阅读说明：本技术 一种高通量低成本的微量生物样品分子鉴定技术 (High-throughput low-cost molecular identification technology for trace biological samples ) 是由 彭华正 金群英 朱汤军 叶华琳 于 2020-04-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种分子生物领域,尤其涉及一种高通量低成本的微量生物样品分子鉴定技术,包括高质量基因组提取和序列检测分析这两方面内容。本发明旨在降低微量生物样品分子鉴定的高通量测序成本。上述的一种高通量低成本的微量生物样品分子鉴定技术,步骤如下：1)样品收集；2)样品裂解；3)核酸收集；4)带标记引物的PCR扩增；5)PCR产物混合测序和位置还原。本发明不需要制备复杂的原生质体,受体来源简单,适合没有孢子的真菌转化。另外,本发明简化和提升了现有的DNA提取技术,使研究者能够利用实验室的一些简单小型设备,方便地开展大规模的高质量基因组提取；同时整合普通PCR和高通量测序技术,结合计算机分析,对上述提取的DNA实现低成本的PCR序列扩增和测序分析。(The invention relates to the field of molecular biology, in particular to a high-throughput low-cost molecular identification technology for a trace biological sample, which comprises two aspects of high-quality genome extraction and sequence detection analysis. The invention aims to reduce the high-throughput sequencing cost of molecular identification of trace biological samples. The molecular identification technology for the trace biological sample with high flux and low cost comprises the following steps: 1) collecting a sample; 2) cracking a sample; 3) collecting nucleic acid; 4) PCR amplification of the marked primer; 5) PCR products were mixed for sequencing and site reduction. The invention does not need to prepare complicated protoplast, has simple receptor source and is suitable for the transformation of the fungus without spores. In addition, the invention simplifies and improves the existing DNA extraction technology, so that researchers can conveniently carry out large-scale high-quality genome extraction by using some simple and small-sized devices in a laboratory; meanwhile, common PCR and high-throughput sequencing technologies are integrated, and the PCR sequence amplification and sequencing analysis with low cost are realized on the extracted DNA by combining computer analysis.)

一种高通量低成本的微量生物样品分子鉴定技术

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，涉及一种高通量低成本的微量生物样品分子鉴定技术，包括微量生物样品的高质量基因组提取和序列检测分析这两方面内容。

背景技术

现代分子生物技术在DNA样品提取，PCR扩增和测序等方面逐步进入高通量处理时代，这在不少研究领域是非常必要的，比如以分子手段研究某些生物特定基因位点的多样性时，通常必须面对大量的样品（包括动植物细胞和微生物），这种高通量处理通常需依赖昂贵的自动化处理机器和试剂盒。对于条件一般的实验室研究，如果按照常规方法用试剂盒人工逐个进行基因组提取、PCR扩增和测序，不仅费时费力，而且在费用上往往也难以承受。在DNA提取方面，利用试剂盒提取单个样品的高质量DNA并不难，而进行样品的批量快速低成本的提取则需要方法上的改进和优化。近年来，不少研究者提出了很多DNA提取方法的改进，但往往是仅针对一种微生物样品，如仅针对革兰氏阴性菌等，这使得在同时提取各种样品时就会面临困难，如肠道菌种既有革兰氏阴性菌这类比较容易提取DNA的样品，也有像双歧杆菌这样难以提取DNA的革兰氏阳性菌；而且，为满足大规模提取的需要，以往的大多数改进往往过于简化提取过程，严重降低了提取DNA的质量。在序列检测分析方面，PCR和经典测序法虽然已经非常成熟可靠，但是要进行成千上万的样品的测序时还是费时费力，使得高通量测序虽然测序量惊人，但每个样品的测序费用也不便宜，使用成本很高。

