阅读说明：本技术 利用标记辅助选择将小麦抗条锈性qtl与优良农艺性状结合的方法 (Method for combining wheat stripe rust resistance QT L with excellent agronomic traits by marker-assisted selection ) 是由 周新力 胡天 钟晓 杨随庄 于 2020-04-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了利用标记辅助选择将小麦抗条锈性QTL与优良农艺性状结合的方法,具体包括以下步骤：S1：确定杂交组合；S2：常规育种；S3：基因组DNA提取；S4：分子标记辅助选择；S5：抗病性鉴定；S6：产量相关农艺性状的调查；S7：成功筛选出具有高抗性和优良农艺性状的小麦品系,对分子标记辅助育种利用QYr.nafu-2BL和QYr.nafu-3BS抗病基因资源创制新型抗病材料防控小麦条锈病具有重要意义；另外,本实验获得的未检测出含有抗性QTL但对条锈病表现高抗且农艺性状良好的小麦品系也具有进一步研究运用的价值。(The invention discloses a method for combining wheat stripe rust resistance QT L with excellent agronomic characters by marker-assisted selection, which specifically comprises the following steps of S1, determining hybridization combination, S2, conventional breeding, S3, extracting genomic DNA, S4, performing molecular marker-assisted selection, S5, identifying disease resistance, S6, investigating yield-related agronomic characters, S7, successfully screening out wheat strains with high resistance and excellent agronomic characters, and developing a novel disease-resistant material for preventing and controlling wheat stripe rust by using QYr.nafu-2B L and QYr.nafu-3BS disease-resistant gene resources in molecular marker-assisted breeding, wherein the wheat strains which do not detect the existence of QT L, have high resistance to stripe rust and have good agronomic characters and further research and application values.)

利用标记辅助选择将小麦抗条锈性QTL与优良农艺性状结合 的方法

技术领域

本发明涉及作物育种技术领域，具体为利用标记辅助选择将小麦抗条锈性QTL与优良农艺性状结合的方法。

背景技术

小麦条锈病是小麦生产上的重大病害之一。培育抗性品种，利用抗病基因控制条锈病是最经济有效，且对环境友好的防控条锈病的方式(Roebbelen and Sharp 1978；Lineand Chen1995)。随着小麦基因组中分子标记丰度的不断增加，分子标记辅助选择(Marker-assisted selection)利用这些分子标记可极大地提高育种中的效率并减少人力物力的消耗。小麦MAS的研究工作在近年来取得了丰硕成果，对分子育种产生了革命性的影响。目前，MAS因其耗时短、效率高、以及对目标性状筛选的准确性高而成为最理想的育种方式之一(Yoon et al.2015)。SSR、RGA、SNP等分子标记已被开发并广泛用于重要性状基因的定位。利用与目标基因连锁的分子标记有助于准确筛选出具有目标基因的个体，加快了目标基因渗入的过程，从而成功选育出抗病高产的品种(Rajender Singh 2004，Vishwakarma etal.2015，Varshney et al.2014)。标记辅助选择在抗病育种策略中尤其重要，因为它是在一个品种内聚合多个抗性基因唯一、快速、可靠的方法。在过去十几年中，随着小麦条锈菌小种CYR32、CYR33、CYR34的流行，特别是近年来CYR34的出现，导致国内主栽品种抗病性相继丧失(刘博等2017)，包括川麦42(含Yr26)、襄麦25、郑麦9023等主栽品种。

我国抗源比较单一，各地均有Yr26基因的使用，这使得新的毒性小种CYR34近年逐步升高，对小麦生产势必构成威胁。因此，挖掘、开发优良抗条锈基因(如：P9897)并应用到小麦抗病育种中，可弥补目前我国小麦抗条锈病基因单一和严重匮乏的现状，对于小麦条锈病的可持续控制具有十分重要的理论和现实意义。

基于此，本发明设计了利用标记辅助选择将小麦抗条锈性QTL与优良农艺性状结合的方法，通过将传统育种与MAS相结合，即节省了时间与人力物力的消耗，提高了育种的效率，也降低了进行分子实验的成本。从而更有利于通过MAS培育出抗病且高产的小麦品种以解决上述提到的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供利用标记辅助选择将小麦抗条锈性QTL与优良农艺性状结合的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：利用标记辅助选择将小麦抗条锈性QTL与优良农艺性状结合的方法，具体包括以下步骤：

S1：确定杂交组合：将P9897分别与川麦42，襄麦25，郑麦9023进行杂交，P9897作为父本，川麦42，襄麦25，郑麦9023作为母本，获得F1，并播种于田间；

