阅读说明：本技术 Znu-imb-z15化合物在制备治疗***癌药物中的应用 (ZNU-IMB-Z15 compound and application thereof in preparing medicament for treating prostatic cancer ) 是由 周金明 吴萌 张荣玉 黄晨超 刘浚 李晓宇 岑山 于 2020-07-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了ZNU-IMB-Z15化合物在治疗前列腺癌药物中的应用,ZNU-IMB-Z15在作为雄激素受体拮抗剂和雄激素受体下调剂方面的应用,以及ZNU-IMB-Z15在制备治疗前列腺癌药物中的应用。本发明通过构建可靠的雄激素受体拮抗剂筛选方法,测试了多个药物先导物对雄激素受体活性的抑制作用,发现ZNU-IMB-Z15对于雄激素受体的转录活性具有抑制作用,发现ZNU-IMB-Z15对于雄激素受体具有下调作用,发现ZNU-IMB-Z15是一类新型的雄激素受体拮抗剂和下调剂,发现ZJU-IMB-Z15可作为单独给药或与恩杂鲁胺联合使用治疗前列腺癌的药物。(The invention discloses an application of ZNU-IMB-Z15 compound in preparing a medicament for treating prostate cancer, an application of ZNU-IMB-Z15 in serving as an androgen receptor antagonist and an androgen receptor down-regulator, and an application of ZNU-IMB-Z15 in preparing a medicament for treating prostate cancer. The invention tests the inhibitory action of a plurality of drug leads on the activity of an androgen receptor by constructing a reliable screening method of the androgen receptor antagonist, finds that ZNU-IMB-Z15 has an inhibitory action on the transcriptional activity of the androgen receptor, finds that ZNU-IMB-Z15 has a down-regulation action on the androgen receptor, finds that ZNU-IMB-Z15 is a novel androgen receptor antagonist and a down-regulator, and finds that ZJU-IMB-Z15 can be used as a drug for treating prostatic cancer by being singly administered or being used together with enzalutamide.)

ZNU-IMB-Z15化合物在制备治疗***癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及***癌药物领域，具体涉及ZNU-IMB-Z15化合物在制备雄激素受体拮抗剂、雄激素受体下调剂和治疗***癌药物中的应用。

背景技术

雄激素受体(Androgen receptor,AR)是核受体超家族的一个成员，属配体激活的转录因子，广泛分布于增殖和非增殖组织。AR蛋白具有三个结构域：N端结构域(N terminaldomain，NTD)、DNA结合域(DNA binding domain，DBD)和配体结合域(Ligand bindingdomain，LBD)。其中在LBD结合域有一个激素结合口袋(Hormone binding pocket，HBP)，雄激素结合于HBP时，AR的Helix12发生构象变化而成为激动构象(Agonisticconformation)，形成二聚化结构，进入细胞核中与位于靶基因启动子区的雄激素反应元件(Androgen response element，ARE)结合，起到激活或抑制靶基因表达的作用，从而调控靶组织的生理功能。雄激素受体拮抗剂，即为能够和AR HBP结合，并阻止Helix-12处于活性位置的分子。

***癌是男性群体中常见的癌症类型，近年来***癌在我国发病率呈现快速增加的趋势。对激素敏感型晚期***癌患者以内分泌治疗为主，内分泌治疗的方法包括去势(手术去势或药物去势)和抗雄激素治疗。但几乎所有患者最终都会发展为激素非依赖性***癌或去势抵抗性***癌(castration resistant prostate cancer,CRPC)。

雄激素受体拮抗剂是目前临床应用最广的抗雄激素治疗的AR靶向治疗药物。这类药物可分为甾类与非甾类两种。甾类抗雄激素药物以醋酸环丙孕酮(CPA)为代表，还包括醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮。非甾类抗雄激素药物(Nonsteroidal antiandorgens，NSAA)有羟基氟他胺(hydroxyflutamide，HF)、比卡鲁胺(bicalutamide，BIC)和二代的恩杂鲁胺(enzalutaimide，ENZa)、阿比特龙(abiraterone)以及ARN-509(Apalutamide)。但在治疗中产生的耐药性问题严重影响了这些药物的疗效，常见的AR靶向治疗药物耐药机理包括AR点突变、AR扩增、AR可变剪接体产生、GR表达上调等。

