阅读说明：本技术 氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物在制备β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂中的应用 (Application of cyanoimine thiazolidine furan carboxamide compound in preparation of β -glucuronidase inhibitor ) 是由 王鸿 崔紫宁 魏斌 周涛顺 于 2020-05-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物在制备β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂中的应用,本发明氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物对大肠杆菌β-葡萄糖醛酸苷酶(EcGUS)抑制活性十分显著,IC<Sub>50</Sub>值范围为1.2μM-23.1μM,在治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻的药物的研发方面具有广阔的应用前景。(The invention discloses an application of a cyanoimine thiazolidine furoylamide compound in preparing β -glucuronidase inhibitor, the cyanoimine thiazolidine furoylamide compound has very obvious inhibition activity on Escherichia coli β -glucuronidase (EcGUS), and IC is 50 The value range is 1.2 mu M-23.1 mu M, and the compound has wide application prospect in the aspect of research and development of medicaments for treating drug-induced diarrhea caused by irinotecan or non-steroidal anti-inflammatory drugs.)

氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物在制备β-葡萄糖醛酸苷 酶抑制剂中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一类氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物的应用，特别涉及其在制备β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂中的新应用，该应用有助于对治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻药物的研发，属于化学医药技术领域。

(二)背景技术

伊立替康(CPT-11)，是一种常用的治疗结肠癌的药物。当它进入人体之后，会在肝脏中被代谢成无活性的SN-38葡萄糖醛酸苷(SN-38G)，随后SN-38G经胆管排泄进入肠道，被肠道菌β-葡萄糖醛酸苷酶水解成SN-38，当SN-38在肠道中积累后会引起严重的迟发性腹泻和肠道损伤，严重影响化疗进程。此外许多服用酮洛芬、双氯芬酸和吲哚美辛等含羧酸的非甾体类抗炎药也会引起类似的肠道毒性，从而引起严重的药源性腹泻。

β-葡萄糖醛酸苷酶属于糖苷酶家族2的成员，能水解β-D-连接的葡萄糖醛酸苷键。人和动物肠道内的许多微生物都可以产生β-葡萄糖醛酸苷酶，2010年有学者首次证实了抑制肠道菌β-葡萄糖苷酶能缓解CPT-11引起的药源性腹泻，随后关于肠道菌β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂的开发和应用受到了广泛关注。虽然肠道中的β-葡萄糖醛酸苷酶的来源不限于大肠杆菌，但大肠杆菌β-葡萄糖醛酸苷酶(EcGUS)，在人和动物肠道中普遍存在而且又易制备，因此EcGUS常被作为肠道菌β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂研究的常用靶标。

氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物是一种含5-苯基-2-呋喃结构的衍生物。呋喃环富含电子基团，能很容易和许多生物大分子形成分子间氢键，因此含5-苯基-2-呋喃结构的化合物具有多种生物学活性，例如抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗虫等。本发明中所列的化合物全都由华南农业大学崔紫宁教授慷慨提供，但该类化合物是否有EcGUS抑制活性还未有研究公布。

(三)

发明内容

本发明提供了一类氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺化合物在制备β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂中的应用，有助于对治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻的药物的研发。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种式(I)所示氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物在制备β-葡萄糖醛酸苷酶(EcGUS)抑制剂中的应用，

式(I)中R为取代基，所述取代基包括氯、溴、氟、硝基、甲基、甲氧基、氢。

进一步，所述R为2-Cl、3-Cl、4-Cl、2-F、4-F、2,4-Di-F、2,4-Di-F、2-NO₂、4-NO₂、4-Br、4-Me、4-MeO、H。

进一步，所述氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物对β-葡萄糖醛酸苷酶抑制的IC₅₀值范围为1.2μM-23.1μM。

进一步，所述β-葡萄糖醛酸苷酶源自肠道菌，优选大肠杆菌；β-葡萄糖醛酸苷酶可以从生物化学制品公司采购，比如西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，也可以从大肠杆菌中制备。

进一步，所述抑制剂为治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻的药物。

与现有技术相比，本发明有如下有益效果：

本发明中的氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物对EcGUS抑制活性是首次被报道，而且抑制活性十分显著，IC₅₀值范围为1.2μM-23.1μM(远小于阳性对照——D-葡萄糖二酸-1,4-内酯的IC₅₀值67.3μM)，在治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻的药物的研发方面具有广阔的应用前景。

(四)附图说明

图1为氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物和D-葡萄糖二酸-1,4-内酯(终浓度10μM)对EcGUS的抑制活性图。

