阅读说明：本技术 一种消化道腺病毒的pcr荧光检测试剂盒及其应用 (PCR fluorescence detection kit for digestive tract adenovirus and application thereof ) 是由 马东礼 刘孝荣 邢志浩 姜含芳 邓栩文 于 2020-04-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒及其应用,属于生物技术领域。消化道腺病毒主要包括人类腺病毒40型和41型,该试剂盒针对人类腺病毒40型和41型设计特异性引物和探针以及PCR反应体系,其中特异性引物和探针由人类腺病毒40型及41型全基因组的共同序列、内参片段的特异性引物和探针组成。该试剂盒能精准检测到40型及41型的人类腺病毒,且不会受到其它非40型、41型人类腺病毒及其它微生物的序列影响,实现高敏感性和高特异性,解决了目前引物设计中敏感性和特异性不能均优的难点问题,同时本发明采用“鸬鹚”生物大数据挖掘系统,根据拷贝数、引物二聚体和序列空间结构等关键技术参数,寻找最佳靶序列,使检测效率、精准度大大提高。(The invention discloses a PCR fluorescence detection kit for digestive tract adenovirus and application thereof, belonging to the technical field of biology. The digestive tract adenovirus mainly comprises human adenovirus type 40 and type 41, and the kit designs specific primers and probes and a PCR reaction system aiming at the human adenovirus type 40 and type 41, wherein the specific primers and probes consist of common sequences of human adenovirus type 40 and type 41 whole genomes and specific primers and probes of internal reference fragments. The kit can accurately detect the human adenoviruses of type 40 and type 41, is not influenced by the sequences of other human adenoviruses of type 40 and type 41 and other microorganisms, realizes high sensitivity and high specificity, solves the difficult problem that the sensitivity and the specificity cannot be excellent in the current primer design, and simultaneously searches an optimal target sequence by adopting a cormorant biological big data mining system according to key technical parameters such as copy number, primer dimer, sequence space structure and the like, so that the detection efficiency and the accuracy are greatly improved.)

一种消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒及其应用。

背景技术

腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈二十面体排列构成。衣壳内部为线状双链DNA分子，自上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了100余个血清型，其中人类腺病毒有52种，分为A、B、C、D、E和F六个亚群(subgroup)。消化道腺病毒属于F亚群，且以40和41两个型别为主。

人类腺病毒可诱发多种感染，包括呼吸道感染、眼部感染、消化道感染等。许多人类腺病毒在肠道细胞中复制，随粪便排出。大多血清型与胃肠道疾病无关，但人类腺病毒40型和41型可致病，是引起婴幼儿与年少儿童(4岁以下)的胃肠炎，致腹痛、腹泻的主要原因。

消化道腺病毒的常用鉴定方法如下：(1)培养：病毒株培养特异性较高，是获得病毒株并进行流行病学调查所必需的，技术要求高，操作复杂，临床实验室普遍没有开展；(2)酶联免疫试验检测细胞毒素抗体：间接反映感染状况，检测病毒抗体快速，方法重复性差、敏感性低、特异性不强；(3)胶体金法检测细胞毒素的抗原：敏感性低和重复性差，特异性较好。由于上述的实验室检查方法分别有敏感性差，特异性低，检测周期长，设备要求高，重复性差等缺点，使检查结果经常出现假阳性或假阴性，导致误诊、漏诊。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒，该试剂盒可特异、敏感、准确、快速地检测粪便样本中的消化道腺病毒。