由于AR在***癌的发生发展中具有至关重要的作用，理论上抑制了AR的活性即可抑制大多数***癌的发展进程，从而延长***癌患者的生存期。为了克服由于AR点突变、AR扩增、AR可变剪接体产生等原因引起的AR本身变化所导致的耐药性，开发新一代具有全新结构的AR拮抗剂具有非常重要的科学价值与临床价值。此外，开发通过促进AR降解而抑制AR功能的药物理论上可以从源头解决由于AR突变而导致的耐药性。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供了一种ZNU-IMB-Z15化合物在制备雄激素受体拮抗剂、雄激素受体下调剂和治疗***癌药物中的应用，该化合物ZNU-IMB-Z15，既可以作为AR拮抗剂，又可以下调AR蛋白水平，从而抑制AR功能，同时本发明提供了ZNU-IMB-Z15化合物在治疗***癌药物中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了ZNU-IMB-Z15作为雄激素受体拮抗剂和雄激素受体下调剂的应用。

ZNU-IMB-Z15为一种已知化合物，可购自市售产品，ZINC数据库号码为ZINC06968499，所述的ZNU-IMB-Z15化合物如式I所示：

ZNU-IMB-Z15可以通过拮抗AR的功能，进而抑制外源性与内源性AR的转录活性，抑制AR下游靶基因的表达。发明人经过试验发现，ZNU-IMB-Z15可以抑制AR阴性的PC-3细胞外源转入的野生型AR功能，野生型AR可以被雄激素二氢睾酮(Dihydrotestoserone,DHT)激活，进而促进***癌细胞的增殖分化。ZNU-IMB-Z15可以通过拮抗野生型AR治疗***癌。

发明人经过试验发现，ZNU-IMB-Z15可以抑制AR阳性的LNCaP细胞内源表达的T877A突变型AR功能，此外，ZNU-IMB-Z15对AR阴性的PC-3细胞外源转入的T877A突变型AR具有良好的抑制作用。因此作为优选，将ZNU-IMB-Z15作为T877A突变雄激素受体拮抗剂。T877A突变型受体与羟基氟他胺的耐药性相关，ZNU-IMB-Z15可通过抑制T877A突变型受体的活性，达到治疗羟基氟他胺耐药的***癌的目的。

发明人经过试验发现，ZNU-IMB-Z15对AR阴性的PC-3细胞外源转入的F876L突变型AR具有良好的抑制作用。因此作为优选，将ZNU-IMB-Z15作为F876L突变型雄激素受体拮抗剂。F876L突变型AR受体与恩杂鲁胺和ARN509的耐药性相关，ZNU-IMB-Z15可通过抑制F876L突变型AR受体的活性，达到治疗恩杂鲁胺和ARN509耐药的***癌的目的。

ZNU-IMB-Z15化合物在制备治疗雄激素失调疾病的药物中的应用。所述雄激素失调疾病为由雄激素亢奋引起的疾病。所述雄激素失调疾病为***增生症或***癌。所述雄激素失调疾病为男性***亢进。所述雄激素失调疾病为女性痤疮、女性脂溢性皮炎、女性多毛症、女性脱发等。

ZNU-IMB-Z15可以通过促进AR蛋白的降解，进而下调AR蛋白的表达水平。因此作为优选，将ZNU-IMB-Z15作为雄激素受体下调剂。AR过表达或AR可变剪接体的产生是恩杂鲁胺与阿比特龙等抗雄激素药物产生耐药性的重要原因之一，ZNU-IMB-Z15可通过下调AR蛋白水平，达到治疗耐药性***癌的目的。所述的雄激素受体下调剂为促进雄激素受体蛋白降解的药剂。