发明内容

为了解决上述技术问题，以便能经济快速地开展基于高通量的微量生物样品分子鉴定，本发明中提出了两个方面的创新内容：第一是简化和提升现有的DNA提取技术，使研究者能够利用实验室的一些简单小型设备，方便地经济快速地大规模提取高质量基因组；第二是整合普通PCR和高通量测序技术，结合计算机分析，对上述提取的DNA实现低成本的PCR序列扩增和测序分析；

本发明采用了以下的技术方案来实现上述的第一个创新内容：

作为优选，该技术方案包括以下的步骤：

（1）根据样品的干湿状态分别处理：微生物菌落等比较干燥的样品，直接挑取样品到离心管中就可进行下一步；如果是液体细胞悬液，则先4℃10000g离心1min，去上清液，加无菌水清洗一次，再4℃10000g离心1min，去上清液；管子可以选用排管和96孔板；

（2）根据管的体积，加入直径0.1mm-0.5mm玻璃珠至管总体积的1/8，再加入浓度为1mg/ml的1/8管总体积的proteinase K悬液，40-70℃保温5-30分钟后，以1000rpm以上速度水平或垂直震荡5min；

（3）加入10%浓度的1/4管总体积的chelex液，打散后，95℃10-20min，再冰浴；

（4）4℃10000g离心1min，取上清液做模板，冷冻保存；

本发明采用了以下的技术方案来实现上述的第二个创新内容：

作为优选，该技术方案包括以下的步骤：

（1）设计引物标记位点对应不同PCR管；

（2）PCR扩增和样品混合测序；

（3）根据测出引物序列还原不同引物所在的PCR管位置；

作为优选，上述步骤（1）包括以下三步：

根据待扩增基因序列的保守区设计通用的上下游引物，长度20-25个碱基，Tm值在55-60℃，扩增产物长度300-500bp；

② 在上下游引物5’端至引物的中部区域之间引入1-2个错配碱基作为特异标记，上游引物设计24种错配组合，下游引物设计16种错配组合，这样就形成了384个不同的引物组合，可以对应384个不同PCR管位置；

③ 在引物的5’端加上30-35个碱基的接头，衔接后续高通量测序时的PCR扩增，使得引物长度增至45个碱基左右，可以进一步加强扩增稳定性；

作为优选，上述步骤（2）包括以下三步：

设定PCR反应体系为15μl，分别按比例混合每列和每行所需的PCR反应试剂，包括引物；

进行行列的组合，配制每孔的反应体系，包含各不相同引物组合，最后各孔分别加入模板；

③ PCR反应后，取各孔1-5μl产物混合，记为一个样品，进行Illumina的Miseq深度测序；

作为优选，上述步骤（3）包括以下两步：

① 对一个样品测出的序列经计算机软件识别管孔位置相关标记并进行分类，识别时要求上下游位置的各1-2个调整碱基均出现时才能入选，以最大程度排除误差；

② 对每孔测得的序列进行排序，以序列读数多的可靠性较高，数列读数少的可进一步用经典测序方法验证，序列数少于设定预测，如10以下的视作误差予以排除。这样便可最大程度的还原每孔的序列；

本发明分为微生物基因组提取部分及PCR序列扩增和序列分析部分。所述的微生物基因组提取部分特征是：利用玻璃珠震荡，蛋白酶K的酶解，螯合树脂以及高温等适于高通量操作的方法协同发挥作用，短时间内实现大量微生物样品同时释放高质量DNA；所述的PCR序列扩增和序列分析技术部分特征是，利用引物组合标记不同的PCR样品，然后利用深度测序技术实现不同样品混合的一次性测序，最后利用计算机技术将引物标记分拣出来；本发明所述的两部分技术可以紧密连接，实现整个过程的高通量低成本操作，各部分也可以作为其它分子生物学鉴定技术的一部分；

与现有基因组提取技术及PCR序列分析技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）只需少量样本即可进行微量DNA提取，比如从平板上挑取菌落，以避开大量菌种制备的麻烦；