S2：常规育种：在F4代之前采用混合法选择，保留所有基因型，减少尚处于高度杂合状态的优良基因的漂失，至F₄代采用系谱法选择进行人工筛选抗条锈病，株高适中，分蘖和小穗数较多，籽粒饱满的单株，继续通过单株自交，获得F₅代植株；

S3：基因组DNA提取：采取114个F₅代家系及四个亲本的每个单株的叶片提取基因组DNA，采用2×CTAB法进行提取；

S4：分子标记辅助选择：使用与P9897中的QYr.nafu-2BL和QYr.nafu-3BSQTL位点连锁的分子标记对三个杂交组合的F₅代后代家系进行筛选，并进行QTL检测；

S5：抗病性鉴定：三个杂交组合的114个F₅家系群体种植于江油实验田内，对于F5家系群体选用反应型和最大严重度作为抗病性分析指标，于M169发病严重度达到50％及90％时进行抗病性鉴定，得到试验的鉴定结果；

S6：产量相关农艺性状的调查：对114个F₅家系和亲本的株高，分蘖数，小穗数进行人工调查并记录，在收种之后称量千粒重。

S7：利用田间农艺性状的综合评估和抗性QTL的分子检测结果，成功筛选出具有高抗性和优良农艺性状的小麦品系。

优选的，所述步骤S4中，QTL检测的具体步骤为：使用与QYr.nafu-2BL和QYr.nafu-3BS QTL位点连锁的分子标记：Xbarc160、Xcfd73、Xgwm120、Xbarc87以及Xbarc133共五个标记对三个杂交组合的114个F₅代家系以及四个亲本进行PCR扩增及电泳。

优选的，所述步骤S7中，田间农艺性状的综合评估为：结合各亲本的株高、分蘖数、小穗数、千粒重的数据，筛选出株高在80～100cm之间，分蘖数≥4，小穗数≥17，千粒重≥42g的后代家系。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明获得的对条锈病高抗且农艺性状优良的小麦品系，对分子标记辅助育种利用QYr.nafu-2BL和QYr.nafu-3BS抗病基因资源创制新型抗病材料防控小麦条锈病具有重要意义；另外，本实验获得的未检测出含有抗性QTL但对条锈病表现高抗且农艺性状良好的小麦品系也具有进一步研究运用的价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本感染类型(IT)分布图；

图2为本发明病害严重程度(DS)分布；

图3为本发明株高的频率分布图；

图4为本发明小穗数的频率分布图；

图5为本发明分蘖数的频率分布图；

图6为本发明千粒重的频率分布图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种技术方案：利用标记辅助选择将小麦抗条锈性QTL与优良农艺性状结合的方法，具体包括以下步骤：

S1：确定杂交组合：将P9897分别与川麦42，襄麦25，郑麦9023进行杂交，P9897作为父本，川麦42，襄麦25，郑麦9023作为母本，获得F1，并播种于田间；

S2：常规育种：在F4代之前采用混合法选择，保留所有基因型，减少尚处于高度杂合状态的优良基因的漂失，至F₄代采用系谱法选择进行人工筛选抗条锈病，株高适中，分蘖和小穗数较多，籽粒饱满的单株，继续通过单株自交，获得F₅代植株；通过此种方式进行人工筛选与淘汰，获得的F₅代后代家系各性状已趋稳定；

S3：基因组DNA提取：采取114个F₅代家系及四个亲本的每个单株的叶片提取基因组DNA，提取基因组DNA采用2×CTAB法进行提取；

S4：分子标记辅助选择：使用与P9897中的QYr.nafu-2BL和QYr.nafu-3BSQTL位点连锁的分子标记对三个杂交组合的F₅代后代家系进行筛选，以期获得具有单个QTL和两个QTL的家系，并进行QTL检测；

QTL检测的具体步骤为：使用与QYr.nafu-2BL和QYr.nafu-3BSQTL位点连锁的分子标记：Xbarc160、Xcfd73、Xgwm120、Xbarc87以及Xbarc133共五个标记对三个杂交组合的114个F₅代家系以及四个亲本进行PCR扩增及电泳。

根据QTL检测的结果将三个杂交群体的后代分为四类：含有QYr.nafu-2BL、含有QYr.nafu-3BS、含有以上两个QTL、以及不含有QTL。在川麦42/P9897的F5家系中，4个家系含有QYr.nafu-2BL，3个家系含有QYr.nafu-3BS，7个家系含有这两个QTL，5个家系不含有QTL。在襄麦25/P9897的F5家系中，25个家系含有QYr.nafu-2BL，9个家系含有QYr.nafu-3BS，15个家系含有这两个QTL，13个家系不含有QTL。在郑麦9023/P9897的F5家系中，8个家系含有QYr.nafu-2BL，10个家系含有QYr.nafu-3BS，5个家系含有这两个QTL，10个家系不含有QTL.在三个杂交组合的所有F5家系，至少含有1个QTL的占比分别为74％，79％，and70％，所以，共计有86个家系至少检测到了1个QTL，有28个家系没有检测到QTL。