为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：利用自主研发的“鸬鹚”生物大数据挖掘系统，在国际权威数据库GenBank核酸数据库(Nucleotide)中下载人类腺病毒40型及41型的参照序列(40型GenBank：KU162869.1，序列长度34,210bp；41型GenBank：KY316161.1，序列全长34,198bp)。以此参照序列为模板，建立候选短片段文库、片段特异性和敏感性评估、引物设计、引物性能评估、临床样本验证等，在此基础上开发出一种敏感性高、特异性强、成本低、检测通量更大的消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒。基因是识别生物物种的名片，寻找特异而保守的基因序列如同大海捞针，是决定试剂盒特异性、敏感性的关键。本发明的创新之处在于：1)此试剂盒能精准检测到不同血清型的消化道腺病毒，且不会受到其他非消化道腺病毒(特别是呼吸道腺病毒)以及其它微生物的序列影响，实现高敏感性和高特异性，解决了目前引物设计中敏感性和特异性不能均优的难点问题；2)本发明所采用的“鸬鹚”生物大数据挖掘系统，可以对数千万碱基对的全基因组序列进行全面筛查，找到几十个至几百个特异保守序列，再根据拷贝数、引物二聚体和序列空间结构等关键技术参数二次筛查，优中选优，找到最佳靶序列，使检测效率、特异性、敏感性相比于常规设计方法提高10倍。本发明专利中的引物设计方法采用自主研发的鸬鹚大数据挖掘系统，在消化道腺病毒全基因组(长度约34000bp)范围内搜寻最优的引物和探针片段，相比传统方法只针对Hexon基因(约3000bp)设计引物，扩大了搜索范围10倍以上，而且所用时间较短，效率更高。

本发明所述消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒包括反应液A与反应液B，反应液A包括两对引物和两个探针：人类腺病毒40型及41型的特异性引物对SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2以及对应的FAM标记的探针SEQ ID NO.3；内参片段引物对SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5以及对应的HEX标记的探针SEQ ID NO.6。其中HEX、FAM为荧光基团，TAMRA为淬灭基团。反应液B包括热启动酶和UNG酶。

本发明所述消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒中使用的阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为克隆人类腺病毒40型及41型的目的基因序列的工程菌悬液。

内参片段的DNA序列SEQ ID NO.7如下所示：

5’-TCACAAGCAGGAGTGTGCCAGGAGAAGGCCAAACCATCCAGTGCCGGTGGTTTGACCACGAGGAGTGCATCCTGCACGGAGTCACTGAGCTCGTGACCTCCACGCTGCTCGTCCCCTGCGCTATCGAGAGGGCACTCTCTGTGTCTCAGCTGGTGCCGCTGGCGCAGAGTGTTTTGGGCCCCTTAAAGCTCAGCATGGCTGGTTCTGGAGAGATGGAAAAGAGAAAGGATTTCCCCCATTTGGGTGCCTCGGGCATGTGGAGGAAGGTGGTCCGGCGAACGAAGCAGGGCTGCGTGAAGGGGATCTGATAACCCACGTCAACGGAGAGCCAGTCCATGG-3’；

