阅读说明：本技术 利用数字pcr检测番茄溃疡病菌的方法及其使用的成套试剂 (Method for detecting tomato canker pathogen by using digital PCR and kit reagent used by method ) 是由 田茜 张红梅 赵文军 周佩 于 2020-05-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了利用数字PCR检测番茄溃疡病菌的方法及其使用的成套试剂。本发明所提供的成套试剂由引物对Cmm和探针P组成；引物对Cmm由引物F和引物R组成；引物F、引物R和探针P的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:3所示。实验证明,采用本发明所提供的方法数字PCR检测番茄溃疡病菌,特异性好、灵敏度高且重复性好,还能够有效解决检测番茄溃疡病菌中出现的假阴性的结果。本发明为检测重要检疫性病害提供了一种新的可靠的检测手段,具有重要的应用价值。(The invention discloses a method for detecting tomato canker pathogen by using digital PCR and a kit used by the method. The kit provided by the invention consists of a primer pair Cmm and a probe P; the primer pair Cmm consists of a primer F and a primer R; the nucleotide sequences of the primer F, the primer R and the probe P are sequentially shown as SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 3. Experiments prove that the method for detecting the tomato canker germ by adopting the digital PCR has the advantages of good specificity, high sensitivity and good repeatability, and can effectively solve the problem of false negative results in the detection of the tomato canker germ. The invention provides a new reliable detection means for detecting important epidemic diseases, and has important application value.)

利用数字PCR检测番茄溃疡病菌的方法及其使用的成套试剂

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及利用数字PCR检测番茄溃疡病菌的方法及其使用的成套试剂。

背景技术

番茄溃疡病菌即密执安棒形杆菌密执安亚种(C.michiganensissubsp.michiganensis，Cmm)，能够引起番茄溃疡病，寄主植株的不同龄期、品种的易感性、番茄溃疡病菌的毒力性以及外界环境的温度和湿度都会使感病植株产生不同的症状。目前，番茄溃疡病菌已经成为世界性病害，并被我国在内的20多个国家列为重要的检疫性病害。番茄溃疡病菌是使典型的种传病害，一般感染番茄溃疡病菌的植株会产生感染病菌的种子或果实，使用无带菌的种子进行种植或者无病菌的植株进行移植已经成为预防番茄溃疡病菌传播的重要方法。

番茄溃疡病菌的检测方法包括症状观察法、菌落形态观察法、植株检测法、种子检测法和致病性检测法在内的传统检测方法，以及血清学检测方法和分子生物学PCR检测方法。PCR检测方法是目前最常用的技术，但是对于低带菌量的种子样品的检测结果并不理想，会导致假阴性。此外，随着新亚种的发现，现有检测方法的特异性需要进一步确认，以确定是否可以将Cmm与其他亚种，尤其是密切相关的非致病性亚种准确区分。

数字PCR(Digital-PCR)是一种新型的定量分子检测技术，与实时荧光定量PCR相比，数字PCR的结果值不再依赖于CT值。数字PCR已成功应用于基因谱分析、产前诊断以及与癌症相关的等位基因和突变检测。

发明内容

本发明的目的是检测番茄溃疡病菌。

本发明首先保护检测番茄溃疡病菌的成套试剂，可由引物对Cmm和探针P组成；所述引物对Cmm可由引物F和引物R组成；

所述引物F可为如下a1)或a2)：

a1)SEQ ID NO:1所示的单链DNA分子；

a2)将SEQ ID NO:1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO:1具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物R可为如下b1)或b2)：

b1)SEQ ID NO:2所示的单链DNA分子；

b2)将SEQ ID NO:2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO:2具有相同功能的单链DNA分子；

所述探针P可为如下c1)或c2)：

c1)SEQ ID NO:3所示的单链DNA分子；

c2)将SEQ ID NO:3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。

所述a2)、所述b2)或所述c2)中，所述“经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加”可为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述成套试剂中，所述探针P的末端可具有荧光标记。

