阅读说明：本技术 阳离子脂质 (Cationic lipids ) 是由 铃木裕太 高桥良典 于 2018-12-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种阳离子脂质,该阳离子脂质能够用于将核酸递送至细胞质。根据本发明的阳离子脂质是例如由式(1)代表的化合物或其药学上可接受的盐,其中L<Sub>1</Sub>和L<Sub>2</Sub>独立地代表具有3至10个碳原子的亚烷基基团；R<Sub>1</Sub>和R<Sub>2</Sub>独立地代表具有4至24个碳原子的烷基基团或具有4至24个碳原子的烯基基团；R<Sub>3</Sub>代表具有1至3个碳原子的烷基基团；以及X<Sub>1</Sub>代表单键或CO-O-。<Image he="463" wi="700" file="DDA0002515849980000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The present invention provides a cationic lipid which can be used for delivering a nucleic acid to cytoplasm according to the present invention is, for example, a compound represented by formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein L 1 And L 2 Independently represents an alkylene group having 3 to 10 carbon atoms; r 1 And R 2 Independently represents an alkyl group having 4 to 24 carbon atoms or an alkenyl group having 4 to 24 carbon atoms; r 3 Represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms; and X 1 Represents a single bond or CO-O-.)

阳离子脂质

技术领域

本发明涉及新颖的阳离子脂质。

背景技术

核酸(例如siRNA(小干扰RNA)、miRNA(微小RNA)和shRNA(短发夹RNA或小发夹RNA))表达载体和反义寡核苷酸在体内诱导序列特异性基因沉默，并且被称为寡核苷酸治疗剂。

在寡核苷酸治疗剂中，siRNA引起了特别的关注。siRNA是由19至23个碱基对组成的双链RNA，并且诱导序列特异性基因沉默，称为RNA干扰(RNAi)。

siRNA具有化学稳定性；然而，siRNA在治疗应用(例如，容易被血浆中的RNA酶(核糖核酸酶)分解，以及难以单独通过细胞膜)上存在问题(例如，参见专利文献1)。

为解决上述问题，已知通过将siRNA包封在含有阳离子脂质的细颗粒中，所包封的siRNA在血浆中免受分解并且可以渗透亲脂性细胞膜(例如，参见专利文献1)。

专利文献2至6披露了阳离子脂质，其用于递送siRNA等寡核苷酸治疗剂并且具有改善的生物降解性。

含有阳离子脂质的细颗粒具有这样的稳定性问题，即颗粒在储存期间可能聚集，并且已知通过向细颗粒中添加聚乙二醇改性的脂质(PEG脂质)来防止聚集的方法。另外，专利文献7披露了通过配置包含特定PEG脂质(即PEG-DPG)的细颗粒以及包含这些细颗粒和去离子溶剂的制剂来防止核酸的凝集并提高核酸的递送效率的方法。

引证文献清单

专利文献

专利文献1：WO 2010/144740

专利文献2：WO 2011/153493

专利文献3：WO 2013/086354

专利文献4：WO 2013/158579

专利文献5：WO 2015/095346

专利文献6：WO 2016/104580

专利文献7：WO 2014/089239

发明内容

然而，尽管最近有发展，但仍需要可用于将核酸递送至细胞质的阳离子脂质。

本发明涉及以下所示的[1]至[14]。

[1]一种由下式(1)代表的化合物或其药学上可接受的盐：

其中L₁和L₂独立地代表具有3至10个碳原子的亚烷基基团；R₁和R₂独立地代表具有4至24个碳原子的烷基基团或具有4至24个碳原子的烯基基团；R₃代表具有1至3个碳原子的烷基基团；以及X₁代表单键或CO-O-。

[2]根据[1]所述的化合物，该化合物选自由以下组成的组：由下式(A1)至(A9)代表的化合物，或其药学上可接受的盐。

[2a]根据[2]所述的化合物，该化合物选自由以下组成的组：由上式(A1)、(A2)、(A3)、(A4)、(A5)、(A6)、(A8)和(A9)代表的化合物，或其药学上可接受的盐。

[2b]根据[2]所述的化合物，该化合物选自由以下组成的组：由上式(A1)、(A2)、(A3)、(A4)、(A5)、(A6)和(A9)代表的化合物，或其药学上可接受的盐。

[2c]根据[2]所述的化合物，该化合物选自由以下组成的组：由上式(A1)、(A2)、(A4)和(A6)代表的化合物，或其药学上可接受的盐。

[2d]根据[1]所述的化合物，该化合物由下式(2)或(3)代表，或其药学上可接受的盐：

其中L₁和L₂、R₁至R₃以及X₁是如上式(1)中所定义的。

[2e]根据[1]或[2d]所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R₃是甲基基团。

[3]根据[1]或[2]所述的化合物，该化合物由下式(A1)代表，或其药学上可接受的盐。

[4]根据[1]或[2]所述的化合物，该化合物由下式(A2)代表，或其药学上可接受的盐。

[5]根据[1]或[2]所述的化合物，该化合物由下式(A3)代表，或其药学上可接受的盐。

[6]根据[1]或[2]所述的化合物，该化合物由下式(A4)代表，或其药学上可接受的盐。

[7]根据[1]或[2]所述的化合物，该化合物由下式(A5)代表，或其药学上可接受的盐。

[8]根据[1]或[2]所述的化合物，该化合物由下式(A6)代表，或其药学上可接受的盐。

[9]根据[1]或[2]所述的化合物，该化合物由下式(A7)代表，或其药学上可接受的盐。

[10]根据[1]或[2]所述的化合物，该化合物由下式(A8)代表，或其药学上可接受的盐。

[11]根据[1]或[2]所述的化合物，该化合物由下式(A9)代表，或其药学上可接受的盐。

[12]一种脂质复合物，该脂质复合物含有：(I)根据[1]至[11]和[2a]至[2e]中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐；以及(II)选自由中性脂质、聚乙二醇改性的脂质和固醇组成的组的至少一种脂质。

[13]一种组合物，该组合物含有：(I)根据[1]至[11]和[2a]至[2e]中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐；(II)选自由中性脂质、聚乙二醇改性的脂质和固醇组成的组的至少一种脂质；以及(III)核酸。

[14]一种用于产生组合物的方法，该方法包括：将含有(I)根据[1]至[11]和[2a]至[2e]中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐和(II)选自由中性脂质、聚乙二醇改性的脂质和固醇组成的组的至少一种脂质的含极性有机溶剂的水溶液与含有(III)核酸的水溶液混合，以获得混合溶液的步骤；以及降低该混合溶液中极性有机溶剂的含量百分比的步骤。

发明效果

本发明的阳离子脂质具有以下所示的一种或多种效果：

(1)本发明的阳离子脂质允许核酸有效释放到细胞质中；

(2)本发明的阳离子脂质可以防止脂质复合物在一定时间段内的储存期间粒径增加。

因此，本发明的阳离子脂质可以用作用于将核酸递送到细胞质中的脂质。

附图说明

[图1]图1是示出测试实例1的结果的图。

[图2]图2是示出测试实例2的结果的图。

具体实施方式

下文通过展示实施例和实例对本发明做详细说明。然而，本发明不限于下文描述的实施例和实例，并且可以在不偏离本发明的概念的范围内进行任何修改。无论其目的如何，本说明书中引用的所有文件和出版物均通过引用完全并入本文。

<阳离子脂质>

在一个实施例中，本发明是由下式(1)代表的化合物或其药学上可接受的盐，并且可以用作阳离子脂质。阳离子脂质可以是盐的水合物或盐的溶剂化物。

在式(1)中，L₁和L₂独立地代表具有3至10个碳原子的亚烷基基团；R₁和R₂独立地代表具有4至24个碳原子的烷基基团或具有4至24个碳原子的烯基基团；R₃代表具有1至3个碳原子的烷基基团；以及X₁代表单键或CO-O-。

如本文所用，“烷基”意指具有指定数目的碳原子的直链、环状或支链饱和脂族烃基团。

如本文所用，“烯基”意指具有指定数目的碳原子和至少一个碳-碳双键的直链或支链烃基团。其实例包括单烯、二烯、三烯和四烯；然而，该术语不局限于此。

如本文所用，“亚烷基”意指具有指定数目的碳原子的直链、环状或支链二价饱和脂族烃基团。

如本文所用，“卤素”意指F、Cl、Br或I。

本发明的化合物中的不对称原子(例如碳)能以浓缩的外消旋化合物或对映异构体(例如(R)-、(S)-或(R，S)-构型的形式存在。

本发明的一个实施例是由下式(2)或(3)代表的化合物、或其药学上可接受的盐。

在式(2)或(3)中，L₁和L₂、R₁至R₃以及X₁是如上式(1)中所定义的。根据本实施例的化合物可以用作阳离子脂质。阳离子脂质可以是盐的水合物或盐的溶剂化物。

本发明的一个实施例是具有上式(1)至(3)的化合物，其中L₁和L₂独立地代表具有3至10个碳原子(例如，3至8个碳原子)的亚烷基基团；R₁和R₂独立地代表具有4至24个碳原子的烷基基团或具有4至24个碳原子的烯基基团；R₃代表具有1至3个碳原子的烷基基团；以及X₁代表单键或-CO-O-；或其药学上可接受的盐，并且可以用作阳离子脂质。阳离子脂质可以是盐的水合物或盐的溶剂化物。

本发明的一个实施例是具有上式(1)至(3)的化合物，其中L₁和L₂独立地代表具有3至10个碳原子(例如，3至8个碳原子)的直链亚烷基基团；R₁和R₂独立地代表具有4至24个碳原子的直链或支链烷基基团或具有4至24个碳原子的直链烯基基团；R₃是具有1至3个碳原子的烷基基团；以及X₁是-CO-O-；或其药学上可接受的盐，并且可以用作阳离子脂质。阳离子脂质可以是盐的水合物或盐的溶剂化物。

本发明的一个特定实施例是由下式(1a)代表的化合物、或其药学上可接受的盐。

在式(1a)中，R₁和R₂独立地是具有4至24个碳原子的烷基基团或具有4至24个碳原子的烯基基团；R₃是具有1至3个碳原子的烷基基团；并且n1和n2独立地代表3至10(例如3至8)的整数。

在本发明的一个实施例中，本发明是具有上式(1)至(3)的化合物(其中，X₁是-CO-O-；L₁与L₂相同；并且R₁与R₂相同)；或其药学上可接受的盐，并且可以用作阳离子脂质。阳离子脂质可以是盐的水合物或盐的溶剂化物。

在本发明的一个实施例中，本发明是具有上式(1)至(3)的化合物，其中L₁和L₂独立地是具有3至10个碳原子(例如，3至8个碳原子)的直链亚烷基基团；R₁是具有4至24个碳原子的直链或支链烷基基团或具有4至24个碳原子的直链烯基基团；R₂是具有4至24个碳原子的直链烷基基团；R₃是具有1至3个碳原子的烷基基团；以及X₁是单键；或其药学上可接受的盐。在本实施例中，L₂和R₂中的碳原子总数优选为9至12。本实施例的化合物可以用作阳离子脂质。阳离子脂质可以是盐的水合物或盐的溶剂化物。

本发明的一个特定实施例是由下式(1b)代表的化合物、或其药学上可接受的盐。

在式(1b)中，R₁是具有4至24个碳原子的烷基基团或具有4至24个碳原子的烯基基团；R₃是具有1至3个碳原子的烷基基团；n1代表3至10(例如3至8)的整数；并且n2代表6至33(优选8至11)的整数。

下文指出根据本发明实施例的化合物的实例。

本发明的一个实施例是由上式(A1)、(A2)、(A3)、(A4)、(A5)、(A6)、(A8)和(A9)中任一个代表的化合物或其药学上可接受的盐，并且可以用作阳离子脂质。阳离子脂质可以是盐的水合物或盐的溶剂化物。

本发明的一个实施例是由上式(A1)、(A2)、(A3)、(A4)、(A5)、(A6)和(A9)中任一个代表的化合物或其药学上可接受的盐，并且可以用作阳离子脂质。阳离子脂质可以是盐的水合物或盐的溶剂化物。

本发明的一个实施例是由上式(A1)、(A2)、(A4)和(A6)中任一个代表的化合物或其药学上可接受的盐，并且可以用作阳离子脂质。阳离子脂质可以是盐的水合物或盐的溶剂化物。

如本文所用，“阳离子脂质”是具有含有一个或多个烃基团的亲脂性区域、和含有中性的或在生理pH下经历质子化的极性基团的亲水性区域的两亲分子。即，本发明的阳离子脂质可以被质子化以形成阳离子。例如，上式(1)代表的化合物涵盖由下式(1)’代表的化合物(阳离子化合物)，其中氢离子与吡咯烷环上的氮原子上的孤电子对配位。阳离子化合物可以形成由下式(1)’代表的盐，以及该盐与阴离子的水合物或溶剂化物。

在式(1)’中，L₁和L₂、R₁至R₃以及X₁是如以上式(1)中所定义的。Z是阴离子(反离子)。本实施例的化合物可以用作阳离子脂质。

可以通过与阳离子化合物形成对而包含在本实施例的阳离子脂质中的阴离子(上式(1)’中的Z)没有特别限制，只要该阴离子是药学上可接受的即可。其实例包括无机离子，例如氯离子、溴离子、硝酸根离子、硫酸根离子和磷酸根离子；有机酸离子，例如乙酸根离子、草酸根离子、马来酸根离子、富马酸根离子、柠檬酸根离子、苯甲酸根离子和甲磺酸根离子等。

本发明的阳离子脂质可以具有立体异构体，例如几何异构体和旋光异构体或互变异构体。本发明的阳离子脂质涵盖所有可能的异构体，这些异构体包括上述物质及其混合物。

<阳离子脂质的生产方法>

现在描述用于生产本发明的阳离子脂质的方法。阳离子脂质的合成方案的一个实施例如下所示。本文所述的所有化合物作为化合物涵盖于本发明中。本发明的化合物可以根据如下所示的方案中所示的至少一种方法来合成。本发明的阳离子脂质可以具有一个或多个不对称中心，因此合成的化合物可以作为(R)-或(S)-立体异构体或其混合物(R，S)产生。除非特别指出，否则本文特定化合物的叙述旨在涵盖单个对映异构体及其外消旋混合物。用于立体化学的测定和立体异构体的分离的方法是本领域技术人员所熟知的。