引物与探针的组合如下：

目的片段的上游引物SEQ ID NO.1：5’-TTCACCTCTGTTTGCTGCAC-3’；

目的片段的下游引物SEQ ID NO.2：5’-AGGTAGTCCGCAGTTTGGAA-3’；

目的片段的探针SEQ ID NO.3：

5’-FAM-TGCCATCTGCAGCATTGCCACT-TAMRA-3’；

内参片段的上游引物SEQ ID NO.4：5’-GGCATGTGGAGGAAGGTGGT-3’；

内参片段的下游引物SEQ ID NO.5：5’-CCATGGACTGGCTCTCCGTT-3’；

内参片段的探针SEQ ID NO.6：

5’-HEX-ACGCAGCCCTGCTTCGTTCGCCG-TAMRA-3’。

利用上述两对引物和探针可同时针对40型及41型人类腺病毒的特异目的片段和内参片段进行双重荧光PCR扩增。

本发明还提供了该试剂盒的应用，包括如下步骤：

(1)提取待测样品DNA；

(2)进行PCR扩增：以待测样品DNA为模板，按一定比例加入PCR反应液A和PCR反应液B，其中反应液A包括12.5mM Tris-HCl,pH9.0、50mM KCl、0.13％X-100、3.13mMMgCl₂、0.45mM dATP、0.45mM dGTP、0.45mM dCTP、0.79mM dUTP、两对引物SEQ ID NO.1和2、4和5，浓度都为0.3-0.7μM，两个探针SEQ ID NO.3、6，浓度都为0.14-0.16μM；反应液B包括20mM Tris-HCl、100mM KCl、0.1mM EDTA、1mM DTT、50％Glycerine、0.5％20、1-3U/μL热启动酶、0.1-0.3U/μL UNG酶，进行PCR扩增，同时以阴性质控品、阳性质控品代替待测样品DNA，作为模板，加入PCR反应液A和PCR反应液B，进行阴性质控品和阳性质控品的PCR扩增；

(3)根据Ct值进行结果判定。

进一步的，所述步骤(2)中，反应液A中含有两对引物SEQ ID NO.1和2、4和5，浓度都为0.5μM，两个探针SEQ ID NO.3、6，浓度都为0.15μM；PCR反应液B含有热启动酶和UNG酶，其浓度分别为2U/μL和0.2U/μL。

进一步的，待测样品DNA与反应液A、反应液B的体积比为3：46：1。

进一步的，PCR扩增程序的参数如下：

50℃120s，1个循环；

95℃600s，1个循环；

95℃、15s，55℃、45s(收集荧光)，40个循环；

37℃、20s，1个循环。

进一步的，所述阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为克隆人类腺病毒40型及41型的目的基因序列的工程菌悬液。

该克隆人类腺病毒40型及41型的目的基因序列的工程菌的构建过程如下：

1.目的片段扩增

1.1用Takara Taq^TMHot Start Version(Lot#AIG1122A)按照表1对目的片段进行扩增

表1

1.2 PCR参数

95℃300s，1个循环；

95℃、15s，55℃、30s，72℃、30s，40个循环；

72℃、300s，1个循环；

37℃、20s，1个循环。

1.3用琼脂糖凝胶电泳验证。

2.末端平滑DNA片段的3’末端加“A”反应

用Takara DNA A-Tailing Kit进行工程菌的构建

2.1在微量离心管中按照表2配制加“A”反应液，全量为50μL。

表2

试剂名称	使用量
		10×A-Tailing Buffer	5μL
dNTP Mixture	4μlL
		A-Tailing Enzyme	0.5μL
末端平滑DNA片段	0.5～5μg
		灭菌水	upto50μL