上述成套试剂中，所述探针P的5′末端可具有FAM荧光标记，3′末端可具有TAMRA荧光标记。

上述成套试剂中，所述引物F、所述引物R和所述探针P的摩尔比具体可为1：1：1。

上述成套试剂中的所述引物对Cmm也属于本发明的保护范围。

上述引物对Cmm中，所述引物F和所述引物R的摩尔比具体可为1：1。

本发明还保护上述任一所述成套试剂的应用，可为如下d1)或d2)或d3)：

d1)制备用于检测或辅助检测番茄溃疡病菌的试剂盒；

d2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有番茄溃疡病菌；

d3)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的番茄溃疡病菌。

本发明还保护上述任一所述引物对Cmm的应用，为如下d1)或d2)或d3)：

d1)制备用于检测或辅助检测番茄溃疡病菌的试剂盒；

d2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有番茄溃疡病菌；

d3)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的番茄溃疡病菌。

本发明还保护含有上述任一所述成套试剂或上述任一所述引物对Cmm的试剂盒。

本发明还保护所述试剂盒的制备方法，将所述引物F、所述引物R和/或所述探针P分别单独包装。

本发明还保护所述试剂盒的应用，为d2)或d3)：

d2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有番茄溃疡病菌；

d3)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的番茄溃疡病菌。

本发明还保护检测待测样品是否含有或疑似含有番茄溃疡病菌的方法。

本发明所保护的检测待测样品是否含有或疑似含有番茄溃疡病菌的方法，具体可为方法A1)，包括如下步骤：以待测样品的总DNA为模板，以上述任一所述成套试剂进行数字PCR，然后进行如下评判：如果所述成套试剂可以实现对所述总DNA的数字PCR，则待测样品中含有或疑似含有番茄溃疡病菌；如果所述成套试剂不能实现对所述总DNA的数字PCR，则待测样品不含有或疑似不含有番茄溃疡病菌。

本发明所保护的检测待测样品是否含有或疑似含有番茄溃疡病菌的方法，具体可为方法A2)，包括如下步骤：以待测样品的总DNA为模板，以上述任一所述引物对Cmm进行PCR扩增，然后进行如下评判：如果所述引物对Cmm可以实现对所述总DNA的PCR扩增，则待测样品中含有或疑似含有番茄溃疡病菌；如果所述引物对Cmm不能实现对所述总DNA的PCR扩增，则待测样品不含有或疑似不含有番茄溃疡病菌。

上述任一所述的方法中，所述待测样品可为种子或植株。所述植株具体可为番茄植株或番茄叶片。所述种子可为番茄种子。

当待测样品为植株时，待测样品的总DNA具体可为待测植株的基因组DNA。

当待测样品为种子，待测样品的总DNA具体可为待测种子的总DNA。待测种子的总DNA的获得方法如下：先处理种子，收集沉淀；再从沉淀中提取DNA，即得到待测种子的总DNA。处理种子的方法为：将种子样品倒入灭菌三角瓶中，加入适量无菌水，使种子完全覆盖，4℃浸泡过夜；取10mL浸出液，离心，收集沉淀。

本发明还保护鉴定待测菌是否为候选的番茄溃疡病菌的方法。

本发明所保护的鉴定待测菌是否为候选的番茄溃疡病菌的方法，具体可为方法B1)，包括如下步骤：以待测菌的基因组DNA或待测菌的菌液为模板，以上述任一所述成套试剂进行数字PCR，然后进行如下评判：如果所述成套试剂可以实现对所述基因组DNA或菌液的数字PCR，则待测菌为候选的番茄溃疡病菌；如果所述成套试剂不能实现对所述基因组DNA或菌液的数字PCR，则待测菌为候选的非番茄溃疡病菌。

本发明所保护的鉴定待测菌是否为候选的番茄溃疡病菌的方法，具体可为方法B2)，包括如下步骤：以待测菌的基因组DNA或待测菌的菌液为模板，以上述任一所述引物对Cmm进行PCR扩增，然后进行如下评判：如果所述引物对Cmm可以实现对所述基因组DNA或菌液的PCR扩增，则待测菌为候选的番茄溃疡病菌；如果所述引物对Cmm不能实现对所述基因组DNA或菌液的PCR扩增，则待测菌为候选的非番茄溃疡病菌。

上述任一所述的方法中，所述待测菌的菌液可为将待测菌株接种至NB液体培养基，培养获得的。

上述任一所述的方法中，所述“进行数字PCR”的反应体系具体可为20μL，包括10μL2×ddPCRTM supermix for probes(No dUTP)、1μL所述引物F水溶液、1μL所述引物R水溶液、0.5μL所述探针P水溶液、1μL模板和6.5μL双蒸水。反应体系中，引物F、引物R和探针P的浓度均为10μM。

上述任一所述的方法中，所述“进行数字PCR”的反应程序可为：95℃预变性10min；95℃变性10s；60℃退火及延伸45s，共40个循环，98℃固化微滴10min。