在式中，L₁和R₁分别是如以上式(1)中所定义的；X和Y分别地是卤素原子；并且R在式(1)中是-L₂-X₁-R₂--(L₂、X₁和R₂分别是如以上式(1)中所定义的)。

具有式(1)的阳离子脂质(其中X₁是单键的化合物)可以例如根据以上方案1合成。

(步骤1-1：酯化)

首先，在缩合剂的存在下，使醇(a1)与卤代羧酸X-L₁-COOH(X为卤素原子并且L₁是如上所定义的)(优选溴代羧酸)反应，以获得卤代酯(a2)。缩合剂的实例包括1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺(EDC)盐酸盐、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)等。任选地，可以添加碱。碱的实例包括N-甲基吗啉(NMM)、三乙胺(TEA)、N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)、4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)、吡啶、甲基吡啶、二甲基吡啶等。溶剂的实例包括四氢呋喃(THF)、二氯甲烷、氯仿、甲苯、己烷、乙酸乙酯等。

替代性地，任选地在二甲基甲酰胺的存在下，可以使卤代羧酸X-L₁-COOH(X为卤素原子并且L₁是如上所定义的)(优选溴代羧酸)与亲电子卤化剂(如草酰氯)反应以转化为羧酸氯化物，并且使该羧酸氯化物与醇进一步反应以获得卤代酯(a2)。溶剂的实例包括四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、甲苯、己烷等。

(步骤1-2：引入烷基链)

然后，使卤代酯(a2)与丙二酸二叔丁酯在碱的存在下反应。通过此反应，丙二酸二酯中的活性亚甲基的氢原子被提取以引入烷基酯链，从而获得化合物(a3)。碱的实例包括氢化钠(NaH)。溶剂的实例包括二噁烷、四氢呋喃、环戊基甲基醚、1，2-二甲氧基乙烷、DMF、N-甲基吡咯烷酮等。

(步骤1-3：引入烷基链)

然后，使化合物(a3)与卤代烷(R-Y)(优选碘代烷)在碱的存在下反应以引入烷基链，从而获得化合物(a4)。可以使用类似于以上步骤1-2的那些碱和溶剂。

(步骤1-4：脱保护)

然后，将化合物(a4)的叔丁基基团(tBu)在酸水解条件下脱保护以获得化合物(a5)。用于脱保护的酸的实例包括三氟乙酸(TFA)、盐酸等。溶剂的实例包括二氯甲烷等。

(步骤1-5：脱羧)

然后，通过使化合物(a5)脱羧而获得一元羧酸(a6)。脱羧反应可以通过例如在溶剂中加热来进行。溶剂的实例包括芳香烃，如甲苯和二甲苯。

(步骤1-6：还原)

在还原剂的存在下，将化合物(a6)的羧基基团还原为羟基基团以获得化合物(a7)。还原剂的实例包括硼烷复合物，如硼烷(BH₃)-四氢呋喃复合物和硼烷-二甲基硫醚复合物。溶剂的实例包括醚，如乙醚、四氢呋喃和二噁烷；卤代烃，如氯仿、二氯甲烷和二氯乙烷；烃类，如己烷和甲苯；及其混合溶剂。

(步骤1-7：酯化)

在缩合剂和碱的存在下，使获得的醇(a7)与1-甲基-吡咯烷-3-甲酸或其衍生物(卤化氢等)反应，以获得最终产物化合物(a8)(R＝L₂-X₁-R₂)(对应于具有式(1)的阳离子脂质的化合物)。可以使用类似于步骤1-1的那些缩合剂和碱。

当合成其中X₁是-CO-O-的化合物时，可以在以上方案1的步骤1-3中制备根据下述步骤2-1对其羧基基团进行保护的化合物(卤代酯)，该化合物可以与化合物(a3)反应，可以使获得的化合物进一步经受步骤1-4至步骤1-7，并且可以在最后进行羧基基团的脱保护以及酯化(与R₂-OH的反应)。

在式中，L₁和R₁分别是如以上式(1)中所定义的；X和Y分别地是卤素原子；并且R在式(1)中是-L₂-X₁-R₂--(L₂、X₁和R₂分别是如以上式(1)中所定义的)。

以上方案2说明了本领域技术人员使用的用于合成具有式(1)的阳离子脂质(其中X₁是单键的化合物)的另一种方法。

(步骤2-1：酯化)

首先，使苯甲醇和卤代羧酸X-L₁-COOH(X为卤素原子并且L₁是如上所定义的)经受酯化以获得卤代酯(b1)。酯化条件类似于步骤1-1。

(步骤2-2：引入烷基链)

然后，类似于步骤1-2，使卤代酯(b1)与丙二酸二叔丁酯在碱的存在下反应以获得化合物(b2)。

(步骤2-3：引入烷基链)

然后，类似于步骤1-3，使化合物(b2)与卤代烷(R-Y)在碱的存在下反应以获得化合物(b3)。

(步骤2-4：脱保护)

然后，类似于步骤1-4，使化合物(b3)的叔丁基基团(tBu)在酸水解条件下脱保护以获得化合物(b4)。

(步骤2-5：脱羧)

然后，类似于步骤1-5，获得一元羧酸(b5)。

(步骤2-6：还原步骤)

此外，类似于步骤1-6，使一元羧酸(b5)在还原剂的存在下还原以获得化合物(b6)。

(步骤2-7：酯化)

在缩合剂和碱的存在下，使获得的化合物(b6)与1-甲基-吡咯烷-3-甲酸或其衍生物(卤化氢等)经受酯化反应，以获得化合物(b7)。可以使用类似于步骤1-1的那些缩合剂和碱。

(步骤2-8：脱保护)

然后，在还原条件下，使苄基保护基团脱保护以获得化合物(b8)。脱保护可以例如通过在金属催化剂(如钯/碳)存在下的催化氢化反应来进行。

(步骤2-9：酯化)

最后，可以使化合物(b8)在缩合剂和碱的存在下与醇(R₁-OH)反应，以获得化合物(b9)(R＝L₂-X₁-R₂)(对应于具有式(1)的阳离子脂质的化合物)。可以使用类似于步骤1-1的那些缩合剂和碱。

在以上方案2中，使步骤2-6中获得的化合物(b6)与1-甲基-吡咯烷-3-甲酸或其衍生物进行酯化(步骤2-7)，并且然后与醇(R₁-OH)进行酯化反应(步骤2-9)。然而，如以下方案2’所示，可以对步骤2-6中获得的化合物(b6)的羟基基团进行保护，可以使苄基基团脱保护并且与醇(R₁-OH)进行酯化反应，并且然后与1-甲基-吡咯烷-3-甲酸或其衍生物进行酯化反应。

在式中，L₁和R₁分别是如以上式(1)中所定义的；并且R在式(1)中是-L₂-X₁-R₂-(L₂、X₁和R₂分别是如以上式(1)中所定义的)。

(步骤2-7’：保护)

对步骤2-6中获得的化合物(b6)的羟基基团进行保护。例如，在碱(如咪唑)的存在下，使叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMS-Cl)与其在溶剂(如N，N-二甲基甲酰胺)中反应，以获得其中羟基基团被叔丁基二甲基甲硅烷基基团(TBDMS)保护的化合物(b10)。

(步骤2-8’：脱保护)

然后，在还原条件下使苄基保护基团脱保护以获得化合物(b11)。脱保护可以例如通过在金属催化剂(如钯/碳)存在下的催化氢化反应来进行。

(步骤2-9’：酯化)

在缩合剂和碱的存在下，使获得的化合物(b11)与醇(R₁-OH)反应，以获得化合物(b12)。可以使用类似于步骤1-1的那些缩合剂和碱。

(步骤2-10’：脱保护)

然后，使TBDMS基团脱保护以获得化合物(b13)。脱保护可以例如通过在有机溶剂(如四氢呋喃)中与氟化盐(如四-正丁基氟化铵(TBAF))反应来进行。

(步骤2-11’：酯化)

最后，类似于步骤1-7，在缩合剂和碱的存在下，使获得的醇(b13)与1-甲基-吡咯烷-3-甲酸或其衍生物(卤化氢等)反应，以获得最终产物化合物(b14)(R＝L₂-X₁-R₂)(对应于具有式(1)的阳离子脂质的化合物)。

在式中，L₁和R₁分别是如以上式(1)中所定义的；并且R在式(1)中是-L₂-X₁-R₂(L₂、X₁和R₂分别是如以上式(1)中所定义的)。

(步骤2-11”：酯化)

替代性地，代替步骤2-11’，类似于步骤1-7，在缩合剂和碱的存在下，可以使其中吡咯烷环上的氮原子被保护基团(如叔丁氧基羰基(tBu-O-CO-；Boc))保护的羧酸或其衍生物与醇(b13)反应，以获得化合物(b15)。

(步骤2-12”：脱保护/还原胺化)

然后，使化合物(b15)的叔丁氧基羰基基团(Boc)脱保护并通过还原胺化进行甲基化。特别地，使化合物(b15)的Boc基团通过与强酸(如三氟乙酸(TFA))反应而脱保护，以获得NH，其与甲醛反应以生成亚胺(亚胺阳离子)，该亚胺进一步与还原剂(如NaBH(OAc)₃或NaBH₃CN)反应，从而获得最终产物胺化合物(b14)(R＝L₂-X₁-R₂)(对应于具有式(1)的阳离子脂质的化合物)。

在以上步骤2-11’或步骤2-11”中，作为羧酸或其衍生物，其中吡咯烷环3位置处的碳原子构型受控制的起始材料(如(3S)-1-甲基-吡咯烷-3-甲酸或(3R)-1-甲基-吡咯烷-3-甲酸或其衍生物)可用于控制具有式(1)的化合物中吡咯烷环的构型。

当合成其中X₁是-CO-O-的化合物(例如，具有式(1a)的化合物)时，可以在方案2中制备根据上述步骤2-1对其羧基基团进行保护的化合物(酯化合物)该化合物可以在步骤2-3中与化合物(b2)反应，可以使获得的化合物进一步经受后续步骤，并且可以在步骤2-8和步骤2-9或步骤2-8’和步骤2-9’中进行脱保护和酯化。通过使用可以在两个羧基基团彼此不同的脱保护条件下被脱保护的不同类型的保护基团，可以获得其中R₁和R₂不同的化合物。

在以上方案中，示例性地示出了其中式(1)中的R₃为甲基基团的合成方法。然而，还可以根据以上方案，通过在以上步骤1-7或步骤2-7中使用1-烷基-吡咯烷-3-甲酸代替1-甲基-吡咯烷-3-甲酸来合成其中R₃不是甲基基团的化合物。

在本发明的化合物的合成中，除非对起始材料的生产进行特别说明，否则化合物是已知的或根据本领域熟知的类似方法或如以下实例所述的方法而制备。本领域技术人员理解，以上方案仅仅是本发明的化合物的典型制备方法，并且可以应用其他熟知的方法。

在本发明的化合物的制备中，对分子的官能团进行保护可能是必要的和/或期望的。这可以用本领域技术人员所熟知的常规保护基团来进行。可以根据本领域中熟知的方法在任何适当的后续阶段除去保护基团。以上方案中指示的保护基团(如叔丁基保护基团、叔丁氧基羰基保护基团、苄基保护基团和叔丁基二甲基甲硅烷基保护基团)可以被本领域技术人员熟知的其他保护基团所代替。

<脂质复合物>

本发明提供一种脂质复合物，该脂质复合物含有(I)上述阳离子脂质和(II)选自由中性脂质、聚乙二醇改性的脂质和固醇组成的组的至少一种脂质。根据本发明的一个实施例的脂质复合物，该脂质复合物含有(I)上述阳离子脂质，(II)选自由中性脂质、聚乙二醇改性的脂质和固醇组成的组的至少一种脂质，以及(III)核酸。因此，本发明的脂质复合物可含有核酸或可不含核酸。本实施例的脂质复合物允许核酸有效释放到细胞质中。在一定时间段(例如，1个月、1.5个月或3个月)内的储存后，本实施例的脂质复合物的粒径不会增加，并且可显示优异的物理稳定性。

由含有阳离子脂质和核酸的脂质形成的复合物的形式的实例包括核酸和由脂质单层(单分子层)形成的膜(反胶束)的复合物、核酸和脂质体的复合物、核酸和胶束的复合物等。在根据本发明的一个实施例的脂质复合物中，核酸被包封在由含有阳离子脂质的脂质形成的细颗粒中。

基于脂质复合物的总脂质含量，本实施例的脂质复合物含有例如按摩尔计10％至100％(如按摩尔计20％至90％、如按摩尔计40％至80％)的阳离子脂质。所使用的阳离子脂质可单独使用或以两种或更多种的混合物使用。

核酸的实例包括siRNA、miRNA、shRNA表达载体、反义寡核苷酸、mRNA、核酶等。在一个实施例中，核酸可以是siRNA、miRNA或mRNA。

相对于脂质复合物的总重量，本实施例的脂质复合物含有例如按重量计0.01％至50％(如按重量计0.1％至30％、如按重量计1％至10％)的核酸。

本实施例的脂质复合物(作为脂质成分)含有(I)阳离子脂质和(II)选自由中性脂质、聚乙二醇改性的脂质和固醇组成的组的至少一种脂质。相对于脂质复合物的总重量，本实施例的脂质复合物含有例如按重量计50％至100％(如按重量计70％至99.99％、如按重量计90％至99％)的脂质组分。

“中性脂质”意指在生理pH下以不带电荷的形式或以中性两性离子存在的脂质。中性脂质的实例包括二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、卵磷脂酰胆碱(egg phosphatidylcholine，EPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dimyristoylphosphatidylcholine，DMPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC)、双二十二碳酰基磷脂酰胆碱(dibehenoylphosphatidylcholine，DBPC)、双二十四烷基磷脂酰胆碱(dilignoceroylphosphatidylcholine，DLPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、鞘磷脂、神经酰胺、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)等。中性脂质可单独使用或以两种或更多种的混合物使用。

