一种获取酵母中核糖体新生肽链复合物的方法
阅读说明：本技术 一种获取酵母中核糖体新生肽链复合物的方法 (Method for obtaining ribosome nascent-chain complex in yeast ) 是由 董鸣 何慧琼 彭龙 于 2020-04-02 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种获取酵母中的核糖体新生肽链复合物的方法。所述方法包括以下步骤：(1)获取酵母样本并利用放线菌酮溶液进行前期处理；(2)将经过前期处理的酵母样本重悬于缓冲溶液II中并离心获得沉淀；(3)将步骤(2)中获得的沉淀重悬于酵母裂解液中并分装成第一份溶液和第二份溶液；(4)从步骤(3)中的第一份溶液中提取总RAN,从第二份溶液中提取RNC。利用根据本发明的方法,能够完整获取酵母中的核糖体新生肽链复合物,其与传统提取实验方法相比克服了提取酵母RNC提取操作复杂、浓度低、质量差、杂质多等缺陷。(The invention relates to a method for obtaining ribosome nascent-chain complex in yeast. The method comprises the following steps: (1) obtaining a yeast sample and carrying out pretreatment by using an cycloheximide solution; (2) resuspending the yeast sample subjected to the preliminary treatment in a buffer solution II and centrifuging to obtain a precipitate; (3) resuspending the pellet obtained in step (2) in yeast lysate and split into a first solution and a second solution; (4) extracting the total RAN from the first solution in step (3) and extracting the RNC from the second solution. By utilizing the method, the ribosome nascent-chain complex in the yeast can be completely obtained, and compared with the traditional extraction experimental method, the method overcomes the defects of complex extraction operation, low concentration, poor quality, more impurities and the like in the extraction of the yeast RNC.)
技术领域
本发明涉及翻译组测序的技术领域，尤其是涉及一种获取酵母中核糖体新生肽链复合物的方法。
背景技术
巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris) 表达系统是近年来发展起来的较为完善的，被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统，外源蛋白在毕赤酵母中的过量表达，经常伴随着其他基因表达水平的改变，通过分析相关基因表达水平的差异，便于找到影响外源蛋白表达量的关键问题。
然而，与其他细胞相比，毕赤酵母由于具有较坚固的细胞壁，尤其是处于稳定期的毕赤酵母细胞，其细胞壁更厚、通透性差，这些因素在去除细胞壁的方法中，都会对细胞内基因蛋白的表达情况造成影响。细胞壁的阻碍作用不仅增加了RNA的提取难度，而且低质量RNA直接会影响后续基因表达水平测定的准确性。
翻译组学，是近年来新发现的一个机体内调控的重要学科。根据中心法则原理，DNA转录成mRNA，而mRNA再翻译成蛋白质多肽。在mRNA根据密码子信息进行翻译的过程中，结合在mRNA上的核糖体会在RNA链上进行移动，与tRNA逐渐结合形成蛋白质多肽链（新生肽链，Nascent-chain)，也就是核糖体新生肽链复合物（Ribosome Nascent-chain Complex,RNC)。传统观念认为，基因进行了转录，就会进行翻译，而翻译组学在研究的过程中发现，转录并不等于翻译，仍然存在部分基因进行转录后不再进行翻译；而即使进行翻译的过程，不同基因的翻译比例也存在着差异，部分基因翻译比例高，而部分基本则较低；同时，翻译组学的研究过程中发现，RNC-mRNA的含量与样本中相应的蛋白表达速率也存在明显关系，不同的翻译速率决定了蛋白的表达量，甚至决定着新开蛋白的发生和表达，因些只有提取完整RNC，对正在翻译的RNC-mRNA含量进行测定，结合对应的转录组、蛋白质组学数据，推算其转录翻译效率以及不同的蛋白表达，对其细胞表型的确定、发现未知单比以及对蛋白质组学的研究具有重要意义。
目前RNC提取大多利用蔗糖密度梯度离心法对破膜后的细胞溶液进行超速离心分离，能够提取RNC，定量核糖体全长的mRNA以及新生肽链，然而此方法仅针对动物新鲜细胞有较高提取效率。通常在提取动物新鲜细胞之前，会加入相应的翻译延伸抑制剂，可进入细胞内，对正在mRNA上进行翻译的核糖体进行固定，以保持翻译时的真实状况，进而通过系列操作提取高质量的RNC，而在毕赤酵母中，特别当生长到稳定期时，其通常具有较为坚固且通透性差的细胞壁，阻止延伸抑制剂的进行，对细胞中RNC以及mRNA的提取，造成严重阻碍作用，RNC-mRNA提取的含量少、质量低，也是对毕赤酵母进行更为深入研究的一项巨大挑战。
因此，本领域中仍然需要一种能够完整获取真菌酵母（尤其是毕赤酵母）中的核糖体新生肽链复合物的方法，从而促进蛋白质转录翻译的研究及应用。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种能够完整获取毕赤酵母中核糖体新生肽链复合物的方法，其与传统提取实验方法比较克服了提取毕赤酵母RNC操作复杂、浓度低、质量差、杂质多等缺陷。
上述目的通过本发明的以下技术方案来实现：
在第一方面，提供一种获取酵母中的核糖体新生肽链复合物的方法，所述方法包括以下步骤：（1）获取酵母样本并利用放线菌酮溶液进行前期处理；（2）将经过前期处理的酵母样本重悬于缓冲溶液II中并离心获得沉淀；（3）将步骤（2）中获得的沉淀重悬于酵母裂解液中并根据实验需求分装成第一份溶液和第二份溶液；（4）从步骤（3）中的第一份溶液中提取总RAN，从第二份溶液中提取RNC。在一个优选方案中，所述检测对象为真菌酵母中的毕赤酵母。
在根据第一方面所述的方法中，通过前期采用放线菌酮做为延伸抑制剂对毕赤酵母进行前处理，对样本中正在进行翻译的RNC以及mRNA起到固定作用，保持翻译过程中的即时状态；进而采用真菌裂解液对毕赤酵母细胞壁进行裂解，破碎细胞，释放其中物质，根据不同物质的沉降度不同，采用蔗糖密度离心的方法对释放物质进行梯度密度离心，收集其中完整沉淀的RNC，并采用相关检测方法对所提核糖体新生肽链复合物进行完整度检测。
根据第一方面所述的方法，在步骤（1）中，所述前期处理包括将酵母样本在50-200ug/mL的放线菌酮溶液中室温孵育2-10min，然后在缓冲液I中孵育5-20min并离心获得沉淀。
通过利用所述技术方案，放线菌酮能够抑制细胞内翻译延伸，保存即时翻译的表达状态，起到类似固定作用，从而使得酵母样本中的核糖体新生肽链复合物能保持完整。
根据前述第一方面所述的方法，在步骤（1）中，所述缓冲溶液I为含有10-30mM pH6-8的磷酸二氢钾和5-20mM 二硫苏糖醇（DTT）和50-200ug/mL放线菌酮的溶液。
根据前述第一方面所述的方法，在步骤（2）中，所述缓冲溶液II为含有10-30mM pH6-8的磷酸二氢钾、1-2M 山梨糖醇、0.2-1mM MgCl2、100-200U/mL 酵母裂解酶、50-200ug/mL 放线菌酮的溶液。
根据前述第一方面所述的方法，在步骤（3）中，所述酵母裂解液为含有5-20mMpH7.4的Tris-HCL、3-10mM MgCl2、50-150mM KCl、1-3mM DTT、50-150ug/mL 放线菌酮和0.5-2% Triton X-100的缓冲溶液。
利用所述技术方案，采用不同的盐离子与Triton（可用作去污剂）的组合，相比现有裂解液能够对细胞壁较厚、难以裂解的真菌酵母（例如毕赤酵母，尤其是在稳定期内）的细胞壁进行有效裂解，从而获得完整的核糖体新生肽链复合物。
根据前述第一方面所述的方法，在步骤（4）中，提取总RNA包括利用提取试剂来提取总RNA。在一个优选方案中，所述提取试剂为Trizol。
根据前述第一方面所述的方法，在步骤（4）中，提取RNC包括如下步骤：（a）将第二份溶液在0-4℃的离心机中离心，获得上清液并转移至分离用蔗糖缓冲溶液中；（b）然后在0-4℃的超高速离心机中离心得到酵母样本中的RNC；（c）利用RNC提取试剂从步骤（b）中获得的RNC中提取NAC-RNA。在一个优选方案中，所述RNA提取试剂为Trizol。
通过所述技术方案，利用蔗糖密度梯度离心，能够结合不同密度的蔗糖溶液和离心力作用，根据RNC与其他物质的沉降度不一样而起到充分的分离作用。
根据前述第一方面所述的方法，在步骤（4）中，所述分离用蔗糖缓冲溶液为含有5-20mM pH7.4的Tris-HCL、3-10mM MgCl2、50-200mM KCl、1-3mM DTT、50-200ug/mL 放线菌酮的缓冲溶液。
根据前述第一方面所述的方法，在步骤（1）之后和步骤（2）之前还具有采用液氮或者干冰-乙醇体系对经过前期处理的酵母样本进行速冻并在低于-80℃的温度下储存和运输的步骤。在一个优选方案中，该温度优选为-80至-196℃。
综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：
1. 利用根据本发明的方法，能够完整获取酵母（尤其是毕赤酵母）样本中的核糖体新生肽链复合物，从而可以用于不同基因功能分析以及结合其他转录组数据进行联合分析；
2.根据本发明制备的裂解液对细胞壁的裂解效果比较好，且对RNA影响小，并且前期加入了延伸抑制剂“放线菌酮”，保证翻译的即时停止，能够保证完整度以及提供运输和保存便利，为进一步研究酵母细胞RNC提供了便利。
附图说明
以下将参考附图对本发明进行进一步的解释和说明。本领域的普通技术人员会理解，提供这些附图的目的仅仅是为了使本领域的普通技术人员能够更好地理解本发明，而无意于以任何方式限制本发明的保护范围。
图1是从分离的不同菌株中收集的不同生长时期的毕赤酵母样本的RNC-mRNA核酸电泳图，其中M：DNA marker；1-4泳道分别为：113Y-1-RNC、113Y-2-RNC、113S-1-RNC、113S-2-RNC；
图2是从分离的不同菌株中收集的不同生长时期的毕赤酵母样本的RNC-mRNA核酸Agilent2100检测图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
目前，RNC提取方法主要是利用蔗糖密度梯度离心法进行超速离心，并且其主针对的是动植物新鲜细胞，而真菌酵母（尤其是毕赤酵母）因其厚实的细胞壁阻止作用，使得其RNA以及RNC的提取难度加大，因此利用仅采用蔗糖密度梯度离心法的效果并不好。而且，由于较厚细胞壁的阻止作用，通常在无法提前固定RNA表达的情况下，也不能采用酶解的方法，因为此法需要在37度条件下进行，而该温度会影响其某些基因的表达转录和翻译情况发生变化，所提总RNA以及RNC样本中，会存在样品消耗大，杂质多，纯度低等问题，对蛋白转录翻译的研究起到干扰作用。
基于此点，本申请的发明人进行了大量的研究，并且获得了比较好的效果，并基于此研究完成了本发明。具体而言，本申请的发明人提出以下技术方案：一种获取酵母中核糖体新生肽链复合物的方法，所述方法包括以下步骤：（1）获取酵母样本并利用放线菌酮溶液进行前期处理；（2）将经过前期处理的酵母样本重悬于缓冲溶液II中并离心获得沉淀；（3）将步骤（2）中获得的沉淀重悬于酵母裂解液中并分装成第一份溶液和第二份溶液；（4）从步骤（3）中的第一份溶液中提取总RAN，从第二份溶液中提取RNC。
以下将结合具体的实施例对本发明进行进一步的详细说明。
实施一
A、不同生长时期毕赤酵母样本前处理
不同生长时期毕赤酵母样本前处理，以下是不同生长时期毕赤酵母样本前处理的制备过程：
步骤一：溶液的配置
1）放线菌酮母液：浓度为10mg/mL（Sigma-Aldrich)。