表1：在无QTL，2BQTL，3BQTL，2B+3BQTL中三个杂交组合的F5代家系汇总表

杂交组合	无QTL	2BQTL<sup>a</sup>	3BQTL<sup>b</sup>	2B+3BQTL	QTL总数
						川麦42/P9897	6	6	3	4	13
襄麦25/P9897	24	22	6	10	38
						郑麦9023/P9897	14	9	9	1	19

其中，2BQTL^a代表QYr.nafu-2BL，3BQTL^b代表QYr.nafu-3BS。

S5：抗病性鉴定：三个杂交组合的114个F5家系群体种植于江油实验田内，对于F5家系群体选用反应型和最大严重度作为抗病性分析指标，于M169发病严重度达到50％及90％时进行抗病性鉴定，得到试验的鉴定结果；

根据田间试验的鉴定结果，条锈菌在各个环境下都充分发病。三个杂交组合的114个F5家系均表现不同程度的抗病性，而P9897表现为高抗(IT＝2，DS＝5％)，川麦42、襄麦25、郑麦9023则表现为中抗(IT＝6、5、5，DS＝40％、30％、30％)。川麦42/P9897、襄麦25/P9897、郑麦9023/P9897的后代家系中主要表现为高抗，分别占比89.5％、88.7％、93.9％；分别有5.3％、6.5％、3％的家系表现为中抗，而分别有5.3％、4.8％、3％表现为免疫，三个杂交组合中均无高感家系，如图1-2所示的感染类型(IT)和病害严重程度(DS)的分布图，表示了3个杂交品种在不同成虫生长阶段的114条F5株系的数据，以及表2。

表2：免疫，抵抗，中度感染，易感染三个杂交组合的F5系的感染类型汇总表

S6：产量相关农艺性状的调查：对114个F5家系和亲本的株高，分蘖数，小穗数进行人工调查并记录，在收种之后称量千粒重。

S7：利用田间农艺性状的综合评估和抗性QTL的分子检测结果，成功筛选出具有高抗性和优良农艺性状的小麦品系。田间农艺性状的综合评估为：结合各亲本的株高、分蘖数、小穗数、千粒重的数据，筛选出株高在80～100cm之间，分蘖数≥4，小穗数≥17，千粒重≥42g的后代家系。并结合QTL检测的结果(即至少含有一个P9897中的抗性QTL)共有30个F5家系符合上述标准，其中，川麦42/P9897共筛选出6个家系，襄麦25/P9897共筛选出20个家系，郑麦9023/P9897共筛选出4个家系，如图3-6所示，农艺性状分布。3个杂交组合的114个F5株系在小麦成熟期的数据，3个杂交组合s(A，B，C，D)品种的114个F5株系株高、小穗数、分蘖数和千粒重的频率分布。以及表3。

表3：父本行和所选行的详细信息汇总表，

在这之中川麦42/P9897-3、襄麦25/P9897-25、襄麦25/P9897-26、襄麦25/P9897-27、襄麦25/P9897-39、襄麦25/P9897-40、襄麦25/P9897-56、襄麦25/P9897-59、襄麦25/P9897-60、襄麦25/P9897-78、郑麦9023/P9897-92、郑麦9023/9897-105这12个家系在满足上述农艺性状及抗病性的标准下，同时具有QYr.nafu-2BL和QYr.nafu-3BS两个抗性QTL位点，具有良好的应用前景。

目前已知川麦42含有Yr26抗病基因，利用其两侧的分子标记对川麦42/P9897F5代家系进行检测，得出有63.2％的家系含有Yr26。再结合上述结果，发现川麦42/P9897-3、川麦42/P9897-11、川麦42/P9897-12、川麦42/P9897-15、川麦42/P9897-19这五个家系在满足上述标准的情况下，还含有Yr26抗病基因，故具有良好的应用前景。

具体工作原理如下所述：

分子标记辅助选择育种(MAS)大大提高了育种的效率，减小了人力物力的消耗，但其高昂的分子实验的耗费成为了其应用推广的最大阻碍。本研究将常规育种与MAS相结合，对三个杂交组合在F4代之前进行混合法选择，之后在F4代开始系谱法选择进行人工筛选，随后使用分子标记检测F5家系中的抗性QTL。再利用田间农艺性状的综合评估和抗性QTL的分子检测结果，成功筛选出30个对小麦条锈病具有高抗性和优良农艺性状的小麦品系。这些小麦品系对小麦的抗病育种具有重要意义。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。