基于脂质复合物中的总脂质含量，本实施例的脂质复合物可以含有例如按摩尔计0％至50％(如按摩尔计0％至40％、如按摩尔计0％至30％)的中性脂质。

聚乙二醇改性的脂质的实例包括PEG2000-DMG(PEG2000-二肉豆蔻基甘油)、PEG2000-DPG(PEG2000-二棕榈酰基甘油)、PEG2000-DSG(PEG2000-二硬脂酰基甘油)、PEG5000-DMG(PEG5000-二肉豆蔻基甘油)、PEG5000-DPG(PEG5000-二棕榈酰基甘油)、PEG5000-DSG(PEG5000-二硬脂酰基甘油)、PEG-cDMA(N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰]-1，2-二肉豆蔻基氧基丙基(oxylpropyl)-3-胺)、PEG-C-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨基甲酰]-1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)、聚乙二醇(PEG)-二酰基甘油(DAG)、PEG-二烷基氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)等。

PEG-二烷基氧基丙基的实例包括PEG-二月桂基氧基丙基、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基、PEG-二棕榈基氧基丙基、PEG-二硬脂基氧基丙基等。

聚乙二醇改性的脂质可单独使用或以两种或更多种的混合物使用。聚乙二醇改性的脂质可以具有被甲氧基化的PEG(聚乙二醇)的末端(MPEG；甲氧基(聚乙二醇))。

基于脂质复合物中的总脂质含量，本实施例的脂质复合物可以含有例如按摩尔计0％至30％(如按摩尔计0％至20％、如按摩尔计0％至10％)的聚乙二醇改性的脂质。

固醇是具有类固醇主链的醇。固醇的实例包括胆固醇、二氢胆固醇、羊毛固醇、β-谷固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、麦角固醇、岩藻固醇、3β-[N-(N’，N’-二甲基氨基乙基)氨基甲酰]胆固醇(DC-Chol)等。固醇可单独使用或以两种或更多种的混合物使用。

基于脂质复合物中的总脂质含量，本实施例的脂质复合物可以含有例如按摩尔计0％至90％(如按摩尔计10％至80％、如按摩尔计20％至50％)的固醇。

本实施例的脂质复合物中的脂质组分可以无任何限制地组合，并且组合的实例包括上述阳离子脂质、中性脂质和固醇的组合，上述阳离子脂质、中性脂质、聚乙二醇改性的脂质和固醇的组合等。

本实施例的脂质复合物的“平均粒径”可以根据体积平均值、数量平均值和Z-平均值中的任一个来计算。本实施例的脂质复合物可以具有例如10至1000nm(如30至500nm、如30至200nm)的平均粒径(Z-平均值)。

本实施例的脂质复合物优选使得在储存期间的脂质复合物的粒径与储存之前相比增加最小化。例如，优选在4℃储存1.5个月后的平均粒径(Z-平均值)为储存前粒径的1.25倍或更小，更优选为1.2倍或更小，并且特别优选为1.1倍或更小。

从防止非特异性吸附和免疫反应的观点出发，本实施例的脂质复合物优选在pH约为7.4的环境中(如在血液中)几乎不具有表面电荷。另外，从通过内吞作用向细胞内并入期间提高与内体膜的融合效率的观点出发，优选在低pH(例如，3.5至7.0)的环境下使脂质复合体带正电。

<组合物>

本发明提供一种组合物，该组合物包含(I)上述阳离子脂质，(II)选自由中性脂质、聚乙二醇改性的脂质和固醇组成的组的至少一种脂质，以及(III)核酸。在本发明的一个实施例中，组合物包含脂质复合物，该复合物含有如上所述的核酸。本实施例的组合物允许核酸有效释放到细胞质中。本实施例的组合物可含有上述脂质复合物、药学上可接受的介质和任选的其他添加剂。药学上可接受的介质和其他添加剂在下文中描述。

基于组合物中的总脂质含量，本发明的组合物含有例如按摩尔计10％至100％(如按摩尔计20％至90％、如按摩尔计40％至70％)的阳离子脂质。阳离子脂质可单独使用或以两种或更多种的混合物使用。

核酸的实例包括上述的那些。相对于组合物的总重量，本实施例的组合物含有例如按重量计0.01％至50％(如按重量计0.1％至30％、如按重量计1％至10％)的核酸。

本发明的组合物(作为脂质组分)含有(I)上述阳离子脂质和(II)选自由中性脂质、聚乙二醇改性的脂质和固醇组成的组的至少一种脂质。

中性脂质的实例包括上述的那些。基于组合物中的总脂质含量，本发明的组合物可以含有例如按摩尔计0％至50％(如按摩尔计0％至40％、如按摩尔计0％至30％)的中性脂质。

聚乙二醇改性的脂质的实例包括上述的那些。基于组合物中的总脂质含量，本发明的组合物可以含有例如按摩尔计0％至30％(如按摩尔计0％至20％、如按摩尔计0％至10％)的聚乙二醇改性的脂质。

固醇的实例包括上述的那些。基于组合物中的总脂质含量，本发明的组合物可以含有例如按摩尔计0％至90％(如按摩尔计10％至80％、如按摩尔计20％至50％)的固醇。

本发明的组合物中的脂质组分可以无任何限制地组合，并且其实例包括上述阳离子脂质、中性脂质和固醇的组合，上述阳离子脂质、中性脂质、聚乙二醇改性的脂质和固醇的组合等。

本发明的组合物(作为其他添加剂)可含有糖类(如蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇和乳糖)；氨基酸(如谷氨酰胺、谷氨酸、谷氨酸钠和组氨酸)；酸(如柠檬酸、磷酸、乙酸、乳酸、碳酸和酒石酸等)的盐。

可将本发明组合物配制为药物组合物。药物组合物的剂型的实例包括注射剂。

本发明的组合物可以处于例如粉末状态(通过冷冻干燥等除去溶剂而获得)或液体状态。根据本发明的一个实施例的组合物是含有根据上述实施例的脂质复合物的粉末组合物。粉末组合物可以通过除去溶剂(例如，过滤或离心)而从液体状态(分散体)的组合物制备，或者通过将分散体冷冻干燥来制备。当组合物处于粉末状态时，可以在将组合物用作注射剂之前将其悬浮或溶解在药学上可接受的介质中。根据本发明的一个实施例的组合物是含有根据上述实施例的脂质复合物和药学上可接受的介质的液体组合物。当组合物处于液体状态时，该组合物可直接使用或在将其溶解于药学上可接受的介质中之后作为注射剂使用。

药学上可接受的介质的实例包括无菌水；盐水；含有佐剂(例如，葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇和氯化钠)的等渗溶液；缓冲液，如磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和乙酸盐缓冲液；等等。本实施例的组合物可进一步含有添加剂，这些添加剂包括溶解佐剂，例如，醇(包括乙醇、丙二醇和聚乙二醇)、稳定剂、抗氧化剂、抗菌剂、通常在药物生产中使用的媒介物、填充剂、膨胀剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂、分散剂、防腐剂、调味剂、缓和剂等。

组合物可以通过肠胃外方式(如动脉内注射、静脉内注射和皮下注射)施用于患者。组合物的剂量可以根据待施用的受试者、靶器官、症状或施用方式而变化。对施用组合物的受试者没有限制，并且组合物可应用于多种动物。特别地，在临床测试、筛选和实验室实验中可将组合物施用于哺乳动物，优选人和实验动物。

<组合物的生产方法>

在一个实施例中，本发明提供了用于产生组合物的方法，该方法包括：步骤(a)将含有(I)上述阳离子脂质、(II)至少一种脂质(选自由中性脂质、聚乙二醇改性的脂质和固醇组成的组)的含极性有机溶剂的水溶液与含有(III)核酸的水溶液混合，以获得混合溶液；以及步骤(b)降低该混合溶液中极性有机溶剂的含量百分比。根据本实施例的生产方法，允许产生能够有效地将核酸释放到细胞质中的组合物。

可以通过水溶性核酸与阳离子脂质之间的静电相互作用以及脂质之间的疏水相互作用来形成含有包封在脂质形成的细颗粒中的核酸的脂质复合物。例如，通过降低混合溶液中极性有机溶剂的含量百分比，可以改变含极性有机溶剂的水溶液中脂质组分的溶解度，从而形成脂质复合物，这些脂质组分包括(I)上述阳离子脂质以及(II)选自由中性脂质、聚乙二醇改性的脂质和固醇组成的组的至少一种脂质。极性有机溶剂的实例包括醇，例如乙醇。

首先，在步骤(a)中，将含有(I)阳离子脂质和(II)选自由中性脂质、聚乙二醇改性的脂质和固醇组成的组的至少一种脂质(溶解于其中)的含极性有机溶剂的水溶液与含有(III)核酸的水溶液混合，以获得混合溶液。含极性有机溶剂的水溶液中的极性有机溶剂的浓度没有特别限制，只要脂质分子甚至可以在与核酸的水溶液混合之后溶解。例如，步骤(a)中的含极性有机溶剂的水溶液中的极性有机溶剂的浓度可以是按重量计0％至60％。

然后，在步骤(b)中，将水等添加至混合溶液中以降低极性有机溶剂的含量百分比。结果，可以形成脂质复合物。为了有效地形成脂质复合物，优选快速降低极性有机溶剂的含量百分比。例如，步骤(b)中的含最终极性有机溶剂的水溶液中的极性有机溶剂的浓度可以是按重量计0％至5％。

替代性地，可以对步骤(a)中获得的混合溶液进行透析以除去极性有机溶剂，并用药学上可接受的介质代替溶剂。由于在透析过程中溶液中极性有机溶剂的含量百分比降低，脂质复合物可能形成。

根据本实施例的用于产生组合物的方法，可以获得含有被有效地包封在细颗粒中的核酸的脂质复合物。脂质复合物可以具有优异的物理稳定性。例如，在一定时间段(例如1个月或3个月)内的储存后，粒径的增加可以最小化。

当包封在组合物中的核酸是寡核苷酸治疗剂时，该组合物可用作药物组合物。例如，本发明的组合物可以在用于在体内或体外将所需核酸引入靶细胞质(如引起疾病的细胞质)的治疗(如基因治疗)中使用。因此，本发明根据一个实施例的提供了通过使用含有脂质复合物的药物组合物治疗各种疾病的方法(特别是基因治疗方法)。待施用的受试者、施用方法和条件与上述相同。

本发明的一个实施例可以是用于递送核酸治疗剂的试剂盒，该试剂盒包含阳离子脂质。试剂盒还可以优选地在多种靶细胞的治疗(例如基因治疗)中使用。在本实施例的试剂盒中，对阳离子脂质的储存状态没有特别限制，并且考虑到稳定性(储存特性)、使用便利性等，其可以处于任何状态(如溶液或粉末)。除了阳离子脂质外，本实施例的试剂盒还可包含例如多种核酸、多种介质(药学上可接受的介质、缓冲液)、说明书(说明书手册)等。本实施例的试剂盒用于制备组合物或脂质复合物，该组合物或脂质复合物含有待引入靶细胞的所需核酸以及含有上述阳离子脂质的脂质。所制备的组合物或脂质复合物可有效地用于将核酸递送至靶细胞。此外，本发明的一个实施例可以是用于递送核酸治疗剂的试剂盒，该试剂盒含有包含阳离子脂质的药物组合物。除药物组合物外，本实施例的试剂盒还可包含例如多种介质(药学上可接受的介质)、说明书(说明书手册)等。

实例

下文通过实例、生产实例和测试实例更特别地描述本发明。然而，本发明不限于这些实例。在实例和生产实例中，化合物的命名通过软件(由铂金埃尔默有限公司(PerkinElmer Co.，Ltd.)生产，产品名称“ChemDraw Plugin 15.1版”)获得。

用于合成本发明化合物的所有起始材料、试剂、酸、碱、脱水剂、溶剂和催化剂是可商购的，或者可以根据本领域技术人员熟知的有机合成方法来制备。此外，如以下实例所示，本发明的化合物可以根据本领域技术人员熟知的有机合成方法来制备。

实例中使用的缩写是常规的并且是本领域技术人员熟知的。以下示出一些缩写。

DIPEA：N，N-二异丙基乙胺

DMAP：4-(二甲基氨基)吡啶

DMSO：二甲亚砜

DMF：N，N-二甲基甲酰胺

EDC·HCl：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐

n-：正

tert-：叔

TFA：三氟乙酸

THF：四氢呋喃

LAH：氢化铝锂

TBAF：四-正丁基氟化铵

¹H NMR：质子核磁共振光谱法

在以下实例和生产实例中，“室温”通常指示约10℃至约35℃。除非另有说明，“％”指示重量百分比。

质子核磁共振光谱法的化学位移以来自四甲基硅烷的δ单位(ppm)记录。图谱中的缩写如下所示：

s：单峰，d：二重峰，t：三重峰，q：四重峰，quin：五重峰，m：多重峰，br：宽峰。

对于色谱法，使用山善集团(YAMAZEN Corporation)生产的Parallel Prep{柱：由山善集团生产，Hi-Flash柱(硅胶))，大小：S(16×60mm)、M(20×75mm)、L(26×100mm)、2L(26×150mm)}；或由拜泰齐公司(Biotage)生产的快速自动纯化系统Isolera{柱：SNAPCartridge KP-Sil(10g、25g、50g、100g、340g)}。

A.阳离子脂质的合成

[生产实例1]

9-溴壬酸苄酯的合成

将苯甲醇(1.3mL，12.6mmol)、9-溴壬酸(3.0g，12.65mmol)和DMAP(155mg，1.27mmol)溶解于二氯甲烷(25mL)中，在冰冷却下向其中添加EDC·HCl(2.67g，13.92mmol)，并将混合物在室温搅拌2小时。向反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，并用乙醚萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(正庚烷/乙酸乙酯)纯化以获得标题化合物(3.7g，11.31mmol)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.22-1.48(m，8H)，1.58-1.71(m，2H)，1.78-1.90(m，2H)，2.30-2.40(m，2H)，3.35-3.44(m，2H)，5.12(s，2H)，7.26-7.45(m，5H)。