图2为氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物和D-葡萄糖二酸-1,4-内酯对EcGUS的浓度依赖抑制曲线。

图3为化合物1(A)、2(B)、3(C)对EcGUS的抑制类型图。

(五)

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1：EcGUS抑制剂的筛选

(1)EcGUS的制备：将-80℃下保存的大肠杆菌(Escherichia coli BL21(DE3))接种到200mL含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基(胰蛋白酶10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，pH 7.0)中，于200rpm、37℃条件下培养至OD600达到0.5，接着加入终浓度100mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，于200rpm、30℃条件下过夜培养诱导EcGUS的表达，SDS-PAGE电泳检测酶的表达情况。待表达完成后，将培养液在4℃，9000rpm条件下离心5min，收集菌体，再用PBS(pH 7.4)洗涤菌体2-3遍，然后按原菌液(离心前培养液)体积的1/10加裂解液(20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，300mM NaCl，5mM咪唑(imidazole)，体积浓度10％甘油(glycerol)，溶剂为水，pH 7.4)20mL重悬菌体，在300W，超声10s间隔10s条件下超声破碎菌体20min(置于冰上)，接着在4℃，8000rpm条件下离心10min，取上清。然后用纯净水和NTA-0缓冲液(20mM Tris-HCl，0.5M氯化钠，体积溶度10％甘油，pH 7.9)各15ml分别清洗15mL的Ni-NTA琼脂糖树脂柱料(购于GE医疗公司)2～3次，再将上清与Ni-NTA琼脂糖树脂柱料在4℃下螯合3h，然后用NTA-0缓冲液r，NTA-20缓冲液(20mM Tris-HCl，0.5M氯化钠，体积溶度10％甘油，20mM咪唑，pH 7.9)，NTA-250缓冲液(20mM Tris-HCl，0.5M氯化钠，体积溶度10％甘油，250mM咪唑，pH 7.9)各15mL分别梯度洗脱，洗脱液每5mL收集一管，分别收集到9管洗脱液，每管洗脱液均进行SDS-PAGE电泳，结果显示NTA-20缓冲液收集的4管洗脱液中含有EcGUS，且EcGUS的分子量约为71kD，然后将这4管洗脱液合并，最后使用10kD的Millipore蛋白超滤管(截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3)过滤，收集截留液即为酶液，获得EcGUS原酶液约7mL；

(2)对硝基苯酚(PNP)标曲制作：配制1mM的PNP溶液(PBS溶解)，在96孔板中进行操作，每组做3个平行，分别加0，10，20，40，60，80μL 1mM的PNP溶液，用PBS补齐至100μL，在37℃下孵育30min，使用酶标仪分别测405nM波长下0min和30min的吸光度，然后利用Excel制作散点图，得到吸光度与PNP浓度的关系式为y＝3.2617x+0.0547，其中y为吸光度，x为PNP浓度，经单位转换和去除空白干扰，在μM浓度下吸光度与PNP浓度的关系式为y＝0.003262x。

(3)EcGUS抑制剂的筛选(抑制剂终浓度10μM)：

抑制剂：将氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物(表1化合物1-化合物13)分别用二甲基亚砜(DMSO)配成0.1mM的溶液，作为抑制剂，待用。

阳性对照(DSL)：D-葡萄糖二酸-1,4-内酯(D-Saccharic acid 1,4-lactone，DSL，购于Sigma-Aldrich)用二甲基亚砜(DMSO)配成0.1mM的溶液，作为阳性对照，待用。

底物：4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG，购于Sigma-Aldrich)，用PBS配成2.5mM的母液，待用。

酶：步骤(1)中制备的β-葡萄糖醛酸苷酶(EcGUS)，用PBS稀释500倍后用试剂盒测得浓度为1μg/mL，作为反应酶液。

反应：在96孔板中进行，反应体系如下，空白组：酶10μL+PBS 70μL+体积浓度1％DMSO 10μL+2.5mM底物10μL；实验组：酶10μL+PBS 70μL+0.1mM抑制剂10μL+2.5mM底物10μL；阳性对照组：酶10μL+PBS 70μL+0.1mM阳性对照10μL+2.5mM底物10μL；每组做3个平行，按酶、PBS、抑制剂/阳性对照、底物的顺序加样，然后使用酶标仪在405nm波长下分别测量0min和30min的OD值(期间37℃下孵育)，通过计算得到各化合物在终浓度10μM下的对EcGUS的相对活性值，并用Graphad Prism 6.0软件画出相对活性柱状图(见图1)，通过进一步计算得到各化合物在终浓度10μM下对EcGUS的抑制率(具体数值见表1)，13个氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物(表1中化合物1-化合物13)的抑制活性均大于阳性对照化合物DSL，抑制率在31.4％-95.2％之间。