第二方面，本发明提供了ZNU-IMB-Z15在制备治疗***癌药物方面的应用。

ZNU-IMB-Z15化合物在制备治疗***癌药物中的应用，所述的ZNU-IMB-Z15化合物作为雄激素受体拮抗剂与雄激素受体下调剂治疗现有药物敏感型***癌和耐药型***癌。

本发明所述的治疗***癌的药物以ZNU-IMB-Z15为活性成分制备而成，具体为本领域技术人员所掌握。

更具体而言，本发明提供的ZNU-IMB-Z15主要针对早期***癌、激素敏感型晚期***癌，以及由于抗雄激素治疗引起的耐药性去势抵抗***癌。

可选的，所述早期***癌、激素敏感型晚期***癌均与雄激素受体的功能失调相关。需要特别强调的是，由于***癌的致病机理主要是雄激素受体信号通路发生异常活化。其信号通路过程为雄激素与AR结合，AR被激活并二聚化磷酸化，进入细胞核中，与特异的DNA部位(AR Response Element,ARE)结合，募集RNA聚合酶等转录元件，调控靶基因的转录表达，如***特异性抗原(PSA)、TMPRSS2、FKBP5等基因。该信号通路正常情况下可以促进***上皮细胞的分化，而持续激活情况下则会调节细胞异常增殖、存活等，从而形成肿瘤并恶化。本发明提供的ZNU-IMB-Z15正是作用于AR中的LBD位点，抑制异常活化的雄激素受体信号通路，从而抑制肿瘤的恶化。因此，本发明所述的ZNU-IMB-Z15可对***癌具有显著疗效。

可选的，所述抗雄激素治疗引起的耐药性去势抵抗***癌是经过现有AR靶向药物治疗后，由于AR扩增、AR氨基酸点突变、AR可变剪接体产生等AR形态或功能异常突变而产生的耐药性***癌。当AR靶向治疗药物抑制AR功能后，***癌细胞会通过AR扩增、AR氨基酸点突变或形成AR可变剪接体来消除现有拮抗剂对AR的抑制作用，从而促进***癌细胞的增殖。本发明所述的ZNU-IMB-Z15相比于目前临床上使用的AR拮抗剂，具有全新的分子结构，同时还可以下调AR蛋白的水平，从而克服上述耐药现象的产生。

ZNU-IMB-Z15化合物和恩杂鲁胺联合制备治疗***癌复方药中的应用，可促进抑制AR阳性***癌细胞的生长。所述的ZNU-IMB-Z15ZNU-IMB-Z15和恩杂鲁胺的摩尔比为1:1。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

通过前期筛选和后期机制研究，本发明发现ZNU-IMB-Z15可以选择性的拮抗外源性与内源性AR的功能，可以作为一种新型的雄激素受体拮抗剂。同时，ZNU-IMB-Z15同样可以下调***癌细胞中的AR蛋白水平，可以作为一种新型的AR蛋白下调剂。综上所述，本发明发现ZNU-IMB-Z15可以作为AR拮抗剂与AR下调剂使用。

本发明通过构建可靠的AR拮抗剂筛选方法，测试了多个化合物对AR转录活性的抑制作用，最后发现小分子化合物ZNU-IMB-Z15是一个活性良好的新型结构的AR拮抗剂，可以抑制AR的功能，从而抑制AR下游靶基因的表达。本发明发现ZNU-IMB-Z15抑制AR转录功能的活性优于目前已上市的抗***癌药物恩杂鲁胺。此外，本发明检测了ZNU-IMB-Z15对AR蛋白表达水平的影响，发现其可以下调AR蛋白水平。进一步地，本发明测试了ZNU-IMB-Z15的抗***癌活性，发现ZNU-IMB-Z15对于AR阳性的***癌细胞如LNCaP细胞、22Rv1细胞具有较好的活性。同时ZNU-IMB-Z15和恩杂鲁胺联合应用可促进抑制AR阳性***癌细胞的生长。

附图说明

图1为本发明实施例1中ZNU-IMB-Z15与AR-LBD蛋白相互作用的分析结果。考察化合物ZNU-IMB-Z15和雄激素受体配体结合结构域的特异性相互作用。

图2A为本发明实施例2中ZNU-IMB-Z15对LNCaP细胞中内源性AR转录活性的影响；图2B为本发明实施例2中ZNU-IMB-Z15对PC-3中外源过表达的野生型AR转录活性的影响；