上述任一所述的方法中，所述“进行PCR扩增”的反应体系具体可为20μL，包括10μL480probes master、1μL引物F水溶液、1μL引物R水溶液、0.5μL探针P水溶液、1μL模板和6.5μL双蒸水。反应体系中，引物F、引物R和探针P的浓度均为10μM。

上述任一所述的方法中，所述“进行PCR扩增”的反应程序可为：95℃5min；95℃10s，60℃退火45s，40个循环。

本发明制备了番茄溃疡病菌的成套试剂，并基于该成套试剂建立了利用数字PCR检测番茄溃疡病菌的方法。实验证明，采用本发明所提供的方法数字PCR检测番茄溃疡病菌具有较高的特异性(只能够扩增出番茄溃疡病菌菌株，其他14株供试菌株的扩增结果均为阴性)；灵敏度高，实时荧光定量PCR的检出限可达到1.08×10³CFU/mL，数字PCR的检出限为10.8CFU/mL；与实时荧光定量PCR相比，数字PCR对于低拷贝数显示出更高的重现性和更高的检测率；检测人工模拟带菌种子和自然种子，不仅快速，而且能够准确的检测低带菌量种子样品。由此可见，采用本发明所提供的方法数字PCR检测番茄溃疡病菌具有良好的特异性、灵敏度高、重复性的特点，且能够有效解决检测番茄溃疡病菌中出现的假阴性的结果，为检测重要检疫性病害番茄溃疡病菌提供了一种新的可靠的检测手段。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为特异性检测结果。

图2为数字PCR方法灵敏度检测结果。

图3为实施例6中步骤一的检测结果。

图4为实施例6中步骤二的检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

新型植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)为天根生化科技(北京)有限公司的产品，货号为DP320-02。480probes master为罗氏公司的产品。2×ddPCRTMsupermix for probes(No dUTP)、微滴生成油、微滴发生卡、密封垫和96孔板均为美国Bio-Rad公司的产品。

NB液体培养基：将牛肉浸膏3.0g、蛋白胨5.0g、酵母粉0.5g和葡萄糖10.0g溶于适量无菌水，然后用无菌水定容至1000mL，调节pH值至7.0，121℃灭菌20min。

下述实施例中涉及的19株菌的菌株名称、菌株编号和来源详见表1。其中，序列1—序列5所示的5株菌均为Cmm；序列6—序列13所示的8株菌均为非Cmm的棒形杆菌；序列14—序列19所示的6株菌均能够引起番茄病(非番茄溃疡病)。

表1

注：ATCC为美国典型培养物保藏中心，NCPPB为英国国家植物致病性菌种保藏中心，ICMP为国际植物学微生物保藏中心，LMG为比利时根特大学微生物实验室。

实施例1、用于检测番茄溃疡病菌成套试剂的筛选

1、以番茄溃疡病菌基因组中的保守基因作为靶基因，设计并合成用于检测番茄溃疡病菌的成套试剂1、成套试剂2、成套试剂3和成套试剂4。每个成套试剂由正向引物、反向引物和1个探针组成。两个引物的扩增片段(即靶序列)长度在50-150bp之间。引物本身或者两个引物之间不能有可以相互配对的区域；引物与靶序列不能有错配。探针的长度最好为20-30碱基，且退火温度(Tm值)在65-70℃之间，以比引物的Tm值高出10℃为宜。

各个成套试剂中引物和探针的名称和核苷酸序列详见表2。

表2

注：探针的5′末端均具有FAM荧光标记；3′末端具有TAMRA荧光标记；引物名称最后一位为F的引物为正向引物；引物名称最后一位为R的引物为反向引物。

2、将待测菌株接种至NB液体培养基，28℃培养24-48h，得到待测菌株的菌悬液。

待测菌株分别为表1所示的19株菌。

3、以待测菌株的菌悬液为模板，采用成套试剂1、成套试剂2、成套试剂3或成套试剂4进行实时荧光PCR扩增，获得相应的CT值。

反应体系为20μL，包括10μL480probes master、1μL正向引物水溶液(浓度为10μM)、1μL反向引物水溶液(浓度为10μM)、0.5μL探针水溶液(浓度为10μM)、1μL模板、6.5μL双蒸水。