（2）整个操作可以多个单管，且更适合微孔板等高通量设备的操作；

（3）特别适合大规模菌种鉴定和特定基因位点在菌群中的多样性研究；

（4）提取的基因组具有较高的质量，保证了PCR序列扩增的稳定性；

不论是基因组提取技术，还是PCR序列扩增和序列分析，都体现了高通量低成本的特点。

附图说明

图1 革兰氏阳性菌长双歧杆菌(Bifidobacterium.longum)在8联PCR管中的提取效果；

图2 肠道菌PCR扩增效果。

具体实施方式

实施例1 革兰氏阳性细菌长双歧杆菌的DNA提取

细菌中，通常，革兰氏阴性菌的DNA比较容易提取；革兰氏阳性菌因为有比较厚的肽聚糖细胞壁，所以通常用单一的加热、冻融和机械破碎效果都不好；而用本发明的方法取得较好效果；

1、培养目标菌种到OD值约1.0以上；

2、将菌液吸取到200μl的8联管中，4℃10000g离心1min，去上清液。如果菌液比较稀，可以重复2-3次；然后，加入无菌水洗涤，同样离心去上清液；

3、加入25μl玻璃珠（直径0.3mm）、25μl1mg/ml浓度的 proteinase K 混匀，60℃保温10分钟；

4、微孔板混匀仪1200rpm震荡6min；

5、加入10% chelex液50μl，打散后，PCR仪热盖，95℃，20min，冷却至4℃；

6、4℃离心10000g 1min，取上清液做模板，冷冻保存；

7、取产物跑电泳可以看到清晰条带（见图1）；

实施例2 利用常用的16s rRNA引物和PCR扩增来鉴定肠道菌群

标准的16s rRNA通用引物正向为515F：5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'，反向为：907R：5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'；现采用点突变交叉组合，组成24×16的引物方阵（表1），对应384个样品组合，进行特异性扩增；扩增结果表明，对于不同的位点突变的引物，PCR效果明显，且大小均在目标条带附近，实验结果可靠（见图2）；

表1.各引物序列和编号

引物名称 接头(下划线)+通用引物(5'-3'，突变用小写标识) 编号

1B515F1-A CACTCCATACAGCACGCTCTTCCGATCTTCCCGAaTGCCAGCMGCCGCGG D1

1B515F1-B CACTCCATACAGCACGCTCTTCCGATCTTCCCGAtTGCCAGCMGCCGCGG D2

1B515F1-C CACTCCATACAGCACGCTCTTCCGATCTTCCCGAcTGCCAGCMGCCGCGG D3

1B515F1-D CACTCCATACAGCACGCTCTTCCGATCTTCCCGAGaGCCAGCMGCCGCGG D4

1B515F1-E CACTCCATACAGCACGCTCTTCCGATCTTCCCGAGTaCCAGCMGCCGCGG D5

1B515F1-F CACTCCATACAGCACGCTCTTCCGATCTTCCCGAGTtCCAGCMGCCGCGG D6

1B515F1-G CACTCCATACAGCACGCTCTTCCGATCTTCCCGAGTcCCAGCMGCCGCGG D7

1B515F1-H CACTCCATACAGCACGCTCTTCCGATCTTCCCGAGTGaCAGCMGCCGCGG D8

1B515F1-I CACTCCATACAGCACGCTCTTCCGATCTTCCCGAGTGtCAGCMGCCGCGG E1

1B515F1-J CACTCCATACAGCACGCTCTTCCGATCTTCCCGAGTGgCAGCMGCCGCGG E2

1B515F1-K CACTCCATACAGCACGCTCTTCCGATCTTCCCGAGTGCaAGCMGCCGCGG E3

1B515F1-L CACTCCATACAGCACGCTCTTCCGATCTTCCCGAGTGCtAGCMGCCGCGG E4

1B515F1-M CACTCCATACAGCACGCTCTTCCGATCTTCCCGAGTGCgAGCMGCCGCGG E5

1B515F1-N CACTCCATACAGCACGCTCTTCCGATCTTCCCGAGTGCCtGCMGCCGCGG E6

1B515F1-O CACTCCATACAGCACGCTCTTCCGATCTTCCCGAGTGCCAaCMGCCGCGG E7

1B515F1-P CACTCCATACAGCACGCTCTTCCGATCTTCCCGAGTGCCAtCMGCCGCGG E8

1B907R1-1 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGAaCGTCAATTCMTTTRAGTTT A1