图3A为本发明实施例3中ZNU-IMB-Z15对PC-3中外源过表达的F876L突变型AR转录活性的影响；图3B为本发明实施例3中ZNU-IMB-Z15对PC-3中外源过表达的T877A突变型AR转录活性的影响；

图4为本发明实施例4中比较了ZNU-IMB-Z15与恩杂鲁胺对LNCaP细胞内源性AR转录活性的影响；

图5A为本发明实施例5中ZNU-IMB-Z15对LNCaP细胞内源性AR下游靶基因PSA mRNA水平的影响；图5B为本发明实施例5中ZNU-IMB-Z15对LNCaP细胞内源性AR下游靶基因TMPRSS2 mRNA水平的影响；

图6为本发明实施例6中ZNU-IMB-Z15对DHT激活后的LNCaP细胞中AR表达及其转录活性的影响。

图7为本发明实施例7中ZNU-IMB-Z15在蛋白水平对未经DHT激活的VCaP细胞内源性AR表达的影响；

图8为本发明实施例8中ZNU-IMB-Z15对AR阳性***癌细胞LNCaP细胞、22Rv1细胞的增殖影响情况；ZNU-IMB-Z15对AR阴性***癌细胞PC-3细胞、DU145细胞的增殖影响情况。

图9为本发明实施例9中ZJU-IMB-Z15联合恩杂鲁胺抑制内源性AR的转录功能对比恩杂鲁胺单独给药情况。

图10A为本发明实施例10中ZNU-IMB-Z15联合恩杂鲁胺给药对LNCaP细胞增殖抑制活性对比单独给药的情况；图10B为本发明实施例10中ZNU-IMB-Z15联合恩杂鲁胺给药对22Rv1细胞增殖抑制活性对比单独给药的情况。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 ZNU-IMB-Z15可结合于AR-LBD蛋白

本生物膜干涉实验(BLI)采用的仪器为ForteBio Octet RED96仪(ForteBio,Inc.,CA,USA)，使用的传感器为超级链霉素传感器(SSA传感器)。纯化后的AR-LBD蛋白购买自赛默飞公司(Cat.#A15675,Thermo)，按照1:1的比例使用EZ-

NHS-Biotin试剂(Cat.#21343,Thermo)将AR-LBD蛋白生物素化，室温25℃反应30分钟。将SSA传感器针头放入PBS中预湿10分钟，按照厂家的操作指南，首先将生物素化后的AR-LBD蛋白结合到SSA传感器，然后将结合蛋白后的SSA传感器移动至PBS中检测基线1分钟，随后将传感器移动到含ZNU-IMB-Z15化合物的PBS溶液中，蛋白小分子结合1分钟，同时设置一组含1％DMSO的PBS溶液为参考，最后将传感器移动至PBS中解离1分钟，重复以上“基线—结合—解离”步骤，完成所有浓度下ZNU-IMB-Z15的检测，ZNU-IMB-Z15的浓度设置为500μM、100μM、20μM、4μM和0.8μM。在SSA传感器不结合AR-LBD蛋白的情况下重复上述步骤，从而进行双扣除检测。数据分析采用Forte′Bio数据分析软件，采用双扣除选项，选择100μM、20μM、4μM三个浓度进行拟合，计算蛋白小分子相互作用的KD值。图1为本发明实施例1中ZNU-IMB-Z15与AR-LBD蛋白相互作用的分析结果。

该实验原理是在实验所用的机器内可产生一束可见光穿过光纤，在传感器末端的光学膜层的两个界面会形成两束反射光谱，叠加形成一束干涉光谱。分子与传感器上的蛋白结合导致传感器膜层厚度变化，并通过干涉光谱的位移值而体现。实验结果显示，ZNU-IMB-Z15与AR-LBD可产生浓度依赖性的结合，随着浓度增高，结合强度增加，这组实验结果说明ZNU-IMB-Z15可特异性的结合于AR蛋白的LDB区域从而发挥活性。