[生产实例2]

4-戊基壬烷-1-醇的合成

(1)2-戊基庚烷-1-醇的合成

将2-戊基庚酸(2.0g，9.98mmol)溶解于THF(50mL)中，在-78℃向其中逐滴添加硼烷-THF复合物(1.0M，25.0mL，25.0mmol)。使混合物升温至室温并搅拌过夜。将混合物再次冷却至-78℃，进一步添加硼烷-THF复合物(1.0M，10.0mL，10.0mmol)，并将混合物在室温搅拌过夜。添加饱和氯化铵水溶液，并用乙醚萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(环己烷/乙酸乙酯)纯化以获得标题化合物(1.40g，7.49mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.89(t，J＝7.2Hz，6H)，1.24-1.35(m，19H)，1.45-1.47(m，1H)，1.62-1.71(m，1H)，3.54(br d，J＝5.5Hz，2H)。

(2)2-戊基庚醛的合成

在-78℃，向草酰氯(1.3mL，15.0mmol)在二氯甲烷(1.0mL)中的溶液中逐滴添加DMSO(2.1mL，30.0mmol)在二氯甲烷(1.0mL)中的溶液。搅拌30分钟后，添加生产实例2-(1)中获得的化合物(1.40g，7.49mmol)在二氯甲烷(2.0mL)中的溶液。搅拌1小时后，添加三乙胺(5.2mL，37.5mmol)。加热至室温后，将混合物搅拌2小时，并添加水以分离有机相。用水和饱和氯化钠溶液洗涤有机相，并通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(环己烷/乙醚)纯化以获得标题化合物(1.26g，6.82mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.89(t，J＝6.8Hz，7H)，1.19-1.34(m，13H)，1.40-1.47(m，4H)，1.57(s，1H)，1.58-1.66(m，2H)，2.15-2.28(m，1H)，2.66(s，1H)，9.56(d，J＝3.3Hz，1H)。

(3)4-戊基壬-2-烯酸乙酯的合成

在-78℃，向乙氧基羰基甲基(三苯基)溴化磷(2.23g，5.19mmol)在THF(14mL)中的溶液中逐滴添加六甲基二硅氮烷钠-THF溶液(1M，5.2mL，5.19mmol)。经2小时加热至0℃后，通过插管逐滴添加生产实例2-(2)中获得的化合物(0.48g，2.59mmol)在THF(4.0mL)中的液。在室温搅拌过夜后，将混合物在加热下回流4小时。添加水并用乙醚萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(环己烷/乙醚)纯化以获得标题化合物(0.28g，1.09mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.89(br t，J＝7.2Hz，5H)，0.87(br t，J＝7.0Hz，6H)，1.18-1.35(m，26H)，1.38-1.46(m，3H)，1.53-1.64(m，4H)，2.09-2.24(m，1H)，2.38(t，J＝7.5Hz，3H)，4.19(q，J＝7.0Hz，2H)，5.76(d，J＝15.8Hz，1H)，6.74(dd，J＝15.6，9.4Hz，1H)。

(4)4-戊基壬烷-1-醇的合成

在0℃，在氮气氛下，向生产实例2-(3)中获得的化合物(0.28g，1.10mmol)在THF(2.2mL)中的溶液中逐滴添加LAH-THF溶液(1M，2.2mL，2.2mmol)。将混合物加热至室温，并在加热下回流18小时。在0℃，将混合物用叔丁基甲基醚(4.6mL)稀释，并且然后顺序添加水(0.078mL)、氢氧化钠水溶液(15％，0.078mL)和水(0.234mL)。将反应混合物搅拌15分钟，通过Celite过滤并用乙醚洗涤。将滤液浓缩，并将残余物通过硅胶柱色谱法(环己烷/乙醚)进行纯化，以获得标题化合物(0.048g，0.22mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.89(t，J＝7.2Hz，6H)，1.19-1.33(m，21H)，1.43(s，1H)，1.47(br s，1H)，1.50-1.58(m，2H)，3.62(t，J＝6.8Hz，2H)。

[生产实例3]

3-戊基辛基9-溴壬酸酯的合成

在冰冷却下，向9-溴壬酸(1.61g，6.77mmol)在二氯甲烷(35mL)中的溶液中添加草酰氯(0.95mL，10.8mmol)，并且然后经40分钟添加DMF(0.050mL，0.68mmol)。在室温搅拌40分钟后，将混合物在减压下浓缩并与甲苯共沸。将残余物溶解于二氯甲烷(35mL)中，添加3-戊基辛烷-1-醇(1.36g，6.77mmol)，并将混合物在室温搅拌1小时。向反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，并用乙醚萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(环己烷/乙醚)纯化以获得标题化合物(2.22g，5.28mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.89(t，J＝7.3Hz，6H)，1.22-1.35(m，22H)，1.37-1.47(m，3H)，1.53-1.66(m，5H)，1.86(quin，J＝7.2Hz，2H)，2.29(t，J＝7.5Hz，2H)，3.41(t，J＝7.0Hz，2H)，4.09(t，J＝7.2Hz，2H)。

[生产实例4]

3-辛基十一烷-1-醇的合成

(1)(E)-2-十一碳烯酸乙酯的合成

在冰冷却下，向2-(二乙氧基磷酰基)乙酸乙酯(5.0mL，25.3mmol)在THF(40mL)中的悬浮液中逐渐添加60％氢化钠(0.93g，23.2mmol)。30分钟后，逐滴添加壬基醛(3.6mL，21.1mmol)在THF(40mL)中的溶液，并搅拌30分钟。在室温搅拌2小时后，将混合物用乙酸乙酯萃取。将有机相经无水硫酸镁干燥，并且过滤后通过在减压下蒸馏除去溶剂。在冰冷却下，向2-(二乙氧基磷酰基)乙酸乙酯(2.5mL，12.7mmol)在THF(20mL)中的悬浮液中逐渐添加60％氢化钠(1.0g，25.0mmol)，并且然后逐滴添加如上获得的粗产物在THF(20mL)中的溶液。搅拌1小时后，添加水并用乙酸乙酯萃取。将有机相经无水硫酸镁干燥，并且过滤后通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(环己烷/乙醚)纯化以获得标题化合物(3.07g，14.6mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.22-1.35(m，14H)，1.41-1.50(m，2H)，2.15-2.23(m，2H)，4.14-4.22(m，2H)，5.81(dt，J＝15.6，1.5Hz，1H)，6.96(dt，J＝15.6，7.0Hz，1H)。

(2)3-辛基十一酸乙酯的合成

将溴化铜(I)(0.21g，1.45mmol)和氯化锂(0.12g，2.89mmol)悬浮于THF(40mL)中，并在室温搅拌10分钟。在冰冷却下，顺序添加生产实例4-(1)中获得的化合物(3.07g，14.46mmol)和氯三甲基硅烷(2.2mL，17.4mmol)，并搅拌20分钟。逐滴添加辛基溴化镁-THF溶液(2.0M，8.7mL，17.4mmol)，并再搅拌1.5小时。添加饱和氯化铵水溶液，并用乙醚萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(环己烷/乙醚)纯化以获得标题化合物(4.43g，13.58mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.88(t，J＝7.1Hz，6H)，1.19-1.33(m，34H)，1.35-1.35(m，1H)，1.84(br d，J＝5.0Hz，1H)，2.21(d，J＝7.0Hz，2H)，4.12(q，J＝7.2Hz，2H)。

(3)3-辛基十一烷-1-醇的合成

在室温，在氮气氛下，向生产实例4-(2)中获得的化合物(4.43g，13.56mmol)在THF(30mL)中的溶液中逐滴添加LAH-THF溶液(2M，13.6mL，27.1mmol)。在65℃加热5小时后，在冰冷却下依次添加水(1mL)、氢氧化钠水溶液(2M，1mL)和水(2mL)。将反应混合物搅拌10分钟，通过Celite过滤并用乙醚洗涤。将滤液在减压下浓缩，并将残余物通过硅胶柱色谱法(环己烷/乙醚)纯化以获得标题化合物(4.43g，定量)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.88(t，J＝7.1Hz，6H)，1.12(br s，1H)，1.19-1.33(m，30H)，1.39-1.44(m，2H)，1.49-1.54(m，2H)，3.62-3.71(m，2H)。

[生产实例5]

3-辛基十一烷基6-溴己酸酯的合成

将生产实例4中获得的化合物(3.46g，12.16mmol)、6-溴己酸(2.61g，13.38mmol)和DMAP(0.15g，1.22mmol)溶解于二氯甲烷(22mL)中，在冰冷却下向其中添加EDC·HCl(2.91g，15.20mmol)，并将混合物在室温搅拌3天。将反应混合物在减压下浓缩，并用乙醚稀释。将反应混合物用饱和碳酸氢钠水溶液、水和10％柠檬酸水溶液洗涤，并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(正庚烷/乙酸乙酯)纯化

以获得标题化合物(4.67g，10.09mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.88(t，J＝7.0Hz，6H)，1.21-1.32(m，30H)，1.39(br s，1H)，1.44-1.51(m，2H)，1.57(q，J＝7.0Hz，2H)，1.66(quin，J＝7.6Hz，2H)，1.84-1.91(m，2H)，2.31(t，J＝7.4Hz，2H)，3.40(t，J＝6.7Hz，2H)，4.09(t，J＝7.2Hz，2H)。

[生产实例6]

4-溴丁酸苄酯的合成

在室温，向4-溴丁酸(2.94g，17.61mmol)在二氯甲烷(88mL)中的溶液中依次添加草酰氯(1.6mL，18.5mmol)和DMF(0.40mL，1.8mmol)。在室温搅拌30分钟后，添加苯甲醇(1.90mg，17.61mmol)并搅拌15分钟。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物通过硅胶柱色谱法(环己烷/乙醚)纯化以获得标题化合物(3.64g，14.09mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.61(s，1H)，2.21(quin，J＝6.8Hz，2H)，2.57(t，J＝7.3Hz，2H)，3.47(t，J＝6.4Hz，2H)，5.15(s，2H)，7.33-7.40(m，5H)。

[生产实例7]

4-壬基十三烷-1-醇的合成

(1)(E)-2-十二碳烯酸乙酯的合成

在冰冷却下，向60％氢化钠(1.28g，32.0mmol)在1，2-二甲氧基乙烷(70mL)中的悬浮液中逐滴添加2-(二乙氧基磷酰基)乙酸乙酯(6.4mL，32.0mmol)。20分钟后，添加癸醛(5.0mL，32.0mmol)在1，2-二甲氧基乙烷(30mL)中的溶液，并将混合物在室温搅拌过夜。添加饱和氯化铵水溶液，并用乙酸乙酯萃取。将有机相经无水硫酸镁干燥，并且过滤后通过在减压下蒸馏除去溶剂。将有机相经无水硫酸镁干燥，并且过滤后通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(正戊烷/乙醚)纯化以获得标题化合物(5.18g，23.0mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.88(t，J＝7.06Hz，4H)，1.25-1.32(m，18H)，1.45(dt，J＝14.5，7.3Hz，2H)，2.15-2.22(m，2H)，4.15-4.26(m，2H)，5.72-5.90(m，1H)，6.96(dt，J＝15.6，7.0Hz，1H)。

(2)3-壬基十二烷酸乙酯的合成

根据生产实例4-(2)中的方法，标题化合物(2.76g，7.84mmol)获得自：生产实例7-(1)中获得的化合物(2.22g，9.80mmol)、溴化铜(I)(0.141g，0.98mmol)、氯化锂(0.083g，1.96mmol)、氯三甲基硅烷(1.4mL，10.8mmol)、壬基溴化镁-THF溶液(1.0M，10.8mL，10.8mmol)和THF(53mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.77(t，J＝7.0Hz，9H)，1.04(br d，J＝7.3Hz，1H)，1.11-1.26(m，48H)，1.29-1.39(m，1H)，1.44(s，1H)，1.68-1.84(m，1H)，2.05-2.09(m，1H)，2.09-2.16(m，2H)，3.46(t，J＝6.8Hz，1H)，3.42-3.49(m，1H)，4.01(q，J＝7.0Hz，2H)，4.07(q，J＝7.3Hz，1H)，5.70(dt，J＝15.7，1.5Hz，1H)，6.85(dt，J＝15.8，7.0Hz，1H)，7.15(s，1H)。

(3)3-壬基十二烷-1-醇的合成

根据生产实例4-(3)中的方法，标题化合物(1，34g，4.29mmol)获得自：生产实例7-(2)中获得的化合物(2.76g，7.80mmol)、LAH-THF溶液(1M，10.1mL，10.1mmol)和THF(15mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.89(t，J＝7.0Hz，6H)，1.18(brs，2H)，1.23-1.33(m，33H)，1.43(br d，J＝9.9Hz，1H)，1.53(q，J＝6.8Hz，2H)，1.59(br s，1H)，3.67(t，J＝7.2Hz，2H)。

(4)3-壬基十二烷的合成

根据生产实例2-(2)中的方法，标题化合物(0.30g，定量)获得自：生产实例7-(3)中获得的化合物(0.30g，0.97mmol)、草酰氯(0.17mL，1.94mmol)、DMSO(0.27mL，3.88mmol)和三乙胺(0.68mL，4.85mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.89(t，J＝7.0Hz，6H)，1.15-1.38(m，1H)，1.44(s，9H)，1.55(s，1H)，1.95(br s，1H)，2.33(dd，J＝6.6，2.6Hz，2H)，9.77(t，J＝2.4Hz，1H)。

