检测rs9273471位点多态性的试剂及其应用

文档序号：1308674 发布日期：2020-08-11 浏览：6次 >En<

阅读说明：本技术 检测rs9273471位点多态性的试剂及其应用 (Reagent for detecting rs9273471 site polymorphism and application thereof ) 是由周智广谢志国黄干李霞罗说明林健肖扬夏影于 2020-06-17 设计创作，主要内容包括：本发明属于分子生物学和医学领域,涉及一种检测rs9273471位点多态性的试剂及其应用。通过该位点基因型的检测结果来预测成人隐匿性自身免疫糖尿病(LADA)患病风险或者预测区分LADA和2型糖尿病(T2DM)。本发明还公开了相应的检测试剂盒,该试剂盒含有扩增rs9273471位点的引物以及检测该位点基因型的引物。利用本发明检测rs9273471位点的基因型,方法简单易行,快速高效,成本低廉,为LADA的诊断和治疗提供了一个简捷的新途径。(The invention belongs to the fields of molecular biology and medicine, and relates to a reagent for detecting rs9273471 site polymorphism and application thereof. The detection result of the locus genotype is used for predicting the risk of Latent Autoimmune Diabetes (LADA) of adults or predicting and distinguishing LADA from type 2 diabetes (T2 DM). The invention also discloses a corresponding detection kit, which contains a primer for amplifying the rs9273471 locus and a primer for detecting the genotype of the locus. The method for detecting the genotype of the rs9273471 locus is simple, easy, rapid, efficient and low in cost, and provides a simple new way for diagnosis and treatment of LADA.)

技术领域：

本发明涉及分子生物学和医学领域，涉及人HLA基因单核苷酸多态性位点rs9273471的检测试剂，及其在制备LADA相关性风险评估试剂中的应用。

背景技术：

成人隐匿性自身免疫糖尿病(LADA)是一种成人发病、存在糖尿病相关自身抗体、诊断后一段时间内不需要胰岛素治疗的自身免疫性糖尿病，是成人型自身免疫性糖尿病中最常见的一种，也可能是最常见的自身免疫性糖尿病。免疫方面，谷氨酸脱羧酶自身抗体是成人糖尿病患者最常见的自身抗体。

作为1型糖尿病(T1DM)的一种特殊亚型，LADA也是一种T细胞介导的自身免疫性疾病，其与胰岛β细胞表面异常表达的HLA II类抗原相关，HLA基因又称为人类主要组织相容性复合体，位于第6对染色体的短臂上，整个复合体上有近60个基因座，根据编码分子特性的不同，可将整个复合体的基因分成三类：I类、II类、III类。II类基因区位于着丝点的近端，是结构最为复杂的一个区，主要由DR、DQ、DP三个亚区构成，每个亚区又有若干个位点，其中本发明研究的rs9273471位点就是II类基因上DQ亚区的一个位点。CD4⁺的T细胞表面受体与HLA II类分子与抗原肽形成的复合物结合，刺激辅助性T细胞分泌细胞因子等，从而参与LADA的发病过程。T细胞和抗原递呈细胞浸润胰岛是一个漫长的过程，导致LADA的发病可在免疫反应发生后的数月至数年发生。

糖尿病是一种多因素疾病，是由环境和遗传危险因素之间复杂的相互作用引起的。1型糖尿病(T1DM)和2型糖尿病(T2DM)的遗传决定因素已经得到了广泛的研究，而对成人隐匿性自身免疫糖尿病(LADA)的研究却很少。为了最终实现治疗LADA，本领域迫切需要寻求LADA的易感基因，并开发检测LADA易感基因的方法、试剂盒，以及相关治疗药物。此外，由于临床症状的相似，LADA患者常常被误诊为2型糖尿病。为了将LADA与其他类型的糖尿病区分开来，对LADA患者进行更加精准的治疗，LADA的检测与治疗需要专门的策略。

发明内容

：

本发明的首要目的是提供一种检测rs9273471位点多态性的试剂在制备预测LADA患病风险制剂中的应用。该多态性位点是首次被发现与LADA患病风险相关，该位点基因型用于判定LADA患病风险，预测准确性高，可信度大。

