA患者几乎100％可通过TESE等获取精子，而 NOA患者只有50％-60％左右可获取精子。但是，在患者配偶取卵日，仍有部分 无精子症患者可能遭遇到取不到精子的尴尬局面，在NOA中这种情况高达30％ 左右，而此时女性配偶已经接受了昂贵的促排卵治疗，并且可能接受了取卵手 术，因此，NOA夫妇进入辅助生殖周期之前对男方进行有效的评估具有重要的 临床意义。对于无精子症患者来说，拥有自己的孩子的选择很有限，主要有两 条途径：(1)通过供精进行单精子胞浆内注射(ICSI)或IUI；(2)通过外科手 术在睾丸内寻找单倍体精子细胞，如果能找到单倍体精子细胞就可以通过ICSI 获得自己血缘关系的子代。尽管外科手术有很大创伤性和不确定性，但大多数 患者愿意选择这种方式取得精子，因为可以获得自己血缘关系的子代。目前， 在手术探查前，没有办法判定无精子症患者睾丸内是否存在单倍体精子细胞。 我们一直在思考能否利用精液或精浆中的成分作为生物学标记来判定一个无精 子症患者睾丸内是否存在单倍体精子细胞？如果能建立一个通过精液/浆分析 即可判定睾丸内有无单倍体精子细胞的方法，我们不仅能减少患者的手术痛苦 和经济负担，还可以避免不必要的手术探查，提高诊治效率。比如，对于睾丸 中根本没有单倍体精子细胞的患者，应告知患者已不必要进行睾丸活检，可选 择供精人工授精来解决不育的问题。所以，这是一个极具临床价值的研究课题。
发明内容
有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供了一种根据精浆mRNA预测 无精子症者睾丸中有无精子的方法，以睾丸活检为“黄金标准”，将无精子症患 者精液标本分为睾丸有精子组和睾丸无精子组，应用深度测序技术确定两组精 液exRNA表达谱差异，然后与现有生精细胞转录组数据库进行比较，寻找具有 判定生精细胞种类的，差异表达的exRNA，用于判定无精子症患者睾丸内是否 存在单倍体精子细胞。本发明的成功以及未来的临床应用将极大提高无精子症 患者取精成功率，也有助于指导无精子症患者选择经济，无痛苦，有效的治疗 方法来解决其不育的难题。
为此，本发明公开如下技术方案：
一种根据精浆mRNA预测无精子症者睾丸中有无精子的方法，包括如下步 骤：
(1)精液标本收集及处理：收集无精子症患者精液，液氮冷冻保存；无精 子症定义为每隔4～5周取一次精液，三次精液离心后镜检未发现精子；将收集 到的无精子症患者精液进行两次低速离心后上清用于RNA测序；
(2)RNA的分离和测序：应用mirVana miRNA分离试剂盒可以将大片段 和小片段RNA分离，分离后应用Bioanalyer2100(Agilent)分析RNA的质量、大 小分布和数量；
(3)睾丸多点穿刺活检：采用睾丸多点穿刺法，通过睾丸精子抽吸术获取 无精子症患者睾丸中的成熟精子，根据倒置显微镜下是否找到成熟精子；而后 以病理组织学检查为金标准，将样本分为有镜子组和无精子组；
(4)无精子症患者精浆mRNA的差异表达谱：应用睾丸多点活检病理检测 无精子症患者睾丸内是否存在单倍体精子细胞，将无精子症患者样本分为睾丸 有精子组和睾丸无精子组；将两组精液解冻、低速离心，将精液上清和精子细 胞分离，精液上清再低速离心一次，收获的上清用于测序获得纯的精液RNA序 列；再与每个患者的RNA测序结果、现有RNA文库比较，获得具有预测价值 的差异表达的RNA；
(5)生物信息学分析：应用TCF(Tophat,Cufflink and FusionMap)注释途径 注释内源性和外源性mRNA；应用lncRNA注释途径注释mRNA；
(6)验证特异性RNA预测指标的敏感性、特异性：应用real-time PCR检 测各组具有预测价值的RNA表达水平；应用SPSS软件，对实验数据采用方差 分析、Kruskal-Wallis H检验和Mann-whitney U检验，取α＝0.05为检验水准， 采用受试者工作特征曲线法，通过计算ROC曲线下面积分析评价检测指标的敏 感性、特异性；
(7)从测序结果中筛选出多个可用于预测睾丸内是否存在单倍体精子的基 因；对于具体标本通过测序比对无精子症患者精液中是否含有相应基因以预测 睾丸内是否存在单倍体精子。