实施例2 ZNU-IMB-Z15可抑制内源性与外源性AR的转录功能

将1.0×10⁵个/mL的PC-3或LNCaP细胞悬液，按照每孔500μL接种于24孔板中。待细胞长至60％时，PC-3细胞组每孔共转染100ng PSA-luc、20ng AR-WT和1ng pCMV-Renilla质粒(LNCaP细胞转染100ng PSA-luc和1ng pCMV-Renilla质粒)。转染后6小时将培养基换成含10％活性炭处理的胎牛血清(FBS)的无酚红RPMI 1640培养基；转染24小时后，其中一组按照每孔5nM的二氢睾酮加相应浓度的ZNU-IMB-Z15或恩杂鲁胺各加入1μL，另一组按照每孔二甲基亚砜(溶剂)或相应浓度的ZNU-IMB-Z15或恩杂鲁胺加入1μL，继续培养24小时。最后将培养基吸掉，每孔加入100μL的1×PLB裂解20分钟，收集细胞裂解物到干净的EP管中，离心，取上清20μL到干净的白色96孔板中，按照Promega公司的Dual-

LuciferaseAssay System试剂盒的说明书，用Centro XS3 LB 960酶标仪测定荧光值。实验设置了三组平行，并进行了统计学分析，其中*<0.05,**P<0.01，***P<0.001是以DHT组为参照。实验数据以表示，并用GraphPad Prism 5.0进行作图(见图2)和统计学分析。图2A为本发明实施例2中ZNU-IMB-Z15对LNCaP细胞中内源性AR转录活性的影响；图2B为本发明实施例2中ZNU-IMB-Z15对PC-3中外源过表达的野生型AR转录活性的影响；

该实验原理是将AR的靶基因***特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)的启动子和萤火虫荧光素酶基因偶联，以校准后的萤火虫荧光素酶活性(相对荧光值，RLU)来反映AR的转录活性。实验结果显示，ZNU-IMB-Z15对内源性与外源性的AR转录活性均具有很好的抑制作用，在0.20μM—5.00μM浓度下呈现剂量依赖关系，在5.00μM、1.00μM时作用效果跟5μM恩杂鲁胺的作用效果相近。这组实验结果说明ZNU-IMB-Z15可以抑制外源性与内源性AR的转录活性作用，在5.00μM、1.00μM时其抑制强度与恩杂鲁胺相似。

实施例3 ZNU-IMB-Z15可抑制外源性F876L突变型AR和T877A突变型AR的转录功能

PC-3细胞中几乎不表达AR，因此本发明利用PC-3细胞研究ZNU-IMB-Z15对外源性转入的F876L突变型AR和T877A突变型AR转录活性的影响。

具体实验步骤参照实施例1，不同之处在于：采用的PC-3细胞来做此次实验，共转染时F876L组每孔转50ng AR-F876L质粒、1ng pCMV-Renilla质粒和100ng PSA-luc质粒；T877A组每孔转50ng AR-T877A质粒、1ng pCMV-Renilla质粒和100ng PSA-luc质粒，其它操作相同。实验设置了三组平行，并进行了统计学分析，其中*P<0.05，**P<0.01以二氢睾酮组为参照。实验数据以表示，并用GraphPad Prism 5.0进行作图(见图3)和统计学分析。图3A为本发明实施例3中ZNU-IMB-Z15对PC-3中外源过表达的F876L突变型AR转录活性的影响；图3B为本发明实施例3中ZNU-IMB-Z15对PC-3中外源过表达的T877A突变型AR转录活性的影响；