进一步的，所述的rs9273471位点多态性为：AA,AG或GG。

本发明发现携带rs9273471GG基因型的人群中正常人人数远高于LADA患者人数，提示GG基因型患者患LADA的风险低，另外两种基因型AA和AG均以GG基因型为参比。

本发明以LADA病例和正常对照各500例左右进行统计学分析发现：rs9273471位点基因型为AA时，相对于基因型为GG的比值比OR为4.14，且p值小于0.05，具有显著性差异。即携带rs9273471AA基因型的人群患LADA的风险显著升高，是GG基因型人群患LADA风险的4.14倍；rs9273471位点基因型为AG时，相对于基因型为GG的比值比OR为1.31，但p值大于0.05，不具有显著性差异，因此，rs9273471位点基因型为AG时，不足以判断患LADA的风险。

进一步的，本发明得到的结论为：检测对象rs9273471位点基因型为AA时，LADA患病风险高于基因型为GG。

进一步的，上述检测rs9273471位点多态性的试剂可以预测以下几种情形：

(1)用于预测未出现糖尿病临床症状的普通人患LADA的风险。

(2)用于预测出现糖尿病临床症状但尚未确诊糖尿病的人患LADA的风险。

(3)用于预测确诊糖尿病，但尚未确诊具体是哪一种糖尿病的患者患LADA的风险。

本发明的第二个目的是提供一种检测rs9273471位点多态性的试剂在制备区分LADA和T2DM预测制剂中的应用。该多态性位点是首次发现能够用于预测区分LADA和T2DM，且该位点基因型用于判定患LADA而不是T2DM的概率，预测准确性高，可信度大。

进一步的，所述的rs9273471位点多态性为：AA,AG或GG。

由于携带rs9273471GG基因型的人群中T2DM患者人数远高于LADA患者人数，提示GG基因型患LADA而不是T2DM的概率低，另外两种基因型AA和AG均以GG基因型为参比。

本发明以LADA病例和T2DM病例各500例左右进行统计学分析发现：

rs9273471位点基因型为AA时，相对于基因型为GG的比值比OR为3.45，

rs9273471位点基因型为AG时，相对于基因型为GG的比值比OR为1.44。

即携带rs9273471AA基因型的人群患LADA而不是T2DM的概率显著升高，患LADA而不是T2DM的概率是GG基因型的3.45倍；携带rs9273471AG基因型的人群患LADA而不是T2DM的概率是GG基因型人群的1.44倍。

进一步的，在区分LADA和T2DM时，rs9273471位点基因型患LADA而不是T2DM的概率依次为AA＞AG＞GG基因型，且p值均小于0.05，具有显著性差异。

上述检测rs9273471位点多态性的试剂能够预测以下几种情形：

(1)用于预测出现糖尿病临床症状但尚未确诊糖尿病的人患LADA而不是T2DM的概率。

(2)用于预测确诊糖尿病，但尚未确诊具体是哪一种糖尿病的患者患LADA而不是T2DM的概率。

(3)用于预测确诊糖尿病，但尚未确诊患LADA还是T2DM的患者患LADA而不是T2DM的概率。

其中第(3)种情形，由于临床症状的相似，LADA患者常常被误诊为2型糖尿病，因此，此种应用上的区分很有医学意义。

本发明的第三个目的是提供一种预测LADA患病风险或者预测区分LADA和T2DM的试剂盒。该试剂盒是基于本发明新发现的与预测LADA患病风险或者预测区分LADA和T2DM的SNP位点而设计的，预测准确性高，可信度大。

该试剂盒具体为检测rs9273471位点多态性的试剂。

进一步的，所述的试剂盒：

包含特异性扩增rs9273471位点的引物以及测序引物。

进一步的，优选测序引物序列为：TGGGAATTCTGGGCAGG，见SEQ ID NO.1；但本发明试剂盒不限于该测序序列。

进一步的，优选扩增引物序列为：F：TGCATCAAGCTGAAGTTCTGTG，见SEQ ID NO.2；R：GGTGGGGATGAAAGGAGATG，见SEQ ID NO.3；但本发明试剂盒不限于该扩增引物序列。