优选地，所述步骤(3)中，睾丸多点穿刺活检包括如下具体步骤：
患者取仰卧位，常规消毒手术区域、铺无菌洞巾，1％利多卡因行精索内神 经阻滞麻醉；
用一次性20ml溶药空针(针头带侧孔)作为穿刺针；左手三指法固定术侧 睾丸紧贴于阴囊皮下，穿刺部位取睾丸中上部，穿刺点用1％利多卡因局麻，利 用5号半针头注射器穿刺阴囊直至睾丸白膜做一入路，右手握持穿刺用溶药空 针沿入路经皮肤穿刺进入睾丸实质内，反复抽拉针栓数次，然后将针栓拉至20ml 位置形成负压，保持负压状态下拔出针头。
将抽吸到的睾丸组织分为两份，一部分置入含有HTF液的小培养皿，使用 1ml注射器针头分离、划破、撕碎和挤压睾丸组织，以释放生精细胞和精子制 成细胞悬液，在倒置显微镜下寻找成熟精子；如有精子，结束手术；
若术侧睾丸组织无精子，可进行同侧第2次穿刺，如仍无精子，改行对侧 TESE根据倒置显微镜下是否找到成熟精子；
术毕把另外一部分Bouin液固定的睾丸组织送病理，常规HE染色，由病 理科医师施行病理组织学检查，以病理组织学检查为金标准，将样本分为有镜 子组和无精子组。
优选地，所述步骤(4)中，由于冷冻精液中含有保护剂等外源性RNA污 染，须将冷冻保护剂单独测序，获得的序列，从实验结果中去除，即可获得纯 的精液RNA序列。
优选地，所述步骤(4)中，低速离心是指2000g离心。
优选地，所述步骤(7)中，相关基因的预测规则为：
(1)精桨中TDRP7-2和PRM2 mRNA表达下降可以区分正常和生精阻滞 病理类型；
(2)精桨中SMCP和ACSBG2-2 mRNA表达下降可以区分正常和梗阻、 非梗阻性无精子症病理类型；
(3)精桨中ARID5B-3和FRS2-2 mRNA表达下降可以区分正常和唯支持 细胞综合征病理类型。
本发明从测序结果中筛选17个可用于预测睾丸内是否存在单倍体精子的基 因。其中PRM2、ODF1、ACSBG2、SMCP特异性的表达于精子细胞；FRS2、 TBX3、CDKN1B、CSDE1、AR、ARID5B、DLD、TDRD7、UBE3A及CAT等 基因主要表达于精原细胞与精母细胞中；UBA52、POLR2L、RPL36等基因主要 表达于支持细胞中。本实验设置临床分组为：正常对照组、生精阻滞组、穿刺 有精子组及唯支持细胞组；以RPL41作为内参基因，对17个候选基因进一步验证结果如图所示：组间存在差异的基因有AR、TDRP7、ARID5B、SMCP、PRM2、 FRS2及ACSBG2等基因。其中SMCP与ACSBG2基因仅在正常对照组中可检 测到其表达；PRM2基因仅表达于正常对照组与穿刺有精子组；AR基因在正常 对照组与穿刺有精子组间的表达量存在显著差异(P<0.05),TDRP7基因在唯支 持细胞组与生精阻滞组与正常对照组相比存在显著差异(P<0.05)，ARID5B基 因在正常对照组与唯支持细胞组间存在显著差异(P<0.05)。
本发明的方法通过获得一些精桨mRNA可以预测无精子症患者睾丸的生精 功能：(1)精桨中TDRP7-2和PRM2 mRNA表达下降可以区分正常和生精阻滞 病理类型；(2)精桨中SMCP和ACSBG2-2 mRNA表达下降可以区分正常和梗 阻、非梗阻性无精子症病理类型；(3)精桨中ARID5B-3和FRS2-2 mRNA表达 下降可以区分正常和唯支持细胞综合征病理类型。该成果将有望转化到临床上 以提高无精子症患者取精成功率，也有助于指导无精子症患者选择经济、有效 的治疗方法来解决不育难题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简 单地介绍。
图1为不同类型(TESA、MA、SOS和CTR)的无精子症转录组主成分分 析；
图2为正常对照组与TESA、MA、SOS类型无精子症胞外mRNA差异；
图3为SOS与TESA、MA类型无精子症胞外mRNA差异；
图4为不同类型无精子症胞外mRNA表达的热图；