与外转野生型AR和内源型AR一样，F876L突变型AR和T877A突变型AR同样可以被DHT激活，通过转录最终使PSA-luc表达上调。F876L-AR是恩杂鲁胺耐药型AR，相比于野生型AR，恩杂鲁胺对F876L-AR转录抑制活性较弱或无抑制活性；T877A-AR是羟基氟他胺耐药型AR，相比于野生型AR，羟基氟他胺对T877A-AR转录抑制活性较弱或无抑制活性。实验结果显示，ZNU-IMB-Z15对F876L突变型AR和T877A突变型AR的转录活性均具有很好的抑制作用，在0.20μM—5.00μM浓度下呈现剂量依赖关系。这组实验结果说明ZNU-IMB-Z15可以克服由于F876L点突变和T877A点突变而导致的***癌耐药现象。

实施例4 ZNU-IMB-Z15抑制内源性AR的转录功能优于恩杂鲁胺

恩杂鲁胺是目前临床上常用的第二代雄激素受体拮抗剂，为了探究ZNU-IMB-Z15对AR转录活性的抑制是否优于恩杂鲁胺，本发明对比了ZNU-IMB-Z15和恩杂鲁胺分别在LNCaP细胞中抑制AR转录的IC50值。

具体实验步骤参照实施例2，不同之处在于：本实验采用LNCaP细胞体系，化合物浓度选取范围为0.00μM—4.00μM，5倍稀释，选取5个浓度点，其它操作相同。实验设置了三组平行，并进行了统计学分析，其中*P<0.05，**P<0.01以二氢睾酮组为参照。实验数据以

表示，并用GraphPad Prism5.0进行作图(见图4)和统计学分析。图4为本发明实施例4中比较了ZNU-IMB-Z15与恩杂鲁胺对LNCaP细胞内源性AR转录活性的影响。

实验结果显示，ZNU-IMB-Z15抑制内源性AR转录活性的IC50为0.11μM，恩杂鲁胺抑制内源性AR转录活性的IC50为0.28μM，这组实验结果说明ZNU-IMB-Z15抑制内源性AR转录活性的能力要优于阳性药恩杂鲁胺。

实施例5 ZNU-IMB-Z15可在mRNA水平抑制LNCaP细胞中内源性AR的转录活性。

ZNU-IMB-Z15对AR转录活性的影响主要体现在ZNU-IMB-Z15对AR下游靶基因表达量的影响。PSA(KLK3)和TMPRSS2是AR重要的两个下游靶基因，实施例2和实施例3中检测了ZNU-IMB-Z15对外源转入的PSA启动子的影响。但单纯抑制外源转入的PSA启动子无法确证ZNU-IMB-Z15抑制AR转录的特异性。为了进一步证实PSA下调是由于AR转录受到抑制，本发明采用qRT-PCR方法检测了ZNU-IMB-Z15在mRNA水平对PSA的影响，此外，为进一步说明AR转录功能受到了ZNU-IMB-Z15抑制，本发明还检测了TMPRSS2的mRNA表达水平。

具体操作步骤如下：将2.0×10⁵个/mL的LNCaP细胞悬液，按照每孔2ml接种于6孔板中。所用培养基为含10％活性炭处理的胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基；细胞在37摄氏度二氧化碳恒温培养箱培养。细胞培养48小时后加药，溶剂组加入8μL二甲基亚砜，其他组每孔加入终浓度为5nM的DHT4μL，同时根据每孔的设定相应加入二甲基亚砜、恩杂鲁胺以及不同浓度的ZNU-IMB-Z15各4μL。继续培养24小时后将培养基吸出，每孔加入1ml的Trizol试剂，从Trizol中提取出mRNA之后，利用反转录法获得全基因组cDNA，随后进行qRT-PCR检测PSA和TMPRSS2 mRNA的表达量。本实验利用GAPDH作为内参基因。实验设置了三组平行，并进行了统计学分析，其中*<0.05,**P<0.01，***P<0.001是以DHT组为参照。实验数据以表示，并用GraphPad Prism 5.0进行作图(见图5)和统计学分析。图5A为本发明实施例5中ZNU-IMB-Z15对LNCaP细胞内源性AR下游靶基因PSA mRNA水平的影响；图5B为本发明实施例5中ZNU-IMB-Z15对LNCaP细胞内源性AR下游靶基因TMPRSS2 mRNA水平的影响。