本发明检测的LADA易感基因是HLA II类基因DQ亚区的rs9273471位点的基因型。rs9273471的核苷酸序列可参见网址：http://genome.ucsc.edu/。

本发明配套的检测方法包括以下步骤：

(a)提取样品中的基因组DNA；

(b)PCR扩增获得包含rs9273471位点的产物；

(c)对产物进行测序，对该位点的基因型进行分析。

本发明的检测对象是亚洲人种，尤其是中国人。

上述方法中涉及的提取基因组DNA、扩增、测序等技术均可采用本领域的常规操作方法。

本发明经过多年研究，首次证明了HLA II类基因的DQ亚区的rs9273471位点的单核苷酸多态性与LADA的发病风险相关。rs9273471基因型的改变将导致LADA的发病风险升高，其中关联研究结果显示，rs9273471(GG→AA)在病例和对照组中的分布存在显著性差异(P<0.05)；且该位点用于判定的标准基因型，预测准确度更高。此外，本发明还发现由于临床症状的相似，LADA患者常常被误诊为2型糖尿病,该多态性位点是首次发现能够用于预测区分LADA和T2DM，且该位点用于判定的标准也为基因型，预测准确性高，可信度大；因此能够简单高效的将LADA与2型糖尿病区分开来，对LADA患者进行更加精准的治疗，意义重大。

本发明可用于对个体的LADA易感性进行早期诊断，包括步骤：(1)提取样本的基因组DNA。(2)用rs9273471的特异性扩增引物通过PCR扩增样品的基因组DNA，得到扩增产物。(3)设计测序引物，对扩增产物的rs9273471位点进行测序。检测该个体的HLA基因rs9273471位点的基因型，rs9273471带有AA基因型的个体，LADA的易感性显著高于普通人群；以此判断该个体的患LADA的发病风险是否高于普通人群，此外，还可以用于预测区分LADA和T2DM两种类型的糖尿病。本发明为LADA的诊断与治疗提供了更加简便易行的方法。

本发明还基于上述发现开发了相应的检测试剂盒，盒中包括扩增该位点的特异性引物以及测序引物。利用本发明检测rs9273471位点的基因型，方法简单易行、快速高效、成本低廉，为LADA的诊断和治疗提供了一个简捷的新途径。

附图说明：

图1为实施例1中样本的基因组DNA浓度和质量检测结果。

图2为用琼脂糖凝胶电泳检测实施例1中样本基因组DNA长度均大于10kb。

图3为实施例2部分样本的rs9273471位点扩增电泳结果。

图4为实施例2中rs9273471位点扩增测序结果截图；三种基因型示例图；上图为rs9273471AA基因型；中图为rs9273471AG基因型；下图为rs9273471GG基因型。

图5为实施例3中rs9273471位点扩增测序结果截图；上图为rs9273471AA基因型；中图为rs9273471AG基因型；下图为rs9273471GG基因型。

具体实施方式

下面结合具体的实施案例，进一步阐述本发明。这些实施案例仅用于描述本发明而并不限制本发明的范围。未注明具体条件的实验方法均按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1:PCR扩增

一、实验材料

PCR仪：德国Eppendorf公司；聚合酶链反应液：金牌mix,北京擎科生物科技有限公司。

二、引物设计与合成

以HLA II类基因的包括rs9273471位点的部分序列为模板，使用Primer 3软件分析和设计引物，并由北京擎科生物科技有限公司合成。

测序引物序列为：TGGGAATTCTGGGCAGG

扩增引物序列为：F：TGCATCAAGCTGAAGTTCTGTG

R：GGTGGGGATGAAAGGAGATG。

三、样本检测

1.实验检测LADA、T2DM患者和正常对照人群，每例收集5ml血样标本，提取基因组DNA，提取结果用赛默飞公司的Nanodrop2000检测。

2.按如下体系(表1、表2)进行PCR扩增：

表1 PCR反应体系

加入试剂	加入量
		金牌PCR mix	27ul
F	1ul
		R	1ul
DNA	1ul

表2 PCR反应程序

四、基因型检测结果

基因组DNA抽提的检测结果：

所有样本的基因组DNA浓度和质量符合检测要求，260/280>1.8,浓度>10ng/ul，见图1，用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA长度均大于10kb，见图2。