反应程序为：95℃5min；95℃10s，60℃退火45s，40个循环。

CT值的检测结果见表3。结果表明，采用成套试剂3进行实时荧光PCR扩增时，番茄溃疡病菌菌株LMG 3682扩增结果为阴性，且能够扩增非Cmm的棒形杆菌，因此成套试剂3不具有特异性；采用成套试剂2进行实时荧光PCR扩增时，仅番茄溃疡病菌菌株ICMP13696扩增结果为阳性，且能够扩增非Cmm的棒形杆菌，因此成套试剂2不仅扩增效率不好，而且不具有特异性；采用成套试剂4进行实时荧光PCR扩增时，5株番茄溃疡病菌菌株的扩增结果均为阳性，但能够扩增非Cmm的棒形杆菌，因此成套试剂4不具有特异性；采用成套试剂1进行实时荧光PCR扩增时，5株番茄溃疡病菌菌株的扩增结果均为阳性且非Cmm的棒形杆菌的扩增结果均为阴性，因此成套试剂1的扩增效率好且特异性高。

表3

序号	菌株编号	成套试剂3	成套试剂2	成套试剂4	成套试剂1
						1	ICMP13696	33.62	27.35	19.36	24.11
2	ATCC14456	30.94	-	19.47	17.96
						3	LMG 7333	30.52	-	18.26	23.96
4	ATCC10202	31.64	-	17.44	18.98
						5	LMG 3682	-	-	15.09	18.18
6	LMG 3663	35.07	-	-	-
						7	ICMP 5367	30.27	-	-	-
8	LMG 7292	31.58	-	-	-
						9	LMG 28564	31.3	19.16	18.59	-
10	LMG 28565	34.91	-	18.81	-
						11	LMG 29047	28.17	-	19.44	-
12	LMG 26806	34.63	36.52	21.36	-
						13	LMG 26808	32.08	-	20.56	-
14	ATCC 10248	-	-	-	-
						15	ATCC 13329	-	-	-	-
16	ATCC 138	-	-	-	-
						17	NCPPB 1106	-	-	-	-
18	NCPPB 701	-	-	-	-
						19	ATCC 29736	-	-	-	-

注：循环阈值(Ct)，Ct<35，阳性；否则为阴性。“-”表示没有CT值。

由此可见，成套探针1具有很好的特异性和扩增效率，不仅能够成功检测到所有供试番茄溃疡病菌菌株，而且对于其他供试菌株的检测结果均为阴性。因此，最终选择成套试剂1进行后续实验。

实施例2、利用数字PCR检测番茄溃疡病菌的方法的建立

1、待测模板的制备

(1)待测样品为菌株

将待测菌株接种至NB液体培养基，28℃培养24-48h，得到待测菌株的菌悬液。

待测菌株的菌悬液即为待测模板。

(2)待测样品为植株

采用新型植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取待测植株的总DNA，即得到待测植株的总DNA。

待测植株的总DNA即为待测模板。

(3)待测样品为种子

先处理种子，收集沉淀；再采用新型植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)从沉淀中提取待测种子的总DNA，即得到待测种子的总DNA。

处理种子的方法为：称取种子样品50g左右倒入灭菌三角瓶中，加入适量无菌水，使种子完全覆盖，4℃浸泡过夜；吸取10mL浸出液，12000rpm离心5min，收集沉淀。

待测种子的总DNA即为待测模板。

2、数字PCR扩增反应

(1)配制反应体系

反应体系甲为20μL，包括10μL 2×ddPCRTM supermix for probes(No dUTP)、1μL引物F水溶液、1μL引物R水溶液、0.5μL探针P水溶液、1μL待测模板和6.5μL双蒸水。反应体系甲中，引物F、引物R和探针P的浓度均为10μM。

反应体系乙(作为阴性对照)为20μL。反应体系乙和反应体系甲的区别在于待测模板为健康番茄种子的总DNA。

反应体系丙(作为空白对照)为20μL，反应体系丙和反应体系甲的区别在于待测模板为双蒸水。

(2)完成步骤(1)后，将反应体系(反应体系甲、反应体系乙或反应体系丙)转移至DG8cartridge微滴生成卡的sample孔位里，并在微滴生成卡oil孔位内加入70μL的微滴生成油，然后放入微滴生成仪中进行微滴生成。

(3)完成步骤(2)后，将生成的40μL微滴体系转移到96孔板上，封膜后放置于PCR仪上进行扩增。

反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性10s；60℃退火及延伸45s，共40个循环，98℃固化微滴10min。