试验结果显示，ZNU-IMB-Z15对DHT激活后的AR下游靶基因PSA和TMPRSS2具有较好的抑制作用，在0.20μM—5.00μM浓度下呈现剂量依赖关系。

实施例6 ZNU-IMB-Z15可在蛋白水平抑制LNCaP细胞中内源性AR的转录活性并可以下调内源性AR的表达。

仅仅通过双荧光素酶报告系统和qRT-PCR检测ZNU-IMB-Z15对AR下游靶基因的抑制情况不能完全说明该化合物对AR的拮抗作用。本发明接下来在蛋白水平验证了实施例2和实施例5中的结果。

具体操作步骤如下：前期处理方法与实施例5中完全相同，待到将培养基吸出收样品时，每孔加入80μL的RIPA裂解液，将裂解液转移至1.5ml EP管中冰上裂解30分钟，每管加入20μL的5X蛋白上样缓冲液(loading buffer)，100摄氏度金属浴煮30分钟。SDS-PAGE凝胶电泳分离，Western Bloting检测AR与PSA的表达量。图6为本发明实施例6中ZNU-IMB-Z15在蛋白水平对LNCaP细胞内源性AR表达及其转录活性的影响。

试验结果显示，ZNU-IMB-Z15在0.20-5.00μM的浓度范围内可以显著抑制AR调控的下游靶蛋白PSA的表达量，抑制效果与5.00μM恩杂鲁胺的效果相似，即使在0.20μM这样较低的浓度下，其抑制效果也很明显。值得注意的是，在DHT存在的条件下，ZNU-IMB-Z15可以下调AR蛋白的表达，这种AR下调作用远远强于恩杂鲁胺对AR的下调作用。

实施例7 ZNU-IMB-Z15可在蛋白水平抑制VCaP细胞中内源性AR的的表达。

上述实施例6中，ZNU-IMB-Z15显示出了AR下调作用，但在DHT激活的状态下，AR拮抗剂恩杂鲁胺也表现出了一定的AR下调作用，这与AR信号通路被抑制从而导致的AR表达水平下调有关。为了确定ZNU-IMB-Z15导致AR下调的原因是否是由于其AR拮抗作用产生的，本发明在AR高表达的VCaP细胞中研究了ZNU-IMB-Z15对未经DHT激活的AR表达水平的影响。

具体操作步骤如下：前期处理方法与实施例5中完全相同，不同之处在于本实施例使用的是VCaP细胞，待到将培养基吸出收样品时，每孔加入80μL的RIPA裂解液，将裂解液转移至1.5ml EP管中冰上裂解30分钟，每管加入20μL的5X蛋白上样缓冲液(loadingbuffer)，100摄氏度金属浴煮30分钟。SDS-PAGE凝胶电泳分离，Western Bloting检测AR与PSA的表达量。图7为本发明实施例7中ZNU-IMB-Z15在蛋白水平对未经DHT激活的VCaP细胞内源性AR表达的影响；

试验结果显示，ZNU-IMB-Z15在0.50-5.00μM的浓度范围内可以显著抑制VCaP细胞中AR蛋白的表达量，而相同条件下5.00μM恩杂鲁胺对AR蛋白的表达没有影响，该实验结果表明ZNU-IMB-Z15具有下调AR的活性，且这种AR下调活性不依赖于其对AR的拮抗作用。

实施例8 ZNU-IMB-Z15可抑制AR阳性***癌细胞的增殖。

将1.0×10⁴个/mL的LNCaP细胞悬液、22RV1细胞悬液、PC-3细胞悬液和DU145细胞悬液，按照每孔200μL接种于96孔板中。铺板24小时后，每孔加入二甲基亚砜或不同浓度的ZNU-IMB-Z15 1μL，继续培养72小时。每孔加入20μL MTT试剂，继续在二氧化碳恒温培养箱中孵育4h，最后将培养基吸出，每孔加入100μL异丙醇，在96孔板震荡器上震荡混匀10分钟，用Enspire 2300多功能酶标仪在570nM波长下测定其吸光度值。实验设置了三组平行，并进行了统计学分析，数据以二甲基亚砜组的值为参比进行了百分化处理。实验数据以表示，并用GraphPad Prism 5.0进行作图(见图8)。图8为本发明实施例8中ZNU-IMB-Z15对AR阳性***癌细胞LNCaP细胞、22Rv1细胞的增殖影响情况；ZNU-IMB-Z15对AR阴性***癌细胞PC-3细胞、DU145细胞的增殖影响情况；