1B907R1-2 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGAtCGTCAATTCMTTTRAGTTT A2

1B907R1-3 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGAgCGTCAATTCMTTTRAGTTT A3

1B907R1-4 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACaGTCAATTCMTTTRAGTTT A4

1B907R1-5 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACtGTCAATTCMTTTRAGTTT A5

1B907R1-6 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACgGTCAATTCMTTTRAGTTT A6

1B907R1-7 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACCaTCAATTCMTTTRAGTTT A7

1B907R1-8 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACCtTCAATTCMTTTRAGTTT A8

1B907R1-9 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACCGaCAATTCMTTTRAGTTT A9

1B907R1-10 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACCGcCAATTCMTTTRAGTTT A10

1B907R1-11 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACCGgCAATTCMTTTRAGTTT A11

1B907R1-12 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACCGTaAATTCMTTTRAGTTT A12

1B907R1-13 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACCGTtAATTCMTTTRAGTTT B1

1B907R1-14 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACCGTgAATTCMTTTRAGTTT B2

1B907R1-15 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACCGTCtATTCMTTTRAGTTT B3

1B907R1-16 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACCGTCcATTCMTTTRAGTTT B4

1B907R1-17 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACCGTCgATTCMTTTRAGTTT B5

1B907R1-18 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACCGTCAtTTCMTTTRAGTTT B6

1B907R1-19 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACCGTCAcTTCMTTTRAGTTT B7

1B907R1-20 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACCGTCAgTTCMTTTRAGTTT B8

1B907R1-21 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACCGTCAAcTCMTTTRAGTTT B9

1B907R1-22 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACCGTCAAgTCMTTTRAGTTT B10

1B907R1-23 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACCGTCAATaCMTTTRAGTTT B11

1B907R1-24 CATCATATACAGCACGCTACCTTGATCTTCCCGACCGTCAATcCMTTTRAGTTT B12

注：下划线接头序列根据高通量测序所用引物而定，这里只是做一个示例；

PCR反应液配制：

mix采用擎科2×TSINGKE Master Mix，引物生工合成，page纯化，水是自备的无菌水；反应液混装于96深孔板；

正向引物（24条）：水0.6×24×3.3=48，mix 3.8×24×3.3=301，各引物0.6×24×3.3=48

反向引物（16条）：水0.6×16×3.3=32，mix 3.8×16×3.2=201，各引物0.6×16×3.2=32

注：此量已增加10%余量，够3×4×96孔的量

引物与模板对应：

用thermo12道（5-50μl）移液器加样，以4个96孔板组成384孔的样品，对应24×16个引物组合，加样量行列各5μl，每孔不包括模板最终10μl，最后加模板5μl；

PCR程序：94℃ 5 min；95℃ 10s，56℃50s，72℃ 100s，共35轮；72℃5min；4℃ 30 min；

电泳检测条件

name description

gel TAE 90ml, 25comb

Agarose(1%) Biowest 0.3g

dye EB(10mg/ml)2μl

buffer TAE,45ML

device DYY-8c

Voltage(V) 120

Current(mA) 150

Time(min) 25

Loading Product 5μl

marker DL 2000 marker

实施例3 序列标记识别和还原到各管

利用python软件设计分拣程序：

程序流程：按所有测序出的序列标记位点分配到对应的PCR反应孔>>每孔选取20-30个序列整合成单个fasta文件>>进行单机BLAST序列比对>>对excel中的结果进行分类和排序>>将同源比对结果输出到excel；执行效果如下表所示：