图5为筛选基因验证结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于 说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实施方 法，通常按照常规方式进行操作。
实施例1
1.1精液标本收集及处理
收集30份正常精液和42份无精子症患者精液2ml，液氮冷冻保存。正常精 液来自广东省人类精子库。无精子症定义为每隔4～5周取一次精液，三次精液 离心后镜检未发现精子。精液被两次低速离心后上清用于RNA测序。
1.2RNA的分离和测序
应用mirVana miRNA分离试剂盒可以将大片段和小片段RNA分离，分离 后应用Bioanalyer2100(Agilent)分析RNA的质量、大小分布和数量等。
1.3睾丸多点穿刺活检
患者取仰卧位，常规消毒手术区域、铺无菌洞巾，1％利多卡因行精索内神 经阻滞麻醉。使用一次性20ml溶药空针(针头带侧孔)作为穿刺针。左手三指 法固定术侧睾丸紧贴于阴囊皮下，穿刺部位取睾丸中上部，穿刺点用1％利多卡 因局麻，利用5号半针头注射器穿刺阴囊直至睾丸白膜做一入路，右手握持穿 刺用溶药空针沿入路经皮肤穿刺进入睾丸实质内，反复抽拉针栓数次，然后将 针栓拉至20ml位置形成负压，保持负压状态下拔出针头。将抽吸到的睾丸组织 分为两份，一部分置入含有HTF液的小培养皿，使用1ml注射器针头分离、 划破、撕碎和挤压睾丸组织，以释放生精细胞和精子制成细胞悬液，在倒置显 微镜下寻找成熟精子；如有精子，结束手术。若术侧睾丸组织无精子，可进行 同侧第2次穿刺，如仍无精子，改行对侧TESE根据倒置显微镜下是否找到成 熟精子。术毕把另外一部分Bouin液固定的睾丸组织送病理，常规HE染色， 由病理科医师施行病理组织学检查，以病理组织学检查为金标准，将样本分为 有镜子组和无精子组。
1.4无精子症患者精浆mRNA的差异表达谱
应用睾丸多点活检病理检测无精子症患者睾丸内是否存在单倍体精子细胞， 将无精子症患者样本分为睾丸有精子组和睾丸无精子组。将两组精液解冻， 2000g离心一次，将精液上清和精子细胞分离，精液上清2000g再离心一次， 收获的上清用于测序。由于冷冻精液中含有保护剂等外源性RNA污染，因此， 我们将冷冻保护剂单独测序，获得的序列，从实验结果中去除，即可获得纯的 精液RNA序列。再与每个患者的RNA测序结果、现有RNA文库比较，获得 具有预测价值的差异表达的RNA。
1.5生物信息学分析
应用TCF(Tophat,Cufflink and FusionMap)注释途径注释内源性和外源性mRNA；应用lncRNA注释途径注释mRNA。
1.6验证特异性RNA预测指标的敏感性、特异性
收集60例无精子症患者精液2ml，冷冻保存。采用双盲设计，根据睾丸多 点活检病理检测结果将标本分为两组：有精子组和无精子组。应用real-time PCR 检测各组具有预测价值的RNA表达水平。应用SPSS 13.0软件，对实验数据采 用方差分析、Kruskal-WallisH检验和Mann-whitney U检验，取α＝0.05为检 验水准，采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)法，通过计算ROC曲线下面 积分析评价检测指标的敏感性、特异性等。
2、实验结果
本实验从测序结果中筛选17个可用于预测睾丸内是否存在单倍体精子的基 因。其中PRM2、ODF1、ACSBG2、SMCP特异性的表达于精子细胞；FRS2、 TBX3、CDKN1B、CSDE1、AR、ARID5B、DLD、TDRD7、UBE3A及CAT等 基因主要表达于精原细胞与精母细胞中；UBA52、POLR2L、RPL36等基因主要 表达于支持细胞中。本实验设置临床分组为：正常对照组、生精阻滞组、穿刺 有精子组及唯支持细胞组；以RPL41作为内参基因，对17个候选基因进一步验证结果如图所示：组间存在差异的基因有AR、TDRP7、ARID5B、SMCP、PRM2、 FRS2及ACSBG2等基因。其中SMCP与ACSBG2基因仅在正常对照组中可检 测到其表达；PRM2基因仅表达于正常对照组与穿刺有精子组；AR基因在正常 对照组与穿刺有精子组间的表达量存在显著差异(P<0.05),TDRP7基因在唯支 持细胞组与生精阻滞组与正常对照组相比存在显著差异(P<0.05)，ARID5B基 因在正常对照组与唯支持细胞组间存在显著差异(P<0.05)。