(5)10-(3-甲氧基烯丙基)十九烷的合成

在-78℃，向(甲氧基甲基)三苯基氯化磷(1.10g，3.21mmol)在THF(5.0mL)中的溶液中逐滴添加六甲基二硅氮烷钠-THF溶液(1M，3.2mL，3.2mmol)。15分钟后，在冰冷却下通过插管将混合物添加至生产实例7-(4)中获得的化合物(0.50g，1.60mmol)在THF(2.0mL)中的溶液中。搅拌1.5小时后，添加水并用乙醚萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(环己烷/乙醚)纯化以获得标题化合物(0.33g，0.98mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.89(t，J＝7.0Hz，6H)，1.20-1.35(m，28H)，1.41-1.48(m，1H)，1.55(s，1H)，1.88(t，J＝6.4Hz，1H)，1.96-2.11(m 1H)，3.52(s，1H)，3.57(s，1H)，4.32(q，J＝7.3Hz，1H)，4.69(dt，J＝12.7，7.4Hz，1H)，5.91(d，J＝6.2Hz，1H)，6.25(d，J＝12.8Hz，1H)。

(6)4-壬基十三烷的合成

在室温，将生产实例7-(5)中获得的化合物(0.33g，0.97mmol)溶解于THF(2.0mL)中，并添加1N盐酸(2.95mL，2.95mmol)，并在70℃加热。36小时后，添加水并用乙醚萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂，以获得标题化合物(0.28g，0.87mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.89(t，J＝7.0Hz，7H)，1.20-1.34(m，39H)，1.44(s，1H)，1.54-1.62(m，3H)，2.37-2.43(m，2H)，9.78(t，J＝1.8Hz，1H)。

(7)4-壬基十三烷-1-醇的合成

在0℃，将生产实例7-(6)中获得的化合物(0.28g，0.88mmol)溶解于乙醇(13mL)中，并向其中添加硼氢化钠(0.13g，3.50mmol)。1.5小时后，添加饱和氯化铵水溶液，并用二氯甲烷萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将有机相经无水硫酸镁干燥，并且过滤后通过在减压下蒸馏除去溶剂以获得标题化合物(0.28g，0.86mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.89(t，J＝7.0Hz，6H)，1.20-1.33(m，37H)，1.44(s，1H)，1.49-1.65(m，3H)，3.63(t，J＝6.8Hz，2H)。

[生产实例8]

5-溴戊酸苄酯的合成

根据生产实例6中的方法，标题化合物(5.39g，19.89mmol)获得自5-溴戊酸(4.0g，22.1mmol)、苯甲醇(2.3mL，22.1mmol)、二氯甲烷(110mL)、草酰氯(2.0mL，23.2mmol)和DMF(0.17mL，2.21mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.62(s，1H)，1.79-1.85(m，2H)，1.88-1.93(m，2H)，2.41(t，J＝7.3Hz，2H)，3.41(t，J＝6.6Hz，2H)，5.14(s，2H)，7.33-7.40(m，5H)。

[生产实例9]

3-己基壬烷-1-醇的合成

(1)3-己基壬酸甲酯的合成

根据生产实例4-(2)中的方法，标题化合物(4.18g，16.27mmol)获得自(E)-2-壬烯酸甲酯(3.6mL，18.92mmol)、溴化铜(I)(0.275g，1.92mmol)、氯化锂(0.160g，3.76mmol)、氯三甲基硅烷(2.7mL，21.27mmol)、己基溴化镁-THF溶液(2.0M，10.5mL，21.0mmol)和THF(50mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.86-0.91(m，7H)，1.12-1.37(m，25H)，1.79-1.87(m，1H)，2.23(d，J＝6.8Hz，2H)，3.66(s，3H)。

(2)3-己基壬烷-1-醇的合成

根据生产实例4-(3)中的方法，标题化合物(2，33g，10.14mmol)获得自：生产实例9-(1)中获得的化合物(4.0g，15.6mmol)、LAH-THF溶液(2.4M，13.0mL，31.2mmol)和THF(60mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.88(t，J＝7.0Hz，6H)，1.13(br s，1H)，1.19-1.34(m，20H)，1.41(br s，1H)，1.49-1.57(m，4H)，3.66(br d，J＝5.5Hz，2H)。

[生产实例10]

8-溴辛酸苄酯的合成

根据生产实例1中的方法，将苯甲醇(1.3mL，12.5mmol)、8-溴辛酸(3.06g，12.73mmol)和DMAP(0.15g，1.25mmol)溶解于二氯甲烷(60mL)中，在冰冷却下向其中添加EDC·HCl(2.99g，15.61mmol)，并将混合物在室温搅拌2小时。向反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，并用乙醚萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(正庚烷/乙酸乙酯)纯化以获得标题化合物(3.91g，12.5mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.22-1.48(m，6H)，1.58-1.71(m，2H)，1.78-1.90(m，2H)，2.30-2.38(m，2H)，3.33-3.45(m，2H)，5.12(s，2H)，7.28-7.44(m，5H)。

<阳离子脂质(1)的合成>

[实例-A-1]

(3S)-2-{9-氧代-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基1-甲基吡咯烷-3-甲酸酯(阳离子脂质1)的合成

(1)9-苄基1，1-二叔丁基壬烷-1，1，9-三甲酸酯的合成

将氢化钠(60％，0.43g，10.85mmol)悬浮于DMF(40mL)中，在冰冷却下向其中逐渐添加丙二酸二叔丁酯(2.2mL，9.87mmol)，并且将混合物搅拌5分钟，并在除去冷却浴后搅拌20分钟。在冰冷却下，顺序添加碘化钠(0.44g，2.96mmol)和生产实例1中获得的化合物(3.39g，10.36mmol)，并在室温搅拌15小时。将反应混合物在冰水浴中冷却，添加水，并用乙醚萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(正庚烷/乙酸乙酯)纯化以获得标题化合物(3.6g，7.78mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.25-1.33(m，9H)，1.36(s，1H)，1.39(s，1H)，1.44-1.49(m，16H)，1.56-1.67(m，3H)，1.79(q，J＝6.7Hz，2H)，2.35(t，J＝7.5Hz，2H)，3.11(t，J＝7.7Hz，1H)，5.12(s，2H)，7.32-7.39(m，5H)。

(2)1-苄基9，9-二叔丁基十八烷-1，9，9-三甲酸酯的合成

将实施例A-1-(1)中获得的化合物(3.6g，7.78mmol)溶解于DMF(36mL)中，在水冷却下向其中添加60％氢化钠(0.47g，11.67mmol)，并将混合物搅拌10分钟，并且然后在室温搅拌20分钟。添加1-碘代十四烷(3.3mL，15.56mmol)，并且将混合物在室温搅拌4小时。将反应混合物在冰水浴中冷却，添加饱和氯化铵水溶液，并用正庚烷萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(正庚烷/乙酸乙酯)纯化以获得标题化合物(3.4g，5.64mmol)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.83-0.93(m，3H)，1.05-1.36(m，26H)，1.44(s，18H)，1.57-1.68(m，2H)，1.71-1.82(m，4H)，2.29-2.39(m，2H)，5.11(s，2H)，7.28-7.42(m，5H)。

(3)2-[9-(苄基氧基)-9-氧代壬基]十二烷酸的合成

将实例A-1-(2)中获得的化合物(3.4g，5.64mmol)溶解于二氯甲烷(11.2mL)中，在冰冷却下向其中逐滴添加TFA(5.6mL)并将混合物在室温搅拌1.5小时。向反应混合物中添加甲苯并且将溶剂通过在减压下蒸馏除去。通过重复添加和通过两次蒸馏除去甲苯来干燥残余物，以获得2-{9-[(2-丁基辛基)氧基]-9-氧代壬基}-2-癸基丙二酸的粗产物。将获得的粗产物溶解于二甲苯(12mL)中，并且在150℃搅拌8小时。将反应混合物冷却至室温并在减压下浓缩。将获得的残余物通过柱色谱法(正庚烷/乙酸乙酯)纯化以获得标题化合物(2.26g，5.06mmol)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.81-0.95(m，3H)，1.18-1.37(m，26H)，1.39-1.52(m，2H)，1.54-1.69(m，4H)，2.28-2.41(m，3H)，5.11(s，2H)，7.28-7.40(m，5H)。

(4)10-(羟甲基)二十烷酸苄酯的合成

将实例A-1-(3)中获得的化合物(2.2g，4.93mmol)溶解于THF(25mL)中，在-15℃向其中逐滴添加硼烷-THF复合物(0.92，8.0mL，7.39mmol)并将混合物在0℃搅拌2小时。添加饱和碳酸氢钠水溶液，并且将混合物在室温搅拌5分钟并用乙酸乙酯萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(正庚烷/乙酸乙酯)纯化以获得标题化合物(1.86g，4.30mmol)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.81-0.95(m，3H)，1.12-1.38(m，31H)，1.39-1.50(m，1H)，1.58-1.72(m，2H)，2.23-2.36(m，2H)，3.48-3.59(m，2H)，5.11(s，2H)，7.28-7.41(m，5H)。

(5)10-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}二十烷酸苄酯的合成

将实例A-1-(4)中获得的化合物(700mg，1.62mmol)溶解于DMF(3.2mL)中，并向其中添加咪唑(165mg，2.43mmol)并使其在室温溶解。在冰冷却下，添加叔丁基二甲基氯硅烷(293mg，1.94mmol)并且将混合物在室温搅拌3小时。向反应混合物中添加水并且然后用乙醚萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(正庚烷/乙酸乙酯)纯化以获得标题化合物(810mg，1.48mmol)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.02(s，6H)，0.77-0.97(m，12H)，1.06-1.47(m，31H)，1.64(br.s，2H)，2.35(t，J＝7.5Hz，2H)，3.45(d，J＝5.7Hz，2H)，5.11(s，2H)，7.27-7.42(m，5H)。

(6)3-戊基辛基10-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}二十烷酯的合成

将实例A-1-(5)中获得的化合物(810mg，1.48mmol)溶解于乙酸乙酯(10mL)中，在室温向其中添加10％的钯-碳(158mg，含有50％水)，并且将混合物在氢气氛中于常压下搅拌4.5小时。将反应混合物过滤并用乙酸乙酯洗涤。将滤液在减压下浓缩，以获得羧酸的粗产物(680mg)。

将获得的羧酸、3-戊基辛烷-1-醇(CAS 1443519-63-8)(416mg，2.08mmol)和DMAP(36mg，0.30mmol)溶解于二氯甲烷(7.4mL)中，在冰冷却下向其中添加EDC·HCl(341mg，1.78mmol)，并将混合物在室温搅拌16小时。向反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，并用乙酸乙酯萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(正庚烷/乙酸乙酯)纯化以获得标题化合物(926mg，1.45mmol)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.02(s，5H)，0.88(s，17H)，1.12-1.46(m，46H)，1.55(s，8H)，2.21-2.34(m，2H)，3.39-3.52(m，2H)，4.00-4.13(m，2H)。

(7)3-戊基辛基10-(羟甲基)二十烷酯的合成

将实例A-1-(6)中获得的化合物(925mg，1.45mmol)溶解于THF(4.5mL)中，在冰冷却下向其中逐渐添加TBAF/THF溶液(1M，3.6mL)，并将混合物在室温搅拌1小时。向反应混合物中添加水并用乙酸乙酯萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(正庚烷/乙酸乙酯)纯化以获得标题化合物(584mg，1.11mmol)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.78-0.99(m，9H)，1.26(d，J＝2.9Hz，55H)，1.50-1.75(m，8H)，2.28(t，J＝7.6Hz，2H)，3.53(s，2H)，4.08(t，J＝7.0Hz，2H)。

(8)(3S)-2-{9-氧代-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基1-甲基吡咯烷-3-甲酸酯的合成

将实例A-1-(7)中获得的化合物(50mg，0.095mmol)、DIPEA(0.036mL，0.21mmol)，(3S)-1-甲基吡咯烷-3-甲酸盐酸盐(32mg，0.19mmol)和DMAP(2.3mg，0.019mmol)溶解于二氯甲烷(0.8mL)中，在冰冷却下向其中添加EDC·HCl(40mg，0.21mmol)，并将混合物在室温搅拌15小时。向反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，并用乙酸乙酯萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(正庚烷/乙酸乙酯/甲醇)纯化以获得标题化合物(47mg，0.074mmol)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.82-0.96(m，9H)，1.14-1.48(m，49H)，1.51-1.73(m，4H)，2.03-2.16(m，2H)，2.28(t，J＝7.5Hz，2H)，2.35(s，3H)，2.49(d，J＝9.0Hz，1H)，2.58-2.71(m，2H)，2.76-2.92(m，1H)，2.97-3.12(m，1H)，3.98(d，J＝5.7Hz，2H)，4.08(s，2H)。

<阳离子脂质(2)的合成>

[实例-A-2]

(3R)-2-{9-氧代-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基1-甲基吡咯烷-3-甲酸酯(阳离子脂质2)的合成

(1)(3R)-1-叔丁基3-(2-{9-氧代-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基)吡咯烷-1，3-二甲酸酯的合成

根据实例A-1-(8)中的方法，标题化合物(80mg，0.11mmol)获得自：实例A-1-(7)中获得的化合物(60mg，0.11mmol)、(R)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-甲酸(49mg，0.23mmol)、EDC·HCl(48mg，0.25mmo1)、DIPEA(0.039mL，0.23mmol)、DMAP(2.8mg，0.023mmol)和二氯甲烷(0.80mL)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.88(t，J＝7.0Hz，9H)，1.10-1.38(m，53H)，1.46(s，9H)，1.50-1.72(m，4H)，1.99-2.19(m，2H)，2.28(s，2H)，2.90-3.17(m，1H)，3.24-3.75(m，4H)，3.97-4.03(m，2H)，4.05-4.12(m，2H)。

(2)(3R)-2-{9-氧代-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基1-甲基吡咯烷-3-甲酸酯的合成