表中第一列为孔位置，第二列为随机取出的最多20个序列，第三列为最大可能的菌种，第四列为菌种的序列；

Cell_position Total_count 1Species 1Hit

515F1-D-907R1-9 20 Veillonella dispar 8

515F1-E-907R1-9 20 Veillonella dispar 7

515F1-H-907R1-11 20 Veillonella dispar 4

515F1-I-907R1-6 20 Veillonella dispar 5

515F1-I-907R1-7 20 Veillonella dispar 7

515F1-J-907R1-8 20 Veillonella dispar 7

515F1-K-907R1-10 20 Veillonella dispar 11

515F1-K-907R1-11 20 Veillonella dispar 8

515F1-K-907R1-12 20 Veillonella dispar 9

515F1-K-907R1-7 20 Veillonella dispar 7

515F1-L-907R1-12 20 Veillonella dispar 8

515F1-L-907R1-9 20 Veillonella dispar 13

515F1-N-907R1-13 5 Veillonella dispar 1

515F1-P-907R1-18 5 Veillonella dispar 1

515F1-O-907R1-11 20 Sphingomonas koreensis 2

515F1-E-907R1-2 20 Microbacterium maritypicum 6

515F1-G-907R1-24 13 Microbacterium maritypicum 4

515F1-A-907R1-1 20 Escherichia fergusonii 16

515F1-A-907R1-10 20 Escherichia fergusonii 17

515F1-A-907R1-11 20 Escherichia fergusonii 15

515F1-A-907R1-12 20 Escherichia fergusonii 15

515F1-A-907R1-13 20 Escherichia fergusonii 19

515F1-A-907R1-14 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-A-907R1-15 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-A-907R1-16 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-A-907R1-17 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-A-907R1-18 20 Escherichia fergusonii 15

515F1-A-907R1-19 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-A-907R1-20 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-A-907R1-22 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-A-907R1-23 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-A-907R1-3 20 Escherichia fergusonii 17

515F1-A-907R1-4 8 Escherichia fergusonii 6

515F1-A-907R1-5 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-A-907R1-6 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-A-907R1-7 16 Escherichia fergusonii 7

515F1-A-907R1-8 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-A-907R1-9 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-B-907R1-1 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-B-907R1-10 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-B-907R1-11 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-B-907R1-12 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-B-907R1-13 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-B-907R1-14 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-B-907R1-18 20 Escherichia fergusonii 9

515F1-B-907R1-19 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-B-907R1-2 20 Escherichia fergusonii 6

515F1-B-907R1-20 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-B-907R1-22 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-B-907R1-23 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-B-907R1-24 20 Escherichia fergusonii 16

515F1-B-907R1-3 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-B-907R1-4 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-B-907R1-5 20 Escherichia fergusonii 9

515F1-B-907R1-6 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-B-907R1-7 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-B-907R1-8 20 Escherichia fergusonii 8

515F1-B-907R1-9 20 Escherichia fergusonii 9

515F1-C-907R1-1 20 Escherichia fergusonii 15

515F1-C-907R1-10 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-C-907R1-11 20 Escherichia fergusonii 15

515F1-C-907R1-13 20 Escherichia fergusonii 8

515F1-C-907R1-15 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-C-907R1-16 20 Escherichia fergusonii 9

515F1-C-907R1-17 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-C-907R1-18 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-C-907R1-2 20 Escherichia fergusonii 15

515F1-C-907R1-22 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-C-907R1-24 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-C-907R1-3 20 Escherichia fergusonii 15

515F1-C-907R1-4 10 Escherichia fergusonii 6

515F1-C-907R1-5 15 Escherichia fergusonii 7

515F1-C-907R1-6 20 Escherichia fergusonii 9

515F1-C-907R1-7 20 Escherichia fergusonii 17

515F1-C-907R1-8 20 Escherichia fergusonii 15

515F1-C-907R1-9 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-D-907R1-1 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-D-907R1-10 20 Escherichia fergusonii 6