2.272℃反应20分钟。

2.3冰中静置1～2分钟。

3.A-Tailing DNA片段与T载体的连接转化

3.1在微量离心管中按照表3配制DNA溶液，全量为5μL。

表3

试剂名称	使用量
		pMD18-TVector*	1μL
上述1-③的A-TailingDNA溶液	0.1～0.3pmol
		灭菌水	upto5μL

*pMD18-T Vector与CodeNo.6011为同种制品，本T载体1μL(50ng)约为0.03pmol。

3.2加入5μL(等量)的SolutionI*

*Solution I是CodeNo.6022 DNA Ligation Kit Ver.2.1的组份。

3.3 16℃反应30分钟*。

*室温(25℃)也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。

5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。

长片段DNA(2kb以上)进行克隆时，连接反应时间请延长至数小时。

3.4全量(10μL)加入至100μLJM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。

3.5 42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。

3.6加入890μL SOC培养基，37℃振荡培养60分钟。

3.7在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落，计数白色、蓝色菌落。

3.8挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。

3.9 PCR法检测插入片段大小正确的菌株即为克隆人类腺病毒40型及41型的目的基因序列的工程菌，并对其进行保藏。

附图说明

图1为实施例1中PCR扩增条件温度曲线图。

图2为实施例1中引物对1和探针1组FAM通道PCR扩增曲线图。

图3为实施例1中引物对1和探针1组HAX通道PCR扩增曲线图。

图4为实施例1中引物对2和探针2组FAM通道PCR扩增曲线图。

图5为实施例1中引物对2和探针2组HAX通道PCR扩增曲线图。

图6为实施例1中引物对3和探针3组FAM通道PCR扩增曲线图。

图7为实施例1中引物对3和探针3组HAX通道PCR扩增曲线图。

图8为实施例2中PCR扩增条件温度曲线图。

图9为实施例2中特异性实验FAM通道PCR扩增曲线图。

图10为实施例2中特异性实验HEX通道PCR扩增曲线图。

图11为实施例2中敏感性实验FAM通道PCR扩增曲线图。

图12为实施例2中敏感性实验HEX通道PCR扩增曲线图。

具体实施方式

实施例1

消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒引物的筛选

利用“鸬鹚”生物大数据挖掘系统，设计三对引物、三个探针，收集24个临床标本，反复试验探索最佳试验条件，比较三对引物探针的敏感性、特异性、准确度，保留最优者。

1.样本采集

取腹泻粪便，及时送检。收集样本24个，所有临床样本均来源于深圳市儿童医院。

2.核酸提取

2.1取内参片段(2×10⁴copes/mL)1μl加入到50μl核酸提取液(10mM Tris-HCl,pH＝8.0；25mM NaOH；1％TritonX-100；1％NP-40；1mM EDTA；2％Chelex100)中；

2.2用拭子适量蘸取粪便样本(约50mg)，若样本为液体，则浸泡整个拭子头，加入1.0mL生理盐水，震荡混匀，室温静置5min或6000g离心1min，使大颗粒粪便残渣沉淀下去；

2.3取50μl样本上清液置于一洁净EP管中，并加入50μl核酸提取液，震荡混匀；

2.4将混合样本放入干浴锅中，100℃加热10min；

2.5 12000g离心5min，上清液即为粪便的DNA提取液(样本)，备用。

3.引物设计

实验室共设计3个引物对和3个探针，引物对和探针组合如下：

3.1引物对1和探针1序列：

目的片段的上游引物1SEQ ID NO.1：5’-TTCACCTCTGTTTGCTGCAC-3’；

目的片段的下游引物1SEQ ID NO.2：5’-AGGTAGTCCGCAGTTTGGAA-3’；

目的片段的探针1SEQ ID NO.3：

5’-FAM-TGCCATCTGCAGCATTGCCACT-TAMRA-3’；

3.2引物对2和探针2序列：

目的片段的上游引物2SEQ ID NO.8：5’-CGCAGTCTCCCACCTTGATA-3’；

目的片段的下游引物2SEQ ID NO.9：5’-GTGCAGCAAACAGAGGTGAA-3’；

目的片段的探针2SEQ ID NO.10：

5’-FAM-CGGATTGTCTTCCCGCCTTGCT-TAMRA-3’；

3.3引物对3和探针3序列：

目的片段的上游引物3SEQ ID NO.11：5’-AACTGACGATTCTGGCCTCT-3’；

目的片段的下游引物3SEQ ID NO.12：5’-ACACTTAGGCGGAGGAATGT-3’；

目的片段的探针3SEQ ID NO.13：

5’-FAM-TCAAGCTCTTTGGTATGGGCCTTTCCA-TAMRA-3’；

4.反应体系

PCR反应液包括PCR反应液A、PCR反应液B。其中反应液A包括12.5mM Tris-HCl,pH9.0、50mM KCl、0.13％X-100、3.13mM MgCl₂、0.45mM dATP、0.45mM dGTP、0.45mMdCTP、0.79mM dUTP、两对引物SEQ ID NO.1和2、4和5，浓度都为0.5μM，两个探针SEQ IDNO.3、6，浓度都为0.15μM；反应液B包括20mM Tris-HCl、100mM KCl、0.1mM EDTA、1mM DTT、50％Glycerine、0.5％20、2U/μL热启动酶、0.2U/μL UNG酶。