直接测序法是公认最准确的基因分型方法，也是世界卫生组织HLA命名委员会推荐的HLA分型方法的“金标准”。可以直接用PCR产物测序，但某些SNP多态性位点在有些个体中是缺失的，导致无法得到扩增产物，另外导致测序结果出现双峰而难以判别。一种办法是对PCR产物克隆后测序。但PCR产物克隆后测序的整体流程非常麻烦，而且测序费用很高，所以难以广泛使用。另一种方法是用特异性引物扩增和测序，这种方法相对简单、成本较低。本发明采用了后一种方法，进行了多次尝试，使用了多对引物进行扩增和测序，针对共有区设计了特异性引物解决了这一难题。

所使用过的引物如下：

第一组：

扩增引物rs9273471-1F：CATCAAGCTGAAGTTCTGTGTC，见SEQ ID NO.4；

rs9273471-1R：GGGTGGGGATGAAAGGAGAT，见SEQ ID NO.5；

测序引物rs9273471-seq1：CATCAAGCTGAAGTTCTGTGTC，见SEQ ID NO.6；

第二组：

扩增引物rs9273471-2F：TCTGCATCAAGCTGAAGTTCT，见SEQ ID NO.7；

rs9273471-2R：TGCTTCTCTTGAGCAGTCTGA，见SEQ ID NO.8；

测序引物rs9273471-seq2：TCTGCATCAAGCTGAAGTTCT；见SEQ ID NO.9；

第三组：

扩增引物rs9273471-3F：TCTGCATCAAGCTGAAGTTCTG，见SEQ ID NO.10；

rs9273471-3R：TGGGGATGAAAGGAGATGAC，见SEQ ID NO.11；

测序引物rs9273471-seq3：TCTGCATCAAGCTGAAGTTCTG；见SEQ ID NO.12；

第四组：

扩增引物rs9273471-4F：TGCATCAAGCTGAAGTTCTGTG

rs9273471-4R：GGTGGGGATGAAAGGAGATG

测序引物rs9273471-seq4：TGGGAATTCTGGGCAGG。

最后，只有第4组引物能够很好的扩增和测序，其余组的引物出现双峰，难以判别。

实施例2

用测序法检测HLA II类基因的rs9273471位点。挑选488例LADA患者和501例正常对照人群进行测序判断rs9273471的基因型。

LADA患者共488例，男性286例，女性202例，年龄为42.5(33-53)岁，正常对照501例，男性258例，女性243例，年龄为49(38-58)岁，年龄数据均用中位数(四分位数间距)表示。

LADA患者纳入标准：①确诊为糖尿病；②一种或多种胰岛自身抗体阳性：抗体检测采用放射配体法，阳性判定标准为：405例健康人抗体指数的第99百分位点作为阳性判断阈值：GADA≥0.05、IA-2A≥0.0078、ZnT8A≥0.011；③确诊糖尿病后6个月内不依赖胰岛素治疗；④年龄≥18岁。排除标准：①妊娠糖尿病、其他特殊类型糖尿病；②严重感染、创伤、手术等应激情况；③合并其他自身免疫性疾病；④恶性肿瘤；⑤严重心脑血管疾病；⑥妊娠或哺乳期妇女；⑦肝肾功能不全等；⑧其他不适于纳入病例组的情况。

501例正常对照纳入标准：①无血缘关系的湖南汉族人；②口服糖耐量试验(Oralglucose tolerance test,OGTT)显示空腹血糖<5.6mmol/L，2小时后血糖<7.8mmol/L。排除标准：①有心、脑、肝、肾等慢性疾病及内分泌疾患；②合并有其他类型的自身免疫性疾病；③有糖尿病家族史；④合并有恶性肿瘤。

一、实验方法

扩增引物序列为：F：TGCATCAAGCTGAAGTTCTGTG

R：GGTGGGGATGAAAGGAGATG。

扩增的产物采用琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物送至北京擎科生物科技有限公司进行测序，测序引物为：TGGGAATTCTGGGCAGG。用Lasergene软件进行分析。