515F1-D-907R1-11 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-D-907R1-12 20 Escherichia fergusonii 17

515F1-D-907R1-13 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-D-907R1-14 20 Escherichia fergusonii 9

515F1-D-907R1-18 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-D-907R1-2 20 Escherichia fergusonii 15

515F1-D-907R1-20 20 Escherichia fergusonii 16

515F1-D-907R1-22 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-D-907R1-23 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-D-907R1-24 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-D-907R1-3 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-D-907R1-4 16 Escherichia fergusonii 10

515F1-D-907R1-5 20 Escherichia fergusonii 7

515F1-D-907R1-6 20 Escherichia fergusonii 8

515F1-D-907R1-7 20 Escherichia fergusonii 9

515F1-D-907R1-8 20 Escherichia fergusonii 7

515F1-E-907R1-1 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-E-907R1-10 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-E-907R1-11 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-E-907R1-12 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-E-907R1-13 20 Escherichiafergusonii 9

515F1-E-907R1-14 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-E-907R1-15 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-E-907R1-16 20 Escherichia fergusonii 7

515F1-E-907R1-17 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-E-907R1-23 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-E-907R1-24 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-E-907R1-3 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-E-907R1-4 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-E-907R1-5 20 Escherichia fergusonii 7

515F1-E-907R1-6 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-E-907R1-7 20 Escherichia fergusonii 7

515F1-E-907R1-8 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-F-907R1-1 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-F-907R1-10 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-F-907R1-11 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-F-907R1-12 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-F-907R1-13 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-F-907R1-16 20 Escherichia fergusonii 8

515F1-F-907R1-17 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-F-907R1-19 20 Escherichia fergusonii 6

515F1-F-907R1-2 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-F-907R1-20 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-F-907R1-23 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-F-907R1-24 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-F-907R1-3 20 Escherichia fergusonii 15

515F1-F-907R1-4 18 Escherichia fergusonii 8

515F1-F-907R1-5 20 Escherichia fergusonii 9

515F1-F-907R1-6 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-F-907R1-7 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-F-907R1-8 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-F-907R1-9 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-G-907R1-1 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-G-907R1-10 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-G-907R1-11 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-G-907R1-12 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-G-907R1-13 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-G-907R1-14 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-G-907R1-19 20 Escherichia fergusonii 5

515F1-G-907R1-2 20 Escherichia fergusonii 9

515F1-G-907R1-20 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-G-907R1-3 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-G-907R1-4 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-G-907R1-5 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-G-907R1-6 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-G-907R1-7 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-G-907R1-8 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-G-907R1-9 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-H-907R1-1 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-H-907R1-10 10 Escherichia fergusonii 3

515F1-H-907R1-13 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-H-907R1-16 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-H-907R1-18 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-H-907R1-19 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-H-907R1-2 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-H-907R1-20 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-H-907R1-23 10 Escherichia fergusonii 6

515F1-H-907R1-24 15 Escherichia fergusonii 6

515F1-H-907R1-3 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-H-907R1-4 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-H-907R1-5 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-H-907R1-6 20 Escherichia fergusonii 7

515F1-H-907R1-7 20 Escherichia fergusonii 8

515F1-H-907R1-8 20 Escherichia fergusonii 5

515F1-H-907R1-9 18 Escherichia fergusonii 8

515F1-I-907R1-1 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-I-907R1-10 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-I-907R1-11 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-I-907R1-12 20 Escherichia fergusonii 8

515F1-I-907R1-13 6 Escherichia fergusonii 4

515F1-I-907R1-15 7 Escherichia fergusonii 3

515F1-I-907R1-19 9 Escherichia fergusonii 3

515F1-I-907R1-2 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-I-907R1-21 4 Escherichia fergusonii 2