本实验的检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。异丙醇能溶解细胞中的甲瓒，用多功能酶标仪在570波长处测定甲瓒的光吸收值，可间接反映活细胞数量。实验结果显示，ZNU-IMB-Z15抑制AR阳性LNCaP细胞、22RV1细胞增殖的活性明显强于抑制AR阴性PC-3细胞、DU145细胞增殖的活性，ZNU-IMB-Z15可作为新型***癌治疗的药物。

实施例9 ZJU-IMB-Z15联合恩杂鲁胺抑制内源性AR的转录功能优于恩杂鲁胺单独给药

恩杂鲁胺是目前临床上常用的第二代雄激素受体拮抗剂，为了探究ZJU-IMB-Z15联合恩杂鲁胺抑制内源性AR的转录功能是否优于恩杂鲁胺单独给药，本发明对比了1μMZJU-IMB-Z15联合1μM恩杂鲁胺在LNCaP细胞中抑制AR转录的情况。

具体实验步骤参照实施例2，不同之处在于：本实验采用LNCaP细胞体系，恩杂鲁胺与ZJU-IMB-Z15的化合物浓度为1μM，并增加了1μM ZJU-IMB-Z15联合1μM恩杂鲁胺的给药组它操作相同。实验设置了三组平行，并进行了统计学分析，其中*P<0.05，**P<0.01以二氢睾酮组为参照。实验数据以

表示，并用GraphPad Prism 5.0进行作图(见图9)和统计学分析。

实验结果显示，1μM ZJU-IMB-Z15联合1μM恩杂鲁胺的给药组抑制AR转录的活性优于这两种药物分别单独给药的分组，这组实验结果说明ZJU-IMB-Z15可以联合目前临床常用药物恩杂鲁胺，从而发挥更佳的抑制AR转录活性。

实施例10 ZJU-IMB-Z15联合恩杂鲁胺抑制AR阳性***癌细胞增殖活性优于恩杂鲁胺单独给药

虽然恩杂鲁胺在临床及体内外药效学研究中抑制AR转录活性较强，但体外研究显示，该药对AR阳性***癌细胞增殖直接抑制活性较弱，为了探究ZJU-IMB-Z15联合恩杂鲁胺抑制AR阳性***癌细胞增殖活性是否优于恩杂鲁胺单独给药，本发明对比了5μM ZJU-IMB-Z15联合5μM恩杂鲁胺在AR阳性***癌细胞中抑制细胞增殖的情况。

具体实验步骤参照实施例8，不同之处在于：本实验仅采用LNCaP细胞与22Rv1细胞体系，恩杂鲁胺与ZJU-IMB-Z15的化合物浓度仅使用5μM，并增加了5μM ZJU-IMB-Z15联合5μM恩杂鲁胺的给药组，其它操作相同。实验设置了三组平行，并进行了统计学分析，数据以二甲基亚砜组的值为参比进行了百分化处理。实验数据以

表示，并用GraphPad Prism5.0进行作图(见图10)。图10为本发明实施例10中ZJU-IMB-Z15联合恩杂鲁胺抑制AR阳性***癌细胞LNCaP细胞、22Rv1细胞的增殖影响情况；

实验结果显示，ZJU-IMB-Z15联合恩杂鲁胺的给药组抑制LNCaP细胞、22Rv1细胞增殖的活性优于这两种药物分别单独给药的分组，这组实验结果说明ZJU-IMB-Z15可以联合目前临床常用药物恩杂鲁胺，从而发挥更强的抑制***癌细胞增殖的活性。ZJU-IMB-Z15可作为与恩杂鲁胺联合使用治疗***癌的药物。