二、HLA II类基因rs9273471位点扩增结果：见附图3。

三、HLA II类基因rs9273471位点基因型的检测结果：见附图4。

四、HLA II类基因rs9273471基因型和LADA易感的关联分析

HLA II类基因rs9273471在LADA患者和正常对照中分布的比较采用卡方检验，用SPSS软件进行统计分析，由于携带rs9273471GG基因型的人群中正常人人数远高于LADA患者人数，提示GG基因型患LADA的风险低，另外两种基因型AA和AG均以GG基因型为参比。检测结果及SPSS软件分析结果如下表3所示，携带rs9273471AA基因型的人群患LADA的风险显著升高，是GG基因型人群患LADA的4.14倍，p值小于0.05，有显著性差异；携带rs9273471 AG基因型的人群患LADA的风险是GG基因型人群患LADA的1.31倍，p值大于0.05，差异不显著。

表3 LADA患者和正常对照的rs9273471基因型频率比较

注：OR:比值比；95％CI:95％置信区间，*代表显著性差异。

实施例3

用测序法检测LADA和T2DM患者HLA II类基因的rs9273471位点。挑选488例LADA患者和501例T2DM患者进行测序判断rs9273471的基因型。

LADA患者共488例，男性286例，女性202例，年龄为42.5(33-53)岁，T2DM患者501例，男性256例，女性245例，年龄为52(44-60)岁，年龄数据均用中位数(四分位数间距)表示。

T2DM患者纳入标准：①确诊为糖尿病；②自起病以来不依赖胰岛素治疗，胰岛自身抗体为阴性。排除标准：①妊娠糖尿病、其他特殊类型糖尿病；②严重感染、创伤、手术等应激情况；③合并其他自身免疫性疾病；④恶性肿瘤；⑤严重心脑血管疾病；⑥妊娠或哺乳期妇女；⑦肝肾功能不全等；⑧其他不适于纳入病例组的情况。

一、实验方法

扩增引物序列为：F：TGCATCAAGCTGAAGTTCTGTG

R：GGTGGGGATGAAAGGAGATG。

测序引物为：TGGGAATTCTGGGCAGG。扩增的产物送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。用Lasergene软件进行分析。

二、HLA II类基因rs9273471位点基因型的检测结果示意图见图5。

三、HLA II类基因rs9273471基因型和LADA易感的关联分析

HLA II类基因rs9273471在LADA患者和T2DM患者中分布的比较采用卡方检验，用SPSS软件进行统计分析，由于携带rs9273471GG基因型的人群中T2DM患者人数远高于LADA患者人数，提示GG基因型患LADA而不是T2DM的概率低，另外两种基因型AA和AG均以GG基因型为参比。检测结果及SPSS软件分析结果如下表所示，在区分LADA和T2DM时，携带rs9273471AA基因型的人群患LADA而不是T2DM的概率显著升高，患LADA而不是T2DM的概率是GG基因型的3.45倍，p值小于0.05，有显著性差异；携带rs9273471AG基因型的人群患LADA而不是T2DM的概率是GG基因型人群的1.44倍，p值小于0.05，有显著性差异。

表4 LADA患者和T2DM患者的rs9273471基因型频率比较

注：OR:比值比；95％CI:95％置信区间，*代表显著性差异。

实施例4：

检测正常对照200例，男性99例，女性101例，年龄为44(34-55)岁，年龄数据均用中位数(四分位数间距)表示。

分别检测200例确诊的LADA患者和T2DM患者，诊断标准同实施例3。其中LADA患者共200例，男性117例，女性83例，年龄为49(38.5-58)岁，T2DM患者200例，男性97例，女性103例，年龄为52(42-58)岁，年龄数据均用中位数(四分位数间距)表示。

按照实施例2、3的方法检测rs9273471的基因型，LADA、T2DM患者以及正常对照各基因型的频率与实施例2、3基本一致，进一步证明实验数据真实可信。频率如下：

表5各200例LADA患者和正常对照的rs9273471基因型频率比较

注：OR:比值比；95％CI:95％置信区间，*代表显著性差异。

表6各200例LADA患者和T2DM患者的rs9273471基因型频率比较

注：OR:比值比；95％CI:95％置信区间，*代表显著性差异。

序列表

<110> 中南大学湘雅二医院

<120> 检测rs9273471位点多态性的试剂及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA