一种检测和定量单拷贝染色体外dna或rna的方法
阅读说明：本技术 一种检测和定量单拷贝染色体外dna或rna的方法 (Method for detecting and quantifying single-copy extrachromosomal DNA or RNA ) 是由 邓亚光 于 2020-03-31 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种准确、有效、稳定可行的检测细胞中染色体外基因序列和病毒基因的单拷贝数量和部位的方法,所述方法包括如下步骤：(1)在靶细胞的染色体中期相或细胞涂片上,利用三个一级探针与目标基因序列杂交结合；(2)利用二级探针进行杂交结合；所述二级探针为可与三个上述一级探针中的紧邻的两个一级探针序列特异性结合的核酸序列；(3)加入扩增探针,与二级探针相结合；(4)将与扩增探针相结合的标记探针进行杂交结合；(5)于荧光显微镜下进行镜检。(The invention provides a method for accurately, effectively, stably and feasible detecting the single copy quantity and the single copy position of an extrachromosomal gene sequence and a virus gene in a cell, which comprises the following steps: (1) hybridizing and combining three primary probes with a target gene sequence in the metaphase of chromosomes or cell smear of a target cell; (2) performing hybridization and combination by using a secondary probe; the secondary probe is a nucleic acid sequence which can be specifically combined with two adjacent primary probe sequences in three primary probes; (3) adding an amplification probe, and combining with the secondary probe; (4) carrying out hybridization combination on the labeled probe combined with the amplification probe; (5) microscopic examination was performed under a fluorescent microscope.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测和定量单拷贝染色体外DNA或RNA的方法。
背景技术
肿瘤是由原癌基因激活或者抑癌基因功能丢失引发的。最近的研究发现，大量的与癌症相关的基因并不在染色体上，而是会从染色体上脱落下来，变成一种大小为几百Kb到Mb不等的小型环状的 DNA，而被称为染色体外DNA(extrachromosomal DNA，ecDNA)。染色体外DNA广泛存在于肿瘤细胞中，它们的拷贝数往往比较高，相应基因的RNA拷贝数也可能较高，而且随着细胞复制或药物治疗会发生动态变化，染色体外DNA有望成为肿瘤异质性的重要标志物，也可能成为肿瘤基因治疗和耐药性的重要标志物。
染色体外DNA不仅存在于血液中，也被发现在其他体液包括胸腔积液中。染色体外DNA不仅和肿瘤相关，还可能是真核细胞内的一种应对危机的基因扩增机制，所以染色体外DNA也有可能存在于其他一些应对危机出现的细胞中，其重要性和应用途径也许非常广泛。
传统的染色体核型加染色体外DNA的分析法，在没有抓住中期分裂相的细胞中，基本上检测不到染色体外DNA，在少量的循环肿瘤细胞中分析的可能性更加渺茫。DNA显微镜技术，由于单拷贝DNA/RNA的检测信号不够强，不能满足DNA数量和位置的精准要求。病毒感染的细胞中的病毒RNA或病毒DNA的原位检测，也遇到同样的问题。
因此，本领域急需一种准确、有效、简单可行的检测细胞中染色体外DNA和RNA的单拷贝数量和部位的精准检测方法。
发明内容
针对现有技术的不足和市场需求，本发明的目的在于提供一种准确、有效、简单可行的检测细胞中染色体外基因序列的单拷贝数量和部位的方法。为了实现该目的，本发明提供的方法的步骤包括：
(1)在靶细胞的染色体中期相或细胞涂片上，利用三个一级探针与目标基因序列杂交结合；每个所述一级探针为与目标基因中部分核酸序列配对结合的核酸序列；所述目标基因序列包括DNA或 RNA序列片段；
(2)利用二级探针与步骤(1)所得物的一级探针的配对序列进行杂交结合；所述二级探针为可与三个上述一级探针中的紧邻的两个一级探针的配对序列特异性结合的核酸序列；
(3)向步骤(2)所得物加入扩增探针与二级探针相结合；所述扩增探针为生物素标记了的核酸探针；
(4)将与扩增探针特异性结合的标记探针(如亲和素蛋白质) 加入，并使之相结合；
(5)于荧光显微镜下进行镜检。
在步骤(1)当中，本发明通过与目标基因片段对应的三个一级探针结合，建立四个基因信号扩增点，从而使目标片段的特异性信号得以扩增，而非特异性结合信号不能扩增。
本发明通过一级探针修饰释放出结合位点，建立比邻杂交后探针的架桥和扩增点，然后通过步骤(3)的信号扩增处理和步骤 (4)的信号标记处理，之后便可以通过显微镜进行观察检测。
在本发明中，如图1所示，三个一级探针中，一个作为靶点探针(一级探针1)，另两个作为特异性信号探针(一级探针2，3)。通常而言，脱离染色体的基因片段或环状基因片段，可能由于缺失其中一个特异性信号探针或者由于点突变或缺失等原因，有可能造成探针不能稳定结合(例如：一级探针1或一级探针2不能结合的情况)。由于本发明采用的是三个一级探针的设计，可形成2个与扩增架桥(如图1-5所述)和4个基因信号扩增点(如图6所示)，因此可以照常检测到靶点基因序列，包括特异性点热点突变。在本发明中，单个的一级探针，不能形成信号扩增部位，最终检测不到，只有特异性的基因序列得到信号扩增并可以被检测；这种核酸特异性序列信号扩增，只扩增特异性核酸序列，而不扩增非特异性的背景信号。
在染色体中期相中，可以检测到染色体外的环状DNA，而在细胞涂片中，可以检测到包括DNA和RNA在内的相关基因或片段序列的数量。另外，在细胞涂片中，若设定染色体对照基因或片段序列，则可测出染色体外DNA数量以及在细胞中的位置(包括是否在细胞核内或细胞质内)。
在步骤(3)中，所述扩增探针是在与二级探针结合的基础上，不断产生新的结合，扩增探针是信号标记了的探针，如被Biotin或荧光标记了的探针，或有Biotin标记进一步可与荧光标记了的 Avidin蛋白质结合之类的。
通过上述说明，不难知晓，本发明中的目的片段可以是一个，也可以是多个，所述的目的片段包括核糖核酸序列或脱氧核糖核酸的序列或靶点。
所述靶细胞的染色体中期相或细胞涂片，指的是经过洗涤或固定、蛋白质酶处理后，可用于原位杂交的样本。
作为本发明的一个实施方式，所述固定是利用甲醇或乙酸进行生物样本的固定；和/或，所述蛋白质酶处理是利用包括胃蛋白酶在内的蛋白酶进行所述杂交结合前的处理。
作为本发明的一个优选技术方案，步骤(1)中，所述杂交结合为原位杂交，所用的杂交溶液由如下组分组成：
6倍稀释倍数的枸橼酸钠缓冲液、25％W/W甲酰胺、0.2％W/W 十二烷基硫酸锂和阻断液；
所述枸橼酸钠缓冲液的组分为：0.15mol/L NaCl和0.0015mol/L 柠檬酸钠；
和/或，
步骤(2)中，所述杂交结合为原位杂交，所用的杂交溶液由如下组分组成：
2nmol/L二级探针的预扩增片段、20％W/W甲酰胺、5倍稀释倍数的枸橼酸钠缓冲液、0.3％W/W十二烷基硫酸锂、10％硫酸葡聚糖和阻断液；
所述枸橼酸钠缓冲液的组分为：0.15mol/L NaCl和0.0015mol/L 柠檬酸钠。
作为本发明的一个优选技术方案，步骤(1)中，所述杂交的时间为3小时、温度为40℃；和/或，步骤(2)中，所述杂交时间为 30分钟、温度为40℃。
作为本发明一个实施方案，所述目的片段为表皮生长因子受体 (epidermaIgrowth factor receptor，简称为EGFR)。所述三个一级探针的序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示；或者，所述三个一级探针的序列分别如SEQ ID No.4、SEQID No.5和 SEQ ID No.6所示。
三个一级探针的序列具体分别为：
一级探针1：
一级探针2：
一级探针3：
或者，三个一级探针的序列具体分别为：
一级探针1：
一级探针2：
一级探针3：
作为本发明一个优选的技术方案，步骤(3)中，处理时间为 15分钟，所述扩增因子的浓度为2nmol/L。
作为本发明的一个优选的技术方案，步骤(4)中，进行所述杂交结合时，所述荧光标记探针为生物素，所用的杂交液为5倍稀释倍数的枸橼酸钠缓冲液和0.3％W/W十二烷基硫酸锂；所述枸橼酸钠缓冲液的组分为：0.15mol/L NaCl和0.0015mol/L柠檬酸钠。
作为本发明的一个优选的技术方案，进行每个步骤的处理后均需要在室温下进行洗涤处理三次；进行所述洗涤处理时，所用的洗涤溶液为：0.1倍稀释倍数的枸橼酸钠缓冲液和0.03％W/W十二烷基硫酸锂；所述枸橼酸钠缓冲液的组分为：0.15mol/L NaCl和0.0015mol/L柠檬酸钠。
本发明的有益效果：
本发明通过设计三个探针获得四个扩增点，不仅防止了单个探针与样本的随机性非特异性结合，也防止了两个个探针由于前或后任何一部分基因序列缺失而造成不能检测到的不足。同时，三个探针的设计，更有利于鉴别DNA和RNA分子结构以及检测包括基因突变和基因缺失的靶点，同时也有利于替代抗体，做病理分析。
本发明准确、有效、简单可行的检测细胞中染色体外基因序列的单拷贝数量和部位的方法。
附图说明
图1为本发明的基因拷贝原位杂交检测原理图；
图2为本发明三个一级探针的图示；
图3为本发明一级探针原位杂交的示意图，图中所示为3个一级探针特异性地结合到DNA或RNA模板上；
图4为本发明原位杂交后酶修饰结合后的一级探针示意图；
图5为本发明为一级探针杂交时，升温后，释放出二级探针结合点的示意图；
图6为本发明二级探针杂交，预扩增架桥形成和4个扩增位点建立的示意图；
图7为本发明检测原理示意图，图中，3个一级探针可形成2个与扩增架桥，4个基因信号扩增点，检测特异性基因序列；
图8至图12为无法实现本发明检测效果方法的图示；
图13为本发明实施例2的荧光检测结果图，图中左侧显示肿瘤细胞有4个EGFR的DNA拷贝数，而图中右侧显示血细胞只有2个EGFR 的DNA拷贝数；
图14为本发明实施例3的荧光检测结果图，图中左侧和中间部分显示肿瘤细胞有多个EGFR的RNA基因表达，右侧部分显示血细胞却没有该基因的表达。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
下述实施例中涉及到的原料信息及其简称：
枸橼酸钠缓冲液：简称为SSC，成分为：0.15mol/L NaCl和 0.0015mol/L柠檬酸钠；
两倍稀释倍数的上述枸橼酸钠缓冲液：2XSSC
6倍稀释倍数的上述枸橼酸钠缓冲液：6XSSC
0.1倍稀释倍数的上述枸橼酸钠缓冲液：0.1XSSC
阻断液：1％BSA(牛血清白蛋白溶液)
实施例1
检测对象为单细胞EGFR基因(epidermal growth factor receptor)DNA单个拷贝
1.将靶细胞离心至载玻片上，利用甲醇作为固定液进行固定处理后，空气干燥。
2.对靶细胞进行RNase酶处理后，进一步用0.005％W/W胃蛋白酶于37℃下处理10分钟，然后用细胞缓冲液洗涤一次。
3.在75℃下，利用75％W/W甲酰胺和2XSSC的进行DNA变性处理5分钟，再将EGFR基因的3个比邻的一级探针混合液加入，加热变性后，对处理后的细胞，采用原位杂交溶液A进行原位杂交处理3小时；
上述3个比邻的一级探针分别如下：
一级探针1：
一级探针2：
一级探针3：
上述的原位杂交溶液A由如下组分组成：
6XSSC、25％W/W甲酰胺、0.2％W/W十二烷基硫酸锂和阻断液；
4.对含有与上述一级探针配对结合的二级探针(记为二级探针 1，二级探针2，二级探针3)的基因预扩增的原位杂交溶液B进行处理30分钟。
所述原位杂交溶液B的组分为：
2nmol/L二级探针的预扩增片段、20％W/W甲酰胺、5XSSC、 0.3％W/W十二烷基硫酸锂、10％硫酸葡聚糖和阻断液。
5.将2nmol/L的扩增因子加入上述步骤4所得物，于40℃下处理15分钟。
6.用能与二级探针扩增点结合的荧光标记探针(Biotin标记)处理15分钟，再用荧光标记的streptavidin荧光标记蛋白质，与标记探针的Biotin结合，使原位基因获得荧光标记信号；所用的杂交液的组分为：
2nmol/L荧光标记探针、5XSSC、0.3％W/W十二烷基硫酸锂和阻断液。
备注，在进行上述的杂交步骤时，用洗涤溶液于室温下洗三次。所用的洗涤溶液为：0.1XSSC和0.03％W/W十二烷基硫酸锂。
7.镜检，荧光成像，软件处理后，计数EGFR的DNA拷贝数，获得检测报告。
实施例2
检测对象为肿瘤细胞单细胞EGFR基因的DNA分子
1.将靶细胞离心至载玻片上，利用甲醇作为固定液进行固定处理后，空气干燥。
2.对靶细胞进行RNase酶处理后，进一步用0.005％W/W胃蛋白酶于37℃下处理10分钟，然后用细胞缓冲液洗涤一次。
3.在75℃下，利用75％W/W甲酰胺和2XSSC的进行DNA变性处理5分钟，再将EGFR基因的3个比邻的一级探针混合液加入，加热变性后，对处理后的细胞，采用原位杂交溶液A进行原位杂交处理3小时；
上述3个比邻的一级探针分别如下：
一级探针1：
一级探针2：
一级探针3：
上述的原位杂交溶液A由如下组分组成：
6XSSC、25％W/W甲酰胺、0.2％W/W十二烷基硫酸锂和阻断液；
4.对含有与上述一级探针配对结合的二级探针(记为二级探针1，二级探针2，二级探针3)的基因预扩增的原位杂交溶液B进行处理30分钟。
所述原位杂交溶液B的组分为：
2nmol/L二级探针的预扩增片段、20％W/W甲酰胺、5XSSC、 0.3％W/W十二烷基硫酸锂、10％硫酸葡聚糖和阻断液。
5.将2nmol/L的扩增因子加入上述步骤4所得物，于40℃下处理15分钟。
6.用能与二级探针扩增点结合的荧光标记探针(Biotin标记)处理15分钟，再用荧光标记的streptavidin荧光标记蛋白质，与标记探针的Biotin结合，使原位基因获得荧光标记信号；所用的杂交液的组分为：
2nmol/L荧光标记探针、5XSSC、0.3％W/W十二烷基硫酸锂和阻断液。
备注，在进行上述的杂交步骤时，用洗涤溶液于室温下洗三次。所用的洗涤溶液为：0.1XSSC和0.03％W/W十二烷基硫酸锂。
7.镜检，荧光成像软件处理后，计数EGFR的DNA拷贝数，获得检测报告。
本实施例中，肿瘤细胞为实验组，血细胞为对照组。结果如图 13所示，图中左侧显示肿瘤细胞有4个EGFR的DNA拷贝数，而图中右侧显示血细胞只有2个EGFR的DNA拷贝数。
实施例3
检测对象为循环肿瘤细胞单细胞RNA单个拷贝
1.将靶细胞离心至载玻片上，利用甲醇作为固定液进行固定处理后，空气干燥。
2.对靶细胞用0.005％W/W胃蛋白酶于37℃下处理10分钟，然后用细胞缓冲液洗涤一次。
3.在75℃下，利用75％W/W甲酰胺和2XSSC的进行DNA变性处理5分钟，再将EGFR基因的3个比邻的一级探针混合液加入，加热变性后，对处理后的细胞，采用原位杂交溶液A进行原位杂交处理3小时；
上述3个比邻的一级探针分别如下：
一级探针1：
一级探针2：
一级探针3：
4.对含有与上述一级探针配对结合的二级探针(记为二级探针 1，二级探针2，二级探针3)的基因预扩增的原位杂交溶液B进行处理30分钟。
所述原位杂交溶液B的组分为：
2nmol/L二级探针的预扩增片段、20％W/W甲酰胺、5XSSC、 0.3％W/W十二烷基硫酸锂、10％硫酸葡聚糖和阻断液。
5.将2nmol/L的扩增因子加入上述步骤4所得物，于40℃下处理15分钟。
6.用能与二级探针扩增点结合的荧光标记探针(Biotin标记)处理15分钟，再用荧光标记的streptavidin荧光标记蛋白质，与标记探针的Biotin结合，使原位基因获得荧光标记信号；所用的杂交液的组分为：
2nmol/L荧光标记探针、5XSSC、0.3％W/W十二烷基硫酸锂和阻断液。
备注，在进行上述的杂交步骤时，用洗涤溶液于室温下洗三次。所用的洗涤溶液为：0.1XSSC和0.03％W/W十二烷基硫酸锂。
8.镜检，荧光成像，软件处理后，计数EGFR的DNA拷贝数，获得检测报告。
本实施例中，肿瘤细胞为实验组，血细胞为对照组
结果如图14所示，肿瘤细胞有多个EGFR的RNA基因表达(图中左侧和中间部分)，而血细胞却没有该基因的表达(图中右侧部分)。
序列表
<110> 宜昌美光硅谷生命科技股份有限公司
<120> 一种检测和定量单拷贝染色体外DNA或RNA的方法
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