(4)完成步骤(3)后，将所述96孔板置于微滴读取仪中进行微滴荧光的读取和数据采集，随后仪器通过分析散点图确定判定荧光阈值并自动确定阴性微滴和阳性微滴。然后进行如下判断：如果待测样品产生阳性微滴信号，则待测样品含有番茄溃疡病菌；如果待测样品不产生阳性微滴信号，则待测样品不含有番茄溃疡病菌。

实施例3、特异性检测

按照实施例2的方法，进行特异性检测。待测样品为表1所示的19株菌。

部分结果见图1(B05为LMG7333，D06为ICMP13696，F06为ATCC 14456，C07为ATCC10202，D07为LMG 3682，G03为LMG 3663，B04为ICMP 5367，E04为LMG 7292，H04为LMG26806，H05为LMG 28564)。结果表明，5株番茄溃疡病菌菌株均产生阳性微滴，其它14株菌、阴性对照和空白对照均不产生阳性微滴(此时判定为阳性微滴的荧光阈值限为972，低于972的微滴仪器判断为阴性，高于972的微滴仪器判断为阳性)。与预期结果完全一致。

由此可见，实施例1制备的成套试剂1检测番茄溃疡病菌的特异性高。

实施例4、灵敏度检测

一、模板的制备

1、将番茄溃疡病菌ICMP 13696接种至NB液体培养基，28℃培养24-48h，通过平板计数法得到浓度为1.08×10⁸CFU/mL的菌悬液，命名为菌液1。

2、完成步骤1后，取1体积份菌液1，加入9体积份的无核酸酶水，混合均匀，得到浓度为1.08×10⁷CFU/mL的菌液2。以此类推制成菌液3(浓度为1.08×10⁶CFU/mL)、菌液4(浓度为1.08×10⁵CFU/mL)、菌液5(浓度为1.08×10⁴CFU/mL)、菌液6(浓度为1.08×10³CFU/mL)、菌液7(浓度为1.08×10²CFU/mL)和菌液8(浓度为1.08×10CFU/mL)。

二、采用实时荧光PCR方法检测灵敏度

以待测菌液(菌液1、菌液2、菌液3、菌液4、菌液5、菌液6、菌液7或菌液8)为模板，采用成套试剂1、成套试剂2、成套试剂3或成套试剂4进行实时荧光PCR扩增，获得相应的CT值。

反应体系为20μL，包括10μL480probes master、1μL正向引物水溶液(浓度为10μM)、1μL反向引物水溶液(浓度为10μM)、0.5μL探针水溶液(浓度为10μM)、1μL模板和6.5μL双蒸水。

反应程序为：95℃5min；95℃10s，60℃退火45s，40个循环。

CT值的检测结果见表4。结果表明，成套试剂1的灵敏度最高，达到1.08×10³CFU/mL。

表4

注：循环阈值(Ct)，Ct<35，阳性；否则为阴性。“-”表示没有CT值。

三、采用数字PCR方法检测灵敏度

按照实施例2的方法，进行灵敏度检测。待测模板为菌液1、菌液2、菌液3、菌液4、菌液5、菌液6、菌液7或菌液8。

部分实验结果见图2(A08为菌液2，B08为菌液3，CO8为菌液4，D08为菌液5，E08为菌液6，F08为菌液7，G08为菌液8，G09为阴性对照)。结果表明，菌液1、菌液2、菌液3、菌液4、菌液5、菌液6、菌液7和菌液8中均产生阳性微滴，阴性对照和空白对照均不产生阳性微滴(此时判定为阳性微滴的的荧光阈值限为842，低于842的微滴仪器判断为阴性，高于842的微滴仪器判断为阳性)。

由此可见，采用实施例1制备的成套试剂1进行数字PCR，检测番茄溃疡病菌的灵敏度达到10.8CFU/mL。

上述结果表明，与实时荧光PCR方法相比，采用实施例1制备的成套试剂1进行数字PCR的灵敏度显著提高。

实施例5、重复性试验

重复性也是判断检测方法好坏的重要指标之一，良好的重复性是检测结果正确的重要保障。

1、实验重复三次，每次重复的步骤如下：按照实施例2的方法进行检测，待测模板为菌液2、菌液3、菌液4、菌液5、菌液6、菌液7或菌液8。

2、对三次重复产生的拷贝数进行了相对标准偏差计算(RSD，relative standarddeviation)。

检测结果见表5。3次重复的拷贝数重复性均良好，其相对标准偏差均小于25％。

由此可见，采用实施例1制备的成套试剂1检测番茄溃疡病菌具有较好的重复性。

表5

实施例6、实施例1制备的成套试剂1在检测待测番茄种子是否携带番茄溃疡病菌中的应用

番茄溃疡病菌的重要传染源就是带菌种子，带菌种子也是病原菌的长距离传播的主要方式。因此，对番茄种子进行检测是提高番茄病害的控制水平，防止病害传播扩散，保证我国番茄产业持续、健康发展的重要途径。