515F1-I-907R1-22 9 Escherichia fergusonii 3

515F1-I-907R1-23 6 Escherichia fergusonii 3

515F1-I-907R1-24 5 Escherichia fergusonii 2

515F1-I-907R1-3 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-I-907R1-4 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-I-907R1-5 20 Escherichia fergusonii 9

515F1-I-907R1-8 20 Escherichia fergusonii 9

515F1-I-907R1-9 20 Escherichia fergusonii 7

515F1-J-907R1-1 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-J-907R1-10 3 Escherichia fergusonii 2

515F1-J-907R1-11 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-J-907R1-12 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-J-907R1-13 7 Escherichia fergusonii 5

515F1-J-907R1-14 5 Escherichia fergusonii 3

515F1-J-907R1-15 7 Escherichia fergusonii 4

515F1-J-907R1-16 8 Escherichia fergusonii 2

515F1-J-907R1-17 20 Escherichia fergusonii 15

515F1-J-907R1-18 6 Escherichia fergusonii 3

515F1-J-907R1-2 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-J-907R1-20 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-J-907R1-21 9 Escherichia fergusonii 5

515F1-J-907R1-22 9 Escherichia fergusonii 5

515F1-J-907R1-23 3 Escherichia fergusonii 2

515F1-J-907R1-24 6 Escherichia fergusonii 4

515F1-J-907R1-3 20 Escherichia fergusonii 6

515F1-J-907R1-4 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-J-907R1-5 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-J-907R1-6 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-J-907R1-7 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-J-907R1-9 13 Escherichia fergusonii 5

515F1-K-907R1-1 20 Escherichia fergusonii 15

515F1-K-907R1-13 12 Escherichia fergusonii 7

515F1-K-907R1-14 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-K-907R1-17 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-K-907R1-2 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-K-907R1-21 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-K-907R1-23 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-K-907R1-3 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-K-907R1-4 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-K-907R1-5 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-K-907R1-6 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-K-907R1-8 20 Escherichia fergusonii 9

515F1-K-907R1-9 20 Escherichia fergusonii 7

515F1-L-907R1-1 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-L-907R1-10 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-L-907R1-11 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-L-907R1-13 11 Escherichia fergusonii 5

515F1-L-907R1-14 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-L-907R1-17 20 Escherichia fergusonii 8

515F1-L-907R1-18 20 Escherichia fergusonii 15

515F1-L-907R1-2 20 Escherichia fergusonii 17

515F1-L-907R1-20 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-L-907R1-21 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-L-907R1-22 20 Escherichia fergusonii 9

515F1-L-907R1-23 20 Escherichia fergusonii 15

515F1-L-907R1-24 9 Escherichia fergusonii 6

515F1-L-907R1-3 20 Escherichia fergusonii 15

515F1-L-907R1-4 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-L-907R1-5 20 Escherichia fergusonii 7

515F1-L-907R1-6 20 Escherichia fergusonii 7

515F1-L-907R1-7 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-L-907R1-8 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-M-907R1-1 20 Escherichia fergusonii 8

515F1-M-907R1-10 20 Escherichia fergusonii 7

515F1-M-907R1-11 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-M-907R1-12 20 Escherichia fergusonii 9

515F1-M-907R1-13 14 Escherichia fergusonii 7

515F1-M-907R1-15 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-M-907R1-19 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-M-907R1-2 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-M-907R1-20 20 Escherichia fergusonii 6

515F1-M-907R1-22 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-M-907R1-23 12 Escherichia fergusonii 7

515F1-M-907R1-24 10 Escherichia fergusonii 4

515F1-M-907R1-3 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-M-907R1-4 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-M-907R1-5 20 Escherichia fergusonii 6

515F1-M-907R1-6 20 Escherichia fergusonii 8

515F1-M-907R1-7 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-M-907R1-8 20 Escherichia fergusonii 8