上述的具体计算过程如下：

ΔOD＝OD_30min–OD_0min；

ΔC_PNP＝ΔOD/0.003262(0.003262为步骤(2)所得的吸光度与PNP浓度的相关性系数)相对活性(％)＝实验组ΔC_PNP/空白组ΔC_PNP；

抑制率(％)＝1–相对活性(％)；

(4)IC₅₀值的测定：测定13个氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物的IC₅₀值，在终浓度0.001-100μM内设置一系列抑制剂浓度点(如0.001、0.01、0.1、0.3、0.5、3、5、20、50μM)，反应在96孔板中进行，反应体系如下：空白组：酶10μL+PBS 70μL+体积分数1％DMSO 10μL+2.5mM底物10μL；实验组：酶10μL+PBS 70μL+不同浓度抑制剂10μL+2.5mM底物10μL；每组设3个平行，按酶、PBS、抑制剂/阳性对照、底物的顺序加样，然后在酶标仪405nm波长下分别测量0min和30min的OD值(期间37℃下孵育)，通过计算得到各抑制剂在不同溶度条件下对EcGUS的相对活性值，最后将抑制剂浓度点μM转化成nM并取10为底的导数得lg值，并以lg值为横坐标，相对活性为纵坐标，利用Graphad Prism 6.0软件画出IC₅₀曲线图并经该软件分析得各抑制剂对EcGUS的IC₅₀值(各化合物IC₅₀值见表1)，所有13个氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物对EcGUS的IC₅₀都小于阳性对照化合物DSL，达到1.2-22.3μM。

表1十三种氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物抑制率和IC₅₀值

实施例2：化合物1、2、3对EcGUS的抑制类型研究

选取复筛抑制活性最好的三个化合物，分别为化合物1(R为2-Cl)、2(R为3-Cl)、3(R为4-Cl)，所对应的结构分别为苯环上邻、间、对为氯取代，其中化合物2抑制活性最好。抑制剂用PBS配制成一系列浓度梯度的溶液，底物也用PBS配制成浓度为2，3，5，10mM的溶液，即终浓度为200，300，500，1000μM。比如化合物1配制浓度为0，30，40，90μM，即终浓度为0，3，4，9μM；化合物2配制浓度为0，5，12，30μM，即终浓度为0，0.5，1.2，3μM；化合物3配制浓度为0，20，50，80μM，即终浓度为0，2，5，8μM；以化合物1为例制作底物与抑制剂的溶度组合表2。

表2底物与化合物1不同浓度点的排列组合表

注释：C_PNPG表示底物终溶度，C_In表示抑制剂(化合物1)终溶度，□表示一个实验组(相当于96孔板的一个样孔)，每个溶度组合做3组平行。

然后按反应体系：酶10μL+PBS 70μL+不同浓度抑制剂10μL+不同浓度底物10μL(不同浓度的抑制剂与底物的组合见表2)在96孔板中进行反应，每个组合设3个平行，按酶、PBS、抑制剂/阳性对照、底物的顺序加样加样，使用酶标仪在405nm波长下分别测量0min和30min的吸光度(期间37℃下孵育)，按步骤(3)计算过程计算不同溶度组合对应的PNP浓度差值，最后计算出1/V(μmol/min/mg)和1/PNPG值，V(μmol/min/mg)即酶的催化速度，表示在温度、pH值、底物浓度一定的条件下，每毫克酶每分钟催化产生产物的摩尔量；

计算过程如下：

1/V(μmol/min/mg)＝1/(ΔC_PNP*100/10/30/1)；1/PNPG＝1/ΔC_PNP；

其中ΔC_PNP表示0min和30min体系中PNP的浓度差，100表示反应体系100μL，10表示酶的加入量10μL，30表示反应时间30min，1表示酶的配制溶度为1μg/mL。

最后利用Graphad Prism 6.0软件线性回归画出抑制双倒数曲线图(见附图3，化合物1、2、3分别对应图3中的A、B、C)根据曲线交点判断抑制类型，从图3可以看出3个化合物图像与y轴都有一个交点，表明化合物1、2、3对EcGUS的抑制属于竞争性抑制。