体系加样量如下：

表4

组分名称	组成成分	加量
			PCR反应液A	引物、探针	46μl
PCR反应液B	热启动酶、UNG酶	1μl
			DNA提取液(样本)		3μL
总体积		50μL

所述PCR反应液A分别有3个组合：(1)包括两组引物对SEQ ID NO.1和2、4和5，两个探针SEQ ID NO.3、6；(2)包括两组引物对SEQ ID NO.8和9、4和5，两个探针SEQ ID NO.10、6；(3)包括两组引物对SEQ ID NO.11和12、4和5，两个探针SEQ ID NO.13、6。

所述PCR反应液B包括热启动酶和UNG酶。

5.上机检测

对应上述加样体系，将试剂盒中各成份分别加入PCR反应管中，进行PCR扩增反应，具体反应步骤如下：

50℃120s，1个循环；

95℃600s，1个循环；

95℃、15s，55℃、45s(收集荧光)，40个循环；

37℃、20s，1个循环；

检测结果如图1所示。

6.结果判定(根据Ct值及扩增曲线形态)

表5

7.检测结果：

引物对1和探针1组、引物对2和探针2组、引物对3和探针3组三个组合的内参(HAX)都能正常扩增，呈现出正常的S型曲线，如图3、5、7所示；对于目的基因的扩增，引物对1和探针1组所呈现的曲线相对于其他两个引物对和两个探针的组合表现出更好的线性关系和更低的Ct值，如图2、4、6所示，所以选择引物对1和探针1作为试剂盒所用的引物对和探针。

实施例2

消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒特异性及敏感性评价

1.样本准备：

(1)阳性样本：培养克隆人类腺病毒40型及41型的目的基因序列的工程菌并提取质粒，用Qubit测定浓度，然后计算其浓度，并将质粒用AEbuffer以10倍的稀释度稀释至5.0×10¹⁰copies/mL～5.0×10²copies/mL九个浓度梯度。

(2)阴性样本：生理盐水，大肠埃希菌、沙门菌群、屎肠球菌、粪肠球菌(粪便培养得到的细菌，质谱及Sanger测序确证)的核酸，以及从粪便中提取的轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、肠道病毒71型、柯萨奇A16的核酸(Sanger测序确证)。

2.反应体系：

PCR反应液包括PCR反应液A、PCR反应液B。其中反应液A包括12.5mM Tris-HCl,pH9.0、50mM KCl、0.13％X-100、3.13mM MgCl₂、0.45mM dATP、0.45mM dGTP、0.45mMdCTP、0.79mM dUTP、两对引物SEQ ID NO.1和2、4和5，浓度都为0.5μM，两个探针SEQ IDNO.3、6，浓度都为0.15μM；反应液B包括20mM Tris-HCl、100mM KCl、0.1mM EDTA、1mM DTT、50％Glycerine、0.5％20、2U/μL热启动酶、0.2U/μL UNG酶。

体系加样量如下：

表6阴性样本孔

组分名称	组成成分	加量
			PCR反应液A	引物、探针	46μl
PCR反应液B	热启动酶、UNG酶	1μl
			阴性样本	生理盐水，菌及病毒的核酸	3μL
总体积		50μL

表7阳性样本孔

组分名称	组成成分	加量
			PCR反应液A	引物、探针	46μl
PCR反应液B	热启动酶、UNG酶	1μl
			阳性样本	9个浓度重组质粒	3μL
总体积		50μL

3.上机检测：

对应上述加样体系，将试剂盒中各成分分别加入PCR反应管中，进行PCR扩增反应，具体反应步骤如下：

50℃120s，1个循环；

95℃600s，1个循环；

95℃、15s，55℃、45s(收集荧光)，40个循环；

37℃、20s，1个循环；

结果如图8所示。

4.结果判定(根据Ct值)