2）缓冲液I:20mM、pH 7.4的磷酸二氢钾，10mM 二硫苏糖醇（DTT），100ug/mL放线菌酮溶液；使用无菌无RNasse的水和无菌器具配制，配制完毕后溶液需要过滤除菌。
3）液氮或干冰-乙醇
步骤二：毕赤酵母样本前处理:
1）分别收集正在培养的不同时期毕赤酵母菌液，约1×107个113Y（72h和96h）细胞和113S（72h和96h）细胞，离心后收集于灭菌1.5mL EP管中用于前期预处理；
2）收集后的毕赤酵母样本加入适当量100ug/mL 放线菌酮溶液，浸没样本沉淀，重悬，室温孵育5min；
3）重悬液中加入缓冲液I，于30℃条件下孵育10min。
4）将裂解好的样本置于预冷至0-4℃的离心机中以3000×g转速下离心3min，用枪头小心吸弃上清；
5）剩余沉淀样本浸泡至适量体积液氮中，采用液氮或者干冰-乙醇体系进行速冻，可用于储存或者运输。
B、不同生长时期毕赤酵母样本RNC提取及检测
步骤一：溶液的配置
1）放线菌酮母液：浓度为10mg/mL（Sigma-Aldrich)；
2）缓冲液Ⅱ:20mM、pH 7.4的磷酸二氢钾，1.2M 山梨糖醇，0.5mM MgCl2，150U/mL 酵母裂解酶，100ug/mL 放线菌酮；配制时使用无菌无RNasse的水和无菌器具，配制完毕后溶液过滤除菌；
3）核糖体缓冲溶液：10mM、pH7.4的Tris-HCL，5mM MgCl2，100mM KCl，2mM DTT，100ug/mL 放线菌酮；使用无菌无RNasse的水和无菌器具配制，配制完毕后的溶液过滤除菌；
4）毕赤酵母裂解液：Triton X-100溶于上述核糖体缓冲溶液中，Triton X-100的终浓度为体积百分比1%；
5）分离用蔗糖溶液：蔗糖溶于上述核糖体缓冲液，其中蔗糖的终浓度为30%（W/V），预冷至0-6℃。
步骤二：毕赤酵母样本前处理:
1）采用缓冲液Ⅱ对前期预处理样本进行重悬，于冰上孵育10min；
2）将裂解好的样本置于预冷至0-4℃的离心机中以3000×g转速下离心3min，用枪头小心吸弃上清；
3）加入1ml毕赤酵母裂解液进行重悬，冰浴10min；
4）其中所有样本分装成两份，一份提取总RNA，一份提取RNC；提取总RNA样本采用RNA提取试剂Trizol,按其说明手册方法提取总RNA；
5）提取RNC样本在孵育完成后，将裂解好的样本置于预冷至0-4℃的离心机中以20000×g转速下离心10min，用枪头小心吸取上清，转移至12.5mL已提前预冷的分离用蔗糖缓冲溶液；
6）将转移后的分离用蔗糖缓冲溶液放置于已遇冷到0-4℃的超高速离心机，以185000×g转速下离心5h，所得即为不同毕赤酵母样中的RNC；
7）使用RNA提取试剂Trizol(Invitrogen公司），按其说明手册方法操作，从RNC中提取RNC-RNA。
为检测本发明方法可以从不同生长时间毕赤酵母中提取未降解的RNC-RNA，采用2%的琼脂糖将提取出来的毕赤酵母样本中RNC-RNA进行电泳分离，SybrGreen II染色，用紫外凝胶成像系统成像检测；同时采用Agilent2100对其结果进行检测。
从不同菌类收集的不同生长时间的毕赤酵母样本RNC-mRNA提取浓度的结果显示在下表1中。结果如表1中所示，所有样本的RNA纯度（以OD(260/280)表示）均在1.8-2.0之间，因此具有较好的RNA提取质量。另外，结合RNC-mRNA提取浓度，表明RNC-mRNA提取的效果很好，符合RNA高质量标准。
表1 从不同菌类收集的不同生长时间的毕赤酵母样本RNC-mRNA提取浓度
从不同菌类收集的不同生长时间的毕赤酵母样本的RNC-mRNA核酸电泳的结果和从不同菌类收集的不同生长时间的毕赤酵母样本的RNC-mRNA核酸Agilent2100检测结果分别在图1和2中示出。如图1和图2所示，所提取RNA经过电泳和Agilent2100检测，所有样本在28S、18S、5S处条带明显，无污染，证明本发明提取的毕赤酵母RNC-RNA量多，带型清晰，无杂带，无降解，因此其表明根据本发明的方法能够完整获取毕赤酵母RNC-mRNA。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，凡依本发明的精神和原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。