将实例A-2-(1)中获得的化合物(80mg，0.11mmol)溶解于二氯甲烷(2.2mL)中，在室温向其中逐滴添加TFA(1.1mL)并将混合物搅拌0.5小时。向反应混合物中添加甲苯并且将溶剂通过在减压下蒸馏除去。将残余物溶解于二氯甲烷(1mL)中，在室温向其中添加甲醛溶液(37％，0.25mL，3.3mmol)和硫酸钠(0.79g，5.54mmol)，并将混合物搅拌10分钟。添加三(乙酰氧基)硼氢化钠(117mg，0.55mmol)，并且将混合物在室温搅拌16小时。向反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液，并用氯仿萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇)纯化以获得标题化合物(20mg，0.031mmol)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.82-0.96(m，9H)，1.14-1.48(m，49H)，1.51-1.73(m，4H)，2.03-2.16(m，2H)，2.23-2.32(m，2H)，，2.35(s，3H)，2.49(d，J＝9.0 Hz，1H)，2.58-2.71(m，2H)，2.76-2.92(m，1H)，2.97-3.12(m，1H)，3.98(d，J＝5.7Hz，2H)，4.04-4.12(m，2H)。

<阳离子脂质(3)的合成>

[实例A-3]

2-{9-氧代-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基1-甲基吡咯烷-3-甲酸酯(阳离子脂质3)的合成

(1)2-[9-(苄基氧基)-9-氧代壬基]十二烷基1-甲基吡咯烷-3-甲酸酯的合成

将实例A-1-(4)中获得的化合物(0.20g，0.46mmol)、DIPEA(0.161mL，0.92mmol)，和1-甲基吡咯烷-3-甲酸盐酸盐(0.15mg，0.92mmol)溶解于二氯甲烷(2.0mL)中，向其中添加EDC·HCl(0.19g，1.02mmol)，并将混合物在室温搅拌18小时。将反应混合物在减压下浓缩并且然后将残余物通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇)纯化以获得标题化合物(0.15g，0.28mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.89(t，J＝7.0Hz，3H)，1.27(s，40H)，1.61-1.67(m，3H)，1.74-1.86(m，1H)，2.07-2.13(m，2H)，2.34-2.38(m，6H)，2.47-2.52(m，1H)，2.61-2.66(m，2H)，2.85(t，J＝8.8Hz，1H)，3.02-3.07(m，1H)，3.99(d，J＝5.9Hz，2H)，5.08(s，1H)，5.12(s，2H)，7.31-7.38(m，5H)。

(2)2-{9-氧代-9-[(4-戊基壬基)氧基]壬基}十二烷基1-甲基吡咯烷-3-甲酸酯的合成

根据实例A-1-(6)，羧酸的粗产物获得自：实例A-3-(1)中获得的化合物(0.15g，0.28mmol)、10％钯/碳(0.30g，含有50％水)和乙酸乙酯(5mL)。

标题化合物(0.081g，0.14mmol)获得自：获得的羧酸、生产实例2-(4)中获得的化合物(0.048g，0.23mmol)、EDC·HCl(0.086g，0.45mmol)、DMAP(0.005g，0.05mmol)和二氯甲烷(1.0mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.86-0.91(m，9H)，1.20-1.33(m，54H)，1.56-1.65(m，5H)，2.05-2.14(m，2H)，2.29(t，J＝7.7Hz，2H)，2.36(s，3H)，2.50(q，J＝7.7Hz，1H)，2.60-2.67(m，2H)，2.86(t，J＝8.8Hz，1H)，3.01-3.07(m，1H)，3.99(d，J＝5.9Hz，2H)，4.05(t，J＝6.8Hz，2H)，4.52(d，J＝4.8Hz，1H)，5.30(s，1H)，5.40(br d，J＝4.0Hz，1H)，5.47-5.53(m，1H)。

<阳离子脂质(4)的合成>

[实例A-4]

2-壬基-11-氧代-11-[(3-戊基辛基)氧基]十一烷基1-甲基吡咯烷-3-甲酸酯(阳离子脂质4)的合成

(1)1，1-二叔丁基9-(3-戊基辛基)壬烷-1，1，9-三甲酸酯的合成

将丙二酸二叔丁酯(1.20g，5.56mmol)溶解于THF(26mL)中，在冰冷却下向其中添加60％氢化钠(0.22g，5.56mmol)，并将混合物搅拌15分钟。将混合物在室温搅拌10分钟，并且然后添加在生产实例3中获得的化合物(2.22g，5.29mmol)在THF(3mL)中的溶液。将混合物在室温搅拌18小时，添加水并用乙醚萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(环己烷/乙醚)纯化以获得标题化合物(1.79g，3.39mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.89(t，J＝7.2Hz，6H)，1.26(br s，12H)，1.27-1.34(m，13H)，1.46(s，13H)，1.48(s，8H)，1.54-1.64(m，5H)，1.79(br d，J＝7.0Hz，2H)，2.28(t，J＝7.5Hz，2H)，3.11(t，J＝7.7Hz，1H)，3.19(s，1H)，3.41(s，1H)，4.08(t，J＝7.2Hz，2H)。

(2)9，9-二叔丁基1-(3-戊基辛基)十八烷-1，9，9-三甲酸酯的合成

将实例A-4-(1)中获得的化合物(0.96g，1.72mmol)溶解于THF(7.6mL)中，在冰冷却下向其中添加60％氢化钠(0.076g，1.89mmol)并将混合物搅拌20分钟。在室温搅拌20分钟之后，添加1-碘壬烷(0.44g，1.72mmol)在THF(2mL)中的溶液。在加热下回流6小时后，添加水并用乙醚萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(环己烷/乙醚)纯化以获得标题化合物(0.59g，0.86mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.83-0.94(m，12H)，1.13(brs，6H)，1.27(br d，J＝16.5Hz，43H)，1.31-1.36(m，4H)，1.41-1.48(m，28H)，1.51-1.65(m，5H)，1.70-1.85(m，6H)，2.22-2.34(m，2H)，4.02-4.15(m，2H)。

(3)2-壬基-11-氧代-11-[(3-戊基辛基)氧基]十一烷酸的合成

根据实例A-1-(3)中的方法，标题化合物(0.18g，0.35mmol)获得自：实例A-4-(2)中获得的化合物(0.59g，0.86mmol)、二氯甲烷(2mL)、TFA(1mL)和二甲苯(2mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.84-0.92(m，9H)，1.17-1.33(m，42H)，1.36-1.51(m，4H)，1.54-1.66(m，6H)，2.24-2.37(m，3H)，4.09(t，J＝7.2Hz，2H)。

(4)3-戊基辛基10-(羟甲基)十九烷酸酯的合成

根据生产实例2-(1)中的方法，标题化合物(0，068g，0.14mmol)获得自：实例A-4-(3)中获得的化合物(0.093g，0.18mmol)、硼烷-THF复合物(1M，0.35mL，0.35mmol)、硼烷-THF复合物(1M，0.53mL，0.53mmol)和THF(2.0mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.87-0.90(m，10H)，1.27(br dd，J＝11.4，7.3Hz，52H)，1.40-1.46(m，7H)，1.56-1.63(m，4H)，2.28(t，J＝7.5Hz，2H)，3.53(d，J＝5.5Hz，2H)，4.08(t，J＝7.2Hz，2H)。

(5)2-壬基-11-氧代-11-[(3-戊基辛基)氧基]十一烷基1-甲基吡咯烷-3-甲酸酯的合成

将实例A-4-(4)中获得的化合物(0.069g，0.13mmol)、DIPEA(0.047mL，0.27mmol)、1-甲基吡咯烷-3-甲酸盐酸盐(0.044g，0.27mmol)和DMAP(3mg，0.03mmol)溶解于二氯甲烷(1mL)和THF(1mL)中，向其中添加EDC·HCl(0.057g，0.30mmol)，并且将混合物在室温搅拌18小时。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇)纯化以获得标题化合物(0.046mg，0.072mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.89(t，J＝7.0Hz，3H)，0.89(t，J＝7.2Hz，6H)，1.19-1.33(m，46H)，1.41(br s，1H)，1.58(q，J＝7.0Hz，2H)，1.60-1.66(m，3H)，1.70(br s，1H)，2.07-2.17(m，2H)，2.29(t，J＝7.5Hz，2H)，2.36(s，3H)，2.50(q，J＝8.0Hz，1H)，2.58-2.69(m，2H)，2.85(t，J＝9.0Hz，1H)，3.05(tt，J＝8.8，6.7Hz，1H)，3.99(d，J＝5.9Hz，2H)，4.09(t，J＝7.2Hz，2H)。

<阳离子脂质(5)的合成>

[实例A-5]

2-{6-[(3-辛基十一烷基)氧基]-6-氧代己基}十二烷基1-甲基吡咯烷-3-甲酸酯(阳离子脂质5)的合成

(1)1，1-二叔丁基6-(3-辛基十一烷基)己烷-1，1，6-三甲酸酯的合成

将氢化钠(60％，0.43g，10.62mmol)悬浮于THF(21mL)中，在冰冷却下向其中逐滴添加丙二酸二叔丁酯(2.4mL，10.6mmol)。经30分钟将混合物加热至室温，在冰冷却下添加生产实例5中获得的化合物(4.67g，10.12mmol)和碘化钠(0.15g，1.01mmol)，并在室温搅拌18小时。向反应混合物中添加水并用乙醚萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(环己烷/乙醚)纯化以获得标题化合物(2.9g，5.10mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.88(t，J＝7.0Hz，6H)，1.19-1.31(m，31H)，1.31-1.36(m，5H)，1.41-1.51(m，26H)，1.55-1.58(m，2H)，1.59-1.67(m，2H)，1.79(q，J＝7.3Hz，2H)，2.27(t，J＝7.5Hz，2H)，3.10(t，J＝7.5Hz，1H)，4.07(t，J＝7.2Hz，2H)。

(2)6，6-二叔丁基1-(3-辛基十一烷基)十六烷-1，6，6-三甲酸酯的合成

根据实例A-4-(2)中的方法，标题化合物(0.99mg，1.32mmol)获得自：实例A-5-(1)中获得的化合物(2.25mg，3.78mmol)、1-碘代十四烷(1.0g，3.78mmol)、60％氢化钠(0.17g，4.15mmol)和THF(16.7mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.01(s，1H)，0.89(td，J＝7.1，2.8Hz，9H)，1.06-1.23(m，6H)，1.26(br d，J＝7.0Hz，34H)，1.30-1.37(m，5H)，1.40(br s，1H)，1.42-1.49(m，18H)，1.52-1.65(m，6H)，1.71-1.85(m，4H)，2.28(t，J＝7.5Hz，2H)，4.08(t，J＝7.2Hz，2H)。

(3)2-{6-[(3-辛基十一烷基)氧基]-6-氧代己基}十二烷酸的合成

根据实例A-1-(3)中的方法，二羧酸的粗产物(1.01g)获得自：实例A-5-(2)中获得的化合物(0.99g，1.34mmol)、二氯甲烷(3mL)和TFA(1.4mL)。标题化合物(0.31g，0.55mmol)获得自：获得的粗产物(0.84g)和二甲苯(3mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.89(t，J＝7.0Hz，11H)，1.23-1.36(m，60H)，1.40(br s，1H)，1.48(br dd，J＝13.8，6.1Hz，2H)，1.56-1.66(m，7H)，2.29(t，J＝7.5Hz，2H)，2.33-2.36(m，1H)，4.09(t，J＝7.2Hz，2H)。

(4)3-辛基十一烷基7-(羟甲基)十七烷酸酯的合成

根据生产实例2-(1)中的方法，标题化合物(0.19g，0.33mmol)获得自：实例A-5-(3)中获得的化合物(0.31g，0.54mmol)、硼烷-THF复合物(1M，1.1mL，1.1mmol)和THF(6.0mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.89(t，J＝7.0Hz，10H)，1.22-1.37(m，55H)，1.40(br s，1H)，1.43-1.47(m，1H)，1.57(q，J＝6.6Hz，3H)，1.61-1.70(m，2H)，2.29(t，J＝7.5Hz，2H)，3.54(d，J＝5.5Hz，2H)，4.09(t，J＝7.2Hz，2H)。

(5)2-{6-[(3-辛基十一烷基)氧基]-6-氧代己基}十二烷基1-甲基吡咯烷-3-甲酸酯的合成

根据实例A-4-(5)中的方法，标题化合物(0.055g，0.083mmol)获得自：实例A-5-(4)中获得的化合物(0.19mg，0.33mmol)、1-甲基吡咯烷-3-甲酸盐酸盐(0.11g，0.67mmol)、EDC·HCl(0.14g，0.73mmol)、DIPEA(0.116mL，0.67mmol)，DMAP(8mg，0.07mmol)和二氯甲烷(1.5mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.89(t，J＝7.0Hz，9H)，1.20-1.34(m，53H)，1.40(br s，1H)，1.57(q，J＝6.8Hz，2H)，1.61-1.66(m，3H)，2.05-2.17(m，2H)，2.29(t，J＝7.5Hz，2H)，2.37(s，3H)，2.45-2.56(m，1H)，2.64(dd，J＝9.5，7.0Hz，1H)，2.68(dt，J＝9.1，6.5Hz，1H)，2.90(t，J＝8.8Hz，1H)，3.06(quin，J＝7.8Hz，1H)，3.99(d，J＝5.9Hz，2H)，4.08(t，J＝7.2Hz，2H)。

<阳离子脂质(6)的合成>

[实例A-6]

2-{4-[(4-壬基十三烷基)氧基]-4-氧代丁基}十二烷基1-甲基吡咯烷-3-甲酸酯(阳离子脂质6)的合成

(1)4-苄基1，1-二叔丁基丁烷-1，1，4-三甲酸酯的合成

根据实例A-4-(1)中的方法，标题化合物(2.93g，7.46mmol)获得自：丙二酸二叔丁酯(2.65g，12.25mmol)、THF(58mL)、60％氢化钠(0.49g，12.25mmol)和生产实例6中获得的化合物(3.00g，11.67mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.43-1.48(m，20H)，1.66-1.72(m，2H)，1.82-1.86(m，2H)，2.40(t，J＝7.5Hz，2H)，3.13(t，J＝7.5Hz，1H)，5.12(s，2H)，7.31-7.38(m，5H)。