表8

5.检测结果：

特异性实验中，在保证PCR内参(HEX通道)呈阳性的前提下(如图10)，阴性样本(FAM通道)的扩增曲线不呈S型曲线，四种细菌及五种病毒的扩增曲线一致呈阴性(如图9)，表明该试剂盒引物对和探针有很强的特异性；在敏感性实验中，在PCR内参(HEX通道)呈阳性的前提下(如图12)，阳性样本(FAM通道)在5.0×10¹⁰copies/mL～5.0×10²copies/mL之间有很好的线性关系(如图11)，最低检测线5.0×10²copies/mL，表现出很高的敏感性。

实施例3

本发明所述消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒与一代测序的比对实验

1.样本采集

取腹泻粪便，及时送检。共收集样本148个，所有临床样本均来源于深圳市儿童医院。

2.一代测序引物设计

根据人类腺病毒40型及41型的全基因组的共同序列，用“鸬鹚”生物大数据挖掘系统设计一代测序引物。

一代测序的上游引物3SEQ ID NO.14：5’-CCAACTCCAACCAAGCAATAC-3’；

一代测序的下游引物3SEQ ID NO.15：5’-GACAGTAGAGGGTGCTCTTAAC-3’；

3.普通PCR及一代测序

(1)引物溶解，使引物浓度为10μM；

(2)使用一代测序引物进行普通PCR，试剂为PromegeTaq，模板量3.0ul。

(3)PCR体系：

表9

10×buffer	5ul
		25mM Mg<sup>2+</sup>	5ul
dNTP	4ul
		引物(总)	1.6ul
AntiTaq-Taq	0.5ul
		PCR水	30.9ul
模板	3.0ul

(4)PCR条件：

(5)配制2％的琼脂糖凝胶，电泳检测(130V，40min)，点样量2.5ul

(6)得到普通PCR阳性样本，将产物进行一代测序。

4.检测结果

检测结果如表10所示，在148个粪便样本中：(1)本发明所用试剂盒检测出26个消化道腺病毒阳性，122个消化道腺病毒阴性；(2)一代测序检测出24个消化道腺病毒阳性，有124个消化道腺病毒阴性；

表10

由上表可知，本发明试剂盒的敏感性为91.67％；特异性为96.77％，由此对比得出本试剂盒有着极高的敏感性和特异性。一代测序所需配备专用仪器，且价格昂贵，操作繁琐，且在测序先扩增的电泳检测容易发生气溶胶污染，而本发明检测通量大，成本低，兼容性好，能在不同的实时荧光定量PCR仪上使用，应用场景可以扩大到基层医学实验室。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 深圳市儿童医院

<120> 一种消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒及其应用

<130> 2020.4.12

<141> 2020-04-29

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ttcacctctg tttgctgcac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

aggtagtccg cagtttggaa 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

tgccatctgc agcattgcca ct 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ggcatgtgga ggaaggtggt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ccatggactg gctctccgtt 20

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

acgcagccct gcttcgttcg ccg 23

<210> 7

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

tcacaagcag gagtgtgcca ggagaaggcc aaaccatcca gtgccggtgg tttgaccacg 60

aggagtgcat cctgcacgga gtcactgagc tcgtgacctc cacgctgctc gtcccctgcg 120

ctatcgagag ggcactctct gtgtctcagc tggtgccgct ggcgcagagt gttttgggcc 180

ccttaaagct cagcatggct ggttctggag agatggaaaa gagaaaggat ttcccccatt 240

tgggtgcctc gggcatgtgg aggaaggtgg tccggcgaac gaagcagggc tgcgtgaagg 300

ggatctgata acccacgtca acggagagcc agtccatgg 339

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

cgcagtctcc caccttgata 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

gtgcagcaaa cagaggtgaa 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

cggattgtct tcccgccttg ct 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

aactgacgat tctggcctct 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

acacttaggc ggaggaatgt 20

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

tcaagctctt tggtatgggc ctttcca 27

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

ccaactccaa ccaagcaata c 21

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

gacagtagag ggtgctctta ac 22