本发明获得一些精桨mRNA可以预测无精子症患者睾丸的生精功能：(1) 精桨中TDRP7-2和PRM2 mRNA表达下降可以区分正常和生精阻滞病理类型； (2)精桨中SMCP和ACSBG2-2 mRNA表达下降可以区分正常和梗阻、非梗 阻性无精子症病理类型；(3)精桨中ARID5B-3和FRS2-2 mRNA表达下降可以 区分正常和唯支持细胞综合征病理类型。该成果将有望转化到临床上以提高无 精子症患者取精成功率，也有助于指导无精子症患者选择经济、有效的治疗方 法来解决不育难题。
1、高通量RNA-Seq测序结果主成分分析
本发明使用hiseq2000平台一共测了40个样品，通过高通量RNA-Seq测序， 获得胞外RNA可用于预测无精子症患者睾丸内是否存在单倍体精子的结果。利 用基因的表达量进行主成分分析(PCA分析)，从而明确样本之间的关系，PCA 分析图可从各维度表示样品之间的关系。样本聚类距离或者PCA距离越近，说 明样本越相似，反之差异越大。不同组样本空间分布较远，同组的样品在空间 分布比较集中。如图1所示：睾丸穿刺有精子组(TESA)、生精阻滞组(MA)、 唯支持细胞综合症组(SOS)与对照组(CTR)。同一组样本集中聚集在一起，其中TESA组存在离群样本。RNA测序数据显示，CTR组与MA、SOS及TESA 组间基因表达存在明显的分离。主成分2(PC2)中SOS组与CTR组的基因表 达差异分离较小，但PC1与PC2两主成分在TESA与MA组间的基因表达无显 著分离。
2、高通量RNA-Seq测序后基因集富集分析
针对于RNA-Seq测序结果，基因注释信息分类后构建目标基因集，分析CTR 组与MA、SOS及TESA组间的基因表达差异。结果如图2所示，CTR组与MA、 SOS及TESA组相比，在核组织、配子发生、生殖细胞发育、精子发生、精子 发育、受精、性发育、染色体凝集及精子分化等生物学功能有关基因表达存在 显著分离。图3所示，SOS组与CTR、MA及TESA组相比，在生殖发育过程、 氨基酸转运、雌性性腺发育等生物学功能有关基因存在显著分离。
3、高通量RNA-Seq测序后Heatmap分析
高通量RNA-Seq测序后的热图结果如图4所示，CTR组中TSSK6、ZNF541、 TBATA、TBATA、SPEM1、SPATA3、ESR2等基因高表达，但在TESA、SOS 及MA组低表达。SOS组中，FZD5、CAT、CSDE1、UBE3a等基因表达量，显 著低于TESA、MA及CTR组。TESA组中RPL36、UBA52、U2AF1等基因表 达量显著低于SOS、MA及CTR组。基因本体论(Gene Ontology，GO)的功 能注释结果表明有26个显著的Goterms。
本发明的方法，筛选存在组间差异的17个基因，进一步用RT-PCR技术进 行验证。临床分组设置为：正常对照组、生精阻滞组、穿刺有精子组及唯支持 细胞组，每组各取8人份样本用于分析后选基因的稳定性及预测价值分析。
以RPL41作为内参基因，对17个候选基因进一步验证结果如图5所示：组 间存在差异的基因有AR、TDRP7、ARID5B、SMCP、PRM2、FRS2及ACSBG2 等基因。其中SMCP与ACSBG2基因仅在正常对照组中可检测到其表达；PRM2 基因仅表达于正常对照组与穿刺有精子组；AR基因在正常对照组与穿刺有精子 组间的表达量存在显著差异(P<0.05)，TDRP7基因在唯支持细胞组与生精阻滞 组与正常对照组相比存在显著差异(P<0.05)，ARID5B基因在正常对照组与唯 支持细胞组间存在显著差异(P<0.05)。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明 之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范 围。