(2)1-苄基4，4-二叔丁基十四烷-1，4，4-三甲酸酯的合成

将实例A-6-(1)中获得的化合物(2.93g，7.46mmol)溶解于THF(38mL)中，在冰冷却下向其中添加60％氢化钠(0.31g，7.83mmol)，并将混合物搅拌1小时。添加1-碘代十四烷(2.10g，7.83mmol)在THF(5mL)中的溶液，并在加热下回流过夜。添加水并用乙醚萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(环己烷/乙醚)纯化以获得标题化合物(2.59g，4.85mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.89(t，J＝7.2Hz，3H)，1.09-1.20(m，2H)，1.22-1.33(m，15H)，1.45(s，18H)，1.48-1.56(m，2H)，1.59(s，1H)，1.76-1.84(m，4H)，2.37(t，J＝7.3Hz，2H)，5.12(s，2H)，7.32-7.38(m，5H)。

(3)2-[4-(苄基氧基)-4-氧代丁基]十二烷酸的合成

根据实例A-1-(3)中的方法，二羧酸的粗产物(2.34g)获得自：实例A-6-(2)中获得的化合物(2.59g，4.87mmol)、二氯甲烷(11mL)和TFA(5mL)。标题化合物(1.58g，4.21mmol)获得自：获得的粗产物(2.05g)和二甲苯(11mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.89(t，J＝7.0Hz，3H)，1.07-1.22(m，1H)，1.24-1.32(m，16H)，1.41-1.57(m，2H)，1.60-1.74(m，4H)，2.34-2.41(m，3H)，5.10-5.15(m，2H)，7.31-7.40(m，5H)。

(4)2-{4-[(4-壬基十三烷基)氧基]-4-氧代丁基}十二烷基1-甲基吡咯烷-3-甲酸酯的合成

根据生产实例2-(1)中的方法，标题化合物(1，29g，3.54mmol)获得自：实例A-6-(3)中获得的化合物(1.58g，4.21mmol)、硼烷-THF复合物(1M，8.4mL，8.4mmol)和THF(48mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.89(t，J＝7.0Hz，3H)，1.24-1.34(m，22H)，1.35-1.42(m，2H)，1.46-1.50(m，1H)，1.67(quin，J＝7.7Hz，3H)，2.36-2.39(m，2H)，3.51-3.58(m，2H)，5.13(s，2H)，7.32-7.39(m，5H)。

(5)2-[4-(苄基氧基)-4-氧代丁基]十二烷基1-甲基吡咯烷-3-甲酸酯的合成

根据实例A-4-(5)中的方法，标题化合物(0.33g，0.71mmol)获得自：实例A-6-(4)中获得的化合物(0.50g，1.4mmol)、1-甲基吡咯烷-3-甲酸盐酸盐(0.46g，2.76mmol)、EDC·HCl(0.58g，3.03mmol)、DIPEA(0.48mL，2.76mmol)、DMAP(34mg，0.28mmol)和二氯甲烷(2mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.88(t，J＝7.0Hz，3H)，1.23-1.36(m，23H)，1.42(s，5H)，1.63-1.69(m，3H)，1.85(dt，J＝6.3，3.3Hz，1H)，2.06-2.11(m，2H)，2.33-2.36(m，6H)，2.49(q，J＝7.7Hz，1H)，2.59-2.64(m，2H)，2.82(t，J＝8.8Hz，1H)，2.94(s，1H)，3.02(br t，J＝8.3Hz，1H)，3.74(br t，J＝6.2Hz，1H)，3.96-4.00(m，2H)，5.11(s，2H)，7.31-7.37(m，5H)。

(6)2-{4-[(4-壬基十三烷基)氧基]-4-氧代丁基}十二烷基1-甲基吡咯烷-3-甲酸酯的合成

根据实例A-1-(6)，羧酸的粗产物(0.15g)获得自：实例A-6-(5)中获得的化合物(0.18g，0.37mmol)、10％钯/碳(0.20g，含有50％水)和乙酸乙酯(9mL)。

标题化合物(9mg，0.014mmol)获得自：获得的羧酸(0.086g，0.23mmol)、生产实例7-(7)中获得的化合物(0.050g，0.16mmol)、EDC·HCl(0.086g，0.45mmol)、DIPEA(0.074mL，0.45mmol)和二氯甲烷(1.0mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.89(t，J＝7.0Hz，9H)，1.21-1.37(m，57H)，1.57-1.70(m，7H)，2.06-2.15(m，2H)，2.30(t，J＝7.5Hz，2H)，2.36(s，3H)，2.45-2.57(m，1H)，2.64(ddd，J＝9.4，6.8，2.9Hz，2H)，2.85(t，J＝8.8Hz，1H)，3.00-3.08(m，1H)，3.97-4.07(m，4H)。

<阳离子脂质(7)的合成>

[实例A-7]

双(3-壬基十二烷基)6-{[(1-甲基吡咯烷-3-羰基)氧基]甲基}十一烷二酸酯(阳离子脂质7)的合成

(1)5-苄基1，1-二叔丁基戊烷-1，1，5-三甲酸酯的合成

根据实例A-4-(1)中的方法，标题化合物(2.09g，5.77mmol)获得自：丙二酸二叔丁酯(2.34g，10.84mmol)、THF(52mL)、60％氢化钠(0.26g，10.8mmol)和生产实例8中获得的化合物(2.8g，10.3mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.26-1.41(m，3H)，1.43-1.49(m，20H)，1.55-1.60(m，1H)，1.69(quin，J＝7.6Hz，2H)，1.78-1.86(m，2H)，2.37(t，J＝7.5Hz，2H)，3.11(t，J＝7.5Hz，1H)，5.11(s，2H)，7.31-7.40(m，5H)。

(2)1，9-二苄基5，5-二叔丁基壬烷-1，5，5，9-四甲酸酯的合成

将实例A-7-(1)中获得的化合物(2.09g，5.14mmol)溶解在THF(23mL)中，在室温向其中顺序添加60％氢化钠(0.23g，5.66mmol)和碘化钠(0.077g，0.51mmol)，并将混合物搅拌30分钟。向反应混合物中添加生产实例8中获得的化合物(1.39g，5.14mmol)在THF(2mL)中的溶液，并在65℃加热。3天后，添加冰水并用乙醚萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经无水硫酸镁干燥。过滤后，通过在减压下蒸馏除去溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法(乙醚/正戊烷)纯化以获得标题化合物(2.27g，3.80mmol)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.13-1.20(m，4H)，1.42(s，17H)，1.58-1.70(m，4H)，1.74-1.80(m，4H)，2.35(t，J＝7.6Hz，4H)，5.10(s，4H)，7.29-7.39(m，10H)。

(3)7-(苄基氧基)-2-[5-(苄基氧基)-5-氧代戊基]-7-氧代戊酸的合成

根据实例A-1-(3)中的方法，二羧酸的粗产物(2.02g)获得自：实例A-7-(2)中获得的化合物(2.27g，3.80mmol)、二氯甲烷(9mL)和TFA(4.1mL)。标题化合物(1.47g，3.34mmol)获得自：获得的粗产物和二甲苯(10mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.27-1.41(m，5H)，1.42-1.50(m，6H)，1.59-1.70(m，7H)，2.31-2.40(m，5H)，5.12(s，4H)，7.31-7.38(m，10H)。

(4)6-(羟甲基)十一烷二酸二苄酯的合成

根据生产实例2-(1)中的方法，标题化合物(1，14g，2.70mmol)获得自：实例A-7-(3)中获得的化合物(1.47g，3.33mmol)、硼烷-THF复合物(1M，6.7mL，6.7mmol)和THF(38mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.24-1.38(m，10H)，1.42-1.47(m，3H)，1.65(quin，J＝7.2Hz，4H)，1.71(br s，1H)，2.37(t，J＝7.5Hz，4H)，3.50(br d，J＝4.0Hz，2H)，5.12(s，4H)，7.31-7.39(m，7H)。

(5)6-{[(1-甲基吡咯烷-3-羰基)氧基)甲基]十一烷二酸二苄酯的合成

根据实例A-4-(5)中的方法，标题化合物(0.56g，1.05mmol)获得自：实例A-7-(4)中获得的化合物(1.14g，2.68mmol)、1-甲基吡咯烷酮-3-甲酸盐酸盐(0.89g，5.36mmol)、EDC·HCl(1.13g，5.90mmol)、DIPEA(0.93mL，5.36mmol)、DMAP(0.066g，0.54mmol)和二氯甲烷(12mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.26-1.38(m，9H)，1.59-1.70(m，5H)，1.81(br s，1H)，2.06-2.14(m，2H)，2.34-2.40(m，7H)，2.47-2.55(m，1H)，2.58-2.68(m，2H)，2.84(t，J＝8.8Hz，1H)，3.04(quin，J＝7.7Hz，1H)，3.98(d，J＝5.9Hz，2H)，5.13(s，4H)，5.32(s，1H)，7.28(s，1H)，7.32-7.40(m，10H)。

(6)双(3-壬基十二烷基)6-{[(1-甲基吡咯烷-3-羰基)氧基)甲基]十一烷二酸酯的合成

根据实例A-1-(6)，二羧酸的粗产物(0.24g)获得自：实例A-7-(5)中获得的化合物(0.56g，1.03mmol)、10％钯/碳(0.55g，含有50％水)和乙酸乙酯(27mL)。

标题化合物(0.029g，0.030mmol)获得自：获得的羧酸(0.055g，0.15mmol)、生产实例7-(3)中获得的化合物(0.096g，0.31mmol)、EDC·HCl(0.118g，0.62mmol)、DIPEA(0.11mL，0.62mmol)、DMAP(4mg，0.031mmol)和二氯甲烷(0.7mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.88(t，J＝7.0Hz，13H)，1.12-1.45(m，84H)，1.48-1.70(m，12H)，2.09(q，J＝7.3Hz，2H)，2.28(t，J＝7.6Hz，4H)，2.36(s，3H)，2.45-2.57(m，1H)，2.63(br dd，J＝8.9，6.9Hz，2H)，2.83(br t，J＝8.6Hz，1H)，3.03(quin，J＝7.7Hz，1H)，3.94-4.02(m，2H)，4.07(t，J＝7.2Hz，4H)。

<阳离子脂质(8)的合成>

[实例A-8]

双(3-戊基辛基)9-{[(1-甲基吡咯烷-4-羰基)氧基]甲基}十七烷二酸酯(阳离子脂质8)的合成

(1)8-苄基1，1-二叔丁基辛烷-1，1，8-三甲酸酯的合成

根据实例A-5-(1)中的方法，标题化合物(1.60g，3.57mmol)获得自：丙二酸二叔丁酯(1.5mL，6.70mmol)，生产实例10中获得的化合物(2.0g，6.39mmol)、60％氢化钠(0.27g，6.70mmol)、碘化钠(0.096g，0.64mmol)和THF(60mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.23-1.36(m，8H)，1.45(s，18H)，1.58-1.69(m，2H)，1.72-1.84(m，2H)，2.30-2.40(m，2H)，3.05-3.15(m，1H)，5.11(s，2H)，7.28-7.41(m，5H)。

(2)1，15-二苄基8，8-二叔丁基十五烷-1，8，8，15-四甲酸酯的合成

根据实例A-7-(2)中的方法，标题化合物(1.4g，2.07mmol)获得自：实例A-8-(1)中获得的化合物(1.6g，3.57mmol)、生产实例10中获得的化合物(1.17g，3.75mmol)、碘化钠(0.053g，0.36mmol)、60％氢化钠(0.16g，4.0mmol)和THF(15mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.03-1.17(m，4H)，1.23-1.36(m，12H)，1.43(s，18H)，1.56-1.68(m，4H)，1.70-1.80(m，4H)，2.29-2.38(m，4H)，5.11(s，4H)，7.27-7.41(m，10H)。

(3)10-(苄基氧基)-2-[8-(苄基氧基)-8-氧代辛基]-10-氧代十二烷酸的合成

根据实例A-1-(3)中的方法，二羧酸的粗产物(1.17g)获得自：实例A-8-(2)中获得的化合物(1.40g，2.06mmol)、二氯甲烷(10mL)和TFA(2.4mL)。标题化合物(0.83g，1.61mmol)获得自：获得的粗产物和二甲苯(25mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.18-1.37(m，16H)，1.38-1.71(m，8H)，2.26-2.41(m，5H)，5.11(s，4H)，7.28-7.43(m，10H)。

(4)9-(羟甲基)十七烷二酸二苄酯的合成

根据生产实例2-(1)中的方法，标题化合物(0，72g，1.43mmol)获得自：实例A-8-(3)中获得的化合物(0.83g，1.59mmol)、硼烷-THF复合物(1M，4.0mL，4.0mmol)和THF(6.0mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.12-1.51(m，22H)，1.56-1.72(m，4H)，2.29-2.41(m，4H)，3.47-3.58(m，2H)，5.11(s，4H)，7.28-7.44(m，10H)。

(5)9-{[(1-甲基吡咯烷-3-羰基)氧基)甲基]十七烷二酸二苄酯的合成

根据实例A-4-(5)中的方法，标题化合物(0.81g，1.30mmol)获得自：实例A-8-(4)中获得的化合物(0.73g，1.43mmol)、1-甲基吡咯烷-3-甲酸盐酸盐(0.36g，2.14mmol)、EDC·HCl(0.438g，2.29mmol)、DIPEA(0.37mL，2.14mmol)、DMAP(0.035g，0.29mmol)和二氯甲烷(6mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.13-1.35(m，22H)，1.58-1.69(m，5H)，2.04-2.14(m，2H)，2.29-2.39(m，7H)，2.43-2.54(m，1H)，2.57-2.67(m，2H)，2.84(t，J＝8.8Hz，1H)，2.99-3.08(m，1H)，3.97(d，J＝5.7Hz，2H)，5.11(s，4H)，7.29-7.40(m，9H)。

(6)双(3-己基壬基)9-{[(1-甲基吡咯烷-3-羰基)氧基)甲基]十七烷二酸酯的合成

根据实例A-1-(6)，二羧酸的粗产物(0.66g)获得自：实例A-8-(5)中获得的化合物(0.81g，1.30mmol)、10％钯/碳(0.028g，含有50％水)和乙酸乙酯(15mL)。