一、人工制备带菌番茄种子的数字PCR检测和实时荧光PCR检测

1、将番茄溃疡病菌ICMP13696单菌落接种至200mL NB液体培养基，28℃培养24-48h，获得浓度为1.08×10⁸CFU/mL的重悬液1。

2、将重悬液1进行10倍梯度稀释，得到浓度为1.08×10⁷CFU/mL的重悬液2、浓度为1.08×10⁶CFU/mL的重悬液3、浓度为1.08×10⁵CFU/mL的重悬液4、浓度为1.08×10⁴CFU/mL的重悬液5、浓度为1.08×10³CFU/mL的重悬液6、浓度为1.08×10²CFU/mL的重悬液7和浓度为1.08×10¹CFU/mL的重悬液8。

3、取健康无菌番茄种子，加入重悬液(重悬液1、重悬液2、重悬液3、重悬液4、重悬液5、重悬液6、重悬液7或重悬液8)，室温浸泡2h；之后弃重悬液，室温风干2天，得到带菌番茄种子。

4、实验重复三次取平均值，每次步骤如下：取带菌番茄种子，按照实施例2的方法，进行数字PCR。

部分检测结果见图3(B06为1.08×10⁷，C06为1.08×10⁶，D06为1.08×10⁵，E06为1.08×10⁴，F06为1.08×10³，G06为1.08×10²，H06为1.08×10，C10为阴性对照)和表6。结果表明，重悬液1、重悬液2、重悬液3、重悬液4、重悬液5、重悬液6、重悬液7和重悬液8中均产生阳性微滴，阴性对照和空白对照均不产生阳性微滴(此时判定为阳性微滴的的荧光阈值限为394，低于394的微滴仪器判断为阴性，高于394的微滴仪器判断为阳性)；且阳性液滴与带菌番茄种子中的细菌数呈正相关。

5、实验重复三次取平均值，每次步骤如下：以带菌番茄种子的总DNA为模板，采用成套试剂1进行实时荧光PCR扩增，获得相应的CT值。

反应体系为20μL，包括10μL480probes master、1μL引物F水溶液(浓度为10μM)、1μL引物R水溶液(浓度为10μM)、0.5μL探针P水溶液(浓度为10μM)、1μL模板和6.5μL双蒸水。

反应程序为：95℃5min；95℃10s，60℃45s，40个循环。

CT值的检测结果见表6。结果表明，重悬液1、重悬液2、重悬液3、重悬液4、重悬液5和重悬液6的CT平均值均小于35，为阳性；重悬液7和重悬液8的CT平均值大于35，为阴性。

表6

注：循环阈值(Ct)值：Ct<35，阳性；否则，为阴性。

由此可见，数字PCR和实时荧光PCR都可以检测番茄种子是否携带番茄溃疡病菌，但数字PCR的检测灵敏度更高、结果更准确。

二、自然条件下收集的番茄种子的数字PCR检测

实验重复三次取平均值，每次步骤如下：取待测番茄种子，按照实施例2的方法，进行数字PCR。待测番茄种子为北京市昌平植保站自然条件下收集的番茄种子，共20种，依次命名为1号-20号。

部分检测结果见图4(A03为1号，B03为2号，C03为3号，D03为4号，E03为5号，F03为6号，G03为7号，H03为8号，A04为9号，B04为10号，C04为11号，D04为11号，E04为阴性对照)。结果表明，8号、11号和12号中均产生阳性微滴，阴性对照和空白对照均不产生阳性微滴(此时判定为阳性微滴的的荧光阈值限为871，低于871的微滴仪器判断为阴性，高于871的微滴仪器判断为阳性)；待测番茄种子的阳性微滴数越多，则其携带的番茄溃疡病菌数量越多。

由此可见，实施例1制备的成套试剂1可以检测自然条件下收集的番茄种子是否携带番茄溃疡病菌，且检测结果可以反映番茄种子携带番茄溃疡病菌量。

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 利用数字PCR检测番茄溃疡病菌的方法及其使用的成套试剂

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

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<210> 2

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<212> DNA

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<400> 2

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<213> Artificial sequence

<400> 3

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