标题化合物(0.077g，0.090mmol)获得自：获得的二羧酸(0.10g，0.23mmol)、生产实例9-(2)中获得的化合物(0.124g，0.54mmol)、EDC·HCl(0.113g，0.59mmol)、DIPEA(0.10mL，0.59mmol)、DMAP(6mg，0.050mmol)和二氯甲烷(5mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.88(t，J＝7.0Hz，13H)，1.18-1.35(m，64H)，1.37-1.42(m，2H)，1.52-1.66(m，9H)，2.06-2.13(m，2H)，2.25-2.32(m，4H)，2.36(s，3H)，2.45-2.53(m，1H)，2.59-2.66(m，2H)，2.85(t，J＝8.8Hz，1H)，3.00-3.08(m，1H)，3.98(d，J＝5.9Hz，2H)，4.08(t，J＝7.1Hz，4H)。

<阳离子脂质(9)的合成>

[实例A-9]

双(3-戊基辛基)9-{[(1-甲基吡咯烷-3-羰基)氧基]甲基}十七烷二酸酯(阳离子脂质9)的合成

根据实例A-1-(6)中的方法，标题化合物(0.089g，0.11mmol)获得自：实例A-8-(6)中获得的二羧酸(0.10g，0.23mmol)、3-戊基辛烷-1-醇(CAS 1443519-63-8)(0.11g，0.54mmol)、EDC·HCl(0.11g，0.59mmol)、DIPEA(0.10mL，0.59mmol)、DMAP(6mg，0.050mmol)和二氯甲烷(5mL)。

¹H-NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.88(t，J＝7.2Hz，13H)，1.17-1.34(m，56H)，1.37-1.43(m，2H)，1.53-1.69(m，10H)，2.06-2.14(m，2H)，2.28(t，J＝7.5Hz，4H)，2.36(s，3H)，2.45-2.53(m，1H)，2.58-2.66(m，2H)，2.84(t，J＝8.9Hz，1H)，3.00-3.08(m，1H)，3.98(d，J＝5.7Hz，2H)，4.08(t，J＝7.1Hz，4H)。

<阳离子脂质(10)的合成>

[对比实例A’-1]

2-{9-氧代-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基1-甲基氮杂环庚烷-4-甲酸酯(阳离子脂质10)的合成

(1)1-叔丁基4-(2-{9-氧代-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基)氮杂环戊烷-1，4-二甲酸酯的合成

根据实例A-1-(8)中的方法，标题化合物(81mg，0.11mmol)获得自：实例A-1-(7)中获得的化合物(60mg，0.11mmol)、1-(叔丁氧基羰基)氮杂环庚烷-4-甲酸(56mg，0.23mmol)、EDC·HCl(48mg，0.25mmol)、DIPEA(0.039mL，0.23mmol)、DMAP(2.8mg，0.023mmol)和二氯甲烷(0.80mL)。

(2)2-{9-氧代-9-[(3-戊基辛基)氧基]壬基}十二烷基1-甲基氮杂环庚烷-4-甲酸酯的合成

根据实施例A-2-(2)中的方法，标题化合物(51mg，0.077mmol)获得自：对比实例A’-1(1)中获得的化合物(81mg，0.11mmol)、TFA(1.1mL)、THF(1mL)，甲醛溶液(37％，0.080mL，1.1mmol)、硫酸钠(460mg，3.23mmol)和三(乙酰氧基)硼氢化钠(69mg，0.32mmol)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.88(t，J＝7.0Hz，9H)，1.14-1.49(m，49H)，1.51-1.71(s，4H)，1.73-2.10(m，5H)，2.23-2.31(m，2H)，2.34(s，3H)，2.45-2.76(m，5H)，3.92-3.98(m，2H)，4.03-4.12(m，2H)。

<阳离子脂质(11)的合成>

[对比实例A’-2]

2-丁基辛基9-溴壬酸酯(阳离子脂质11)的合成

根据实例A-1-(8)中的方法，标题化合物(30mg，0.048mmol)获得自：实例A-1-(7)中获得的化合物(50mg，0.095mmol)、1-甲基-3-氮杂环丁烷甲酸(22mg，0.19mmol)、EDC·HCl(40mg，0.21mmol)、DIPEA(0.033mL，0.19mmol)、DMAP(2.3mg，0.019mmol)和二氯甲烷(0.80mL)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)：0.88(t，J＝6.9Hz，9H)，1.14-1.47(m，44H)，1.61(s，8H)，2.30(s，5H)，3.26(s，3H)，3.46-3.64(m，2H)，3.99(d，J＝5.9Hz，2H)，4.08(t，J＝7.1Hz，2H)。

下表A中指出了合成的阳离子脂质1至11。

表A：合成的阳离子脂质1至11

B.组合物的制备和分析

<组合物(1)的制备>

[实例B-1]

用实例A-1的阳离子脂质1制备组合物。作为核酸，使用使因子VII(凝血因子VII)基因沉默表达并且由有义链和反义链组成的退火siRNA(基因设计有限公司(GeneDesignInc.)，在下文中也称为“因子VII siRNA”)，其中该有义链具有碱基序列：5’-GGAfUfCAfUfCfUfCAAGfUfCfUfUAfCT*T-3’(T：DNA，fU、fC＝2’-氟RNA，*＝硫代磷酸酯键)(SEQ ID NO：1)，该反义链具有碱基序列：5’-GfUAAGAfCfUfUGAGAfUGAfUfCfCT*T-3’(T：DNA，fU、fC＝2’-氟RNA，*＝硫代磷酸酯键)(SEQ ID NO：2)。

将因子VII siRNA以80μg/mL溶解在25mM乙酸钠水溶液(pH 4.0)中，以获得稀释的siRNA溶液。以60/8.5/30/1.5的比率(摩尔比)，将阳离子脂质1、DSPC(日本精细化学有限公司(Nippon Fine Chemical Co.，Ltd.))、胆固醇(日本精细化学有限公司)、MPEG2000-DMG(NOF公司(NOF Corporation)，甲氧基(聚乙二醇，分子量＝2000)-二肉豆蔻基甘油)溶解在乙醇中，使得总脂质浓度设置为7.2mM，并且然后获得脂质溶液。将稀释的siRNA溶液和脂质溶液分别以3mL/min和1mL/min的流速进料和混合，以获得脂质复合物水溶液。使用透析膜(产品名称“Float-A-Lyzer G2”，SPECTRUM股份有限公司(SPECTRUM，Inc.)，100K MWCO)将获得的脂质复合物水溶液进行透析，以用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)代替外部溶液。透析后，进行浓缩和过滤灭菌，从而获得实例B-1的液体组合物。

[实例B-2]

以与实例B-1相同的方式获得实例B-2的组合物，不同之处在于使用实例A-2的阳离子脂质2代替阳离子脂质1作为阳离子脂质。

[对比实例B’-1]

以与实例B-1相同的方式获得对比实例B’-1的组合物，不同之处在于使用对比实例A’-1的阳离子脂质10代替阳离子脂质1作为阳离子脂质。

[对比实例B’-2]

以与实例B-1相同的方式获得对比实例B’-2的组合物，不同之处在于使用对比实例A’-2的阳离子脂质11代替阳离子脂质1作为阳离子脂质。

<组合物(1)的分析>

在实例B-1、实例B-2、对比实例B’-1和对比实例B’-2的组合物中，测量了siRNA在脂质复合物中的包封率。

特别地，将用RNase Free水稀释组合物后用Quant-iT RiboGreen RNA试剂(英杰公司(Invitrogen))测量的siRNA浓度(A)设置为脂质复合物的外部溶液中存在的siRNA浓度。将用1％Triton X-100稀释组合物后测量的siRNA浓度(B)设置为组合物中的总siRNA浓度。然后，根据下式(F1)，计算核酸的包封率。

包封率(％)＝100-(A/B)×100(F1)

使用粒径分析仪(产品名称“Zetasizer Nano ZS”，由马尔文帕纳科公司(MalvernPanalytical Ltd.)生产)测量脂质复合物的平均粒径。

表1显示了siRNA的包封率和脂质复合物的平均粒径(Z-平均值)和多分散指数。

表1

证实了实例B-1和实例B-2的组合物显示出高的siRNA包封率，其与对比实例B’-1和对比实例B’-2的组合物的siRNA包封率相同。

<组合物(2)的制备>

[实例B-3]

在组合物(1)的制备中以与实例B-1相同的方式获得实例B-3的组合物，不同之处在于使用实例A-3的阳离子脂质3代替阳离子脂质1作为阳离子脂质。

[实例B-4]

以与实例B-3相同的方式获得实例B-4的组合物，不同之处在于使用实例A-4的阳离子脂质4代替阳离子脂质3作为阳离子脂质。

[实例B-5]

以与实例B-3相同的方式获得实例B-5的组合物，不同之处在于使用实例A-5的阳离子脂质5代替阳离子脂质3作为阳离子脂质。

[实例B-6]

以与实例B-3相同的方式获得实例B-6的组合物，不同之处在于使用实例A-6的阳离子脂质6代替阳离子脂质3作为阳离子脂质。

[实例B-7]

以与实例B-3相同的方式获得实例B-7的组合物，不同之处在于使用实例A-7的阳离子脂质7代替阳离子脂质3作为阳离子脂质。

[实例B-8]

以与实例B-3相同的方式获得实例B-8的组合物，不同之处在于使用实例A-8的阳离子脂质8代替阳离子脂质3作为阳离子脂质。

[实例B-9]

以与实例B-3相同的方式获得实例B-9的组合物，不同之处在于使用实例A-9的阳离子脂质9代替阳离子脂质3作为阳离子脂质。

[实例B-10]

以与实例B-3相同的方式获得实例B-10的组合物，不同之处在于使用实例A-1的阳离子脂质1代替阳离子脂质3作为阳离子脂质。

[对比实例B’-3]

以与实例B-3相同的方式获得比较实例B’-3的组合物，不同之处在于使用由下式(i)代表的二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(在下文中也称为“ALN-319”)(披露于专利文献2，根据专利文献2中披露的方法合成)代替阳离子脂质3作为阳离子脂质。

<组合物(2)的分析>

以与组合物(1)的分析相同的方式，测量实例B-3至实例B-10和对比实例B’-3的组合物的脂质复合物中siRNA包封率和脂质复合物的平均粒径。表2显示了siRNA的包封率和脂质复合物的平均粒径(Z-平均值)和多分散指数。

表2

<组合物(4)的分析>

将实例B-3至实例B-9和比较例B’-3的组合物进一步储存在4℃密封小瓶中1.5个月，并以与组合物(1)的分析相同的方式，测量脂质复合物的平均粒径(储存后的平均粒径)。表3显示脂质复合物的平均粒径(Z-平均值)中的变化。在表中，通过储存后平均粒径/储存前平均粒径×100计算平均粒径的变化(％)。

表3

已证实，实例B-3至实例B-9的组合物在储存1.5个月后的平均粒径几乎没有变化，并且与对比实例B’-3的组合物相比在物理上更稳定。结果表明，本发明的阳离子脂质可以使脂质复合物的粒径在一定时间段内的储存后的增加最小化。

C.测试实例

[测试实例1]

用PBS稀释实例B-1、实例B-2、对比实例B’-1和对比实例B’-2的组合物，使得包封在脂质复合物中的因子VII siRNA浓度为3或30μg/mL。经由尾静脉以10mL/kg的剂量将组合物施用于ICR小鼠(n＝3)，并在施用后1天在麻醉下收集血液。通过离心从血液中分离血浆，并使用可商购的试剂盒(产品名称“BIOPHEN FVII”，HYPHEN BioMed公司)测定血浆中的因子VII蛋白浓度。作为阴性对照，在施用PBS的组中进行相同的处理。

当将施用PBS的组(阴性对照)的因子VII蛋白浓度设置为100％时，将施用组合物的组的因子VII蛋白浓度计算为相对值。这些结果显示在图1和表4中。

表4

证实了实例B-1和实例B-2的组合物与对比实例B’-1和对比实例B’-2的组合物相比，在因子VII蛋白表达方面具有更高的抑制作用。此结果表明实例的组合物有效地将核酸释放到细胞质中。

[测试实例2]

以与测试实例1相同的方式，将实例B-3至实例B-10和对比实例B’-3的组合物施用于ICR小鼠(n＝3)，并且通过将施用PBS的组(阴性对照)中的因子VII蛋白浓度设置为100％来计算施用后1天的血浆中的因子VII蛋白浓度的相对值。这些结果显示在图2和表5中。

表5

测试实例1和2中的结果证明，实例的组合物可以将核酸释放到细胞质中。

测试实例1和2中的结果还表明实例B-1、实例B-2、实例B-3、实例B-4、实例B-5、实例B-6、实例B-8、实例B-9和实例B-10的组合物(阳离子脂质1、2、3、4、5、6、8和9)具有优异的因子VII蛋白表达的抑制作用(特别是当siRNA剂量相对较高时)。从这些结果证实，组合物有效地将核酸释放到细胞质中。

测试实例1和2中的结果还表明实例B-1、实例B-2、实例B-3、实例B-4、实例B-5、实例B-6、实例B-9和实例B-10的组合物(阳离子脂质1、2、3、4、5、6和9)即使在siRNA剂量较低时也能抑制因子VII蛋白表达。从这些结果证实，组合物有效地将核酸释放到细胞质中。

特别地，实例B-1、实例B-2、实例B-4、实例B-6、和实例B-10的组合物(阳离子脂质1、2、4和6)与对比实例B’-3的组合物相比具有较高的因子VII蛋白表达的抑制作用。表明这些组合物可以更有效地将核酸释放到细胞质中。

从以上结果来看，根据本发明实施例的阳离子脂质，其可以有效地将核酸释放到细胞质中。另外，根据本发明的实施例的阳离子脂质，其可以使脂质复合物的粒径在一定时间段内的储存后的增加最小化。

工业实用性

根据本发明，能够提供可以将核酸释放到细胞质中的阳离子脂质。