515F1-M-907R1-9 20 Escherichia fergusonii 9

515F1-N-907R1-1 13 Escherichia fergusonii 5

515F1-N-907R1-10 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-N-907R1-11 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-N-907R1-12 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-N-907R1-15 11 Escherichia fergusonii 4

515F1-N-907R1-17 9 Escherichia fergusonii 4

515F1-N-907R1-18 9 Escherichia fergusonii 5

515F1-N-907R1-2 5 Escherichia fergusonii 2

515F1-N-907R1-20 9 Escherichia fergusonii 5

515F1-N-907R1-21 7 Escherichia fergusonii 4

515F1-N-907R1-22 10 Escherichia fergusonii 4

515F1-N-907R1-23 5 Escherichia fergusonii 3

515F1-N-907R1-24 5 Escherichia fergusonii 4

515F1-N-907R1-3 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-N-907R1-4 20 Escherichia fergusonii 9

515F1-N-907R1-5 20 Escherichia fergusonii 16

515F1-N-907R1-6 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-N-907R1-7 20 Escherichia fergusonii 8

515F1-N-907R1-8 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-N-907R1-9 20 Escherichia fergusonii 7

515F1-O-907R1-1 18 Escherichia fergusonii 13

515F1-O-907R1-10 20 Escherichia fergusonii 5

515F1-O-907R1-2 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-O-907R1-22 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-O-907R1-3 20 Escherichia fergusonii 14

515F1-O-907R1-4 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-O-907R1-5 20 Escherichia fergusonii 12

515F1-O-907R1-6 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-O-907R1-7 20 Escherichia fergusonii 8

515F1-O-907R1-8 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-O-907R1-9 20 Escherichia fergusonii 9

515F1-P-907R1-1 10 Escherichia fergusonii 4

515F1-P-907R1-10 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-P-907R1-12 11 Escherichia fergusonii 2

515F1-P-907R1-13 6 Escherichia fergusonii 3

515F1-P-907R1-14 8 Escherichia fergusonii 3

515F1-P-907R1-17 20 Escherichia fergusonii 11

515F1-P-907R1-19 8 Escherichia fergusonii 3

515F1-P-907R1-20 8 Escherichia fergusonii 5

515F1-P-907R1-21 5 Escherichia fergusonii 4

515F1-P-907R1-22 5 Escherichia fergusonii 2

515F1-P-907R1-23 4 Escherichia fergusonii 3

515F1-P-907R1-24 3 Escherichia fergusonii 2

515F1-P-907R1-3 20 Escherichia fergusonii 13

515F1-P-907R1-4 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-P-907R1-5 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-P-907R1-6 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-P-907R1-7 20 Escherichia fergusonii 7

515F1-P-907R1-8 20 Escherichia fergusonii 10

515F1-P-907R1-9 20 Escherichia fergusonii 8

515F1-A-907R1-21 20 Enterococcus hirae 11

515F1-B-907R1-15 20 Enterococcus hirae 10

515F1-B-907R1-16 20 Enterococcus hirae 9

515F1-B-907R1-17 20 Enterococcus hirae 7

515F1-B-907R1-21 20 Enterococcus hirae 10

515F1-C-907R1-12 20 Enterococcus hirae 5

515F1-C-907R1-14 20 Enterococcus hirae 9

515F1-C-907R1-19 20 Enterococcus hirae 10

515F1-C-907R1-20 20 Enterococcus hirae 11

515F1-C-907R1-21 20 Enterococcus hirae 10

515F1-C-907R1-23 20 Enterococcus hirae 11

515F1-D-907R1-16 20 Enterococcus hirae 14

515F1-D-907R1-17 20 Enterococcus hirae 11

515F1-D-907R1-19 20 Enterococcus hirae 10

515F1-D-907R1-21 20 Enterococcus hirae 9

515F1-E-907R1-18 20 Enterococcus hirae 8

515F1-E-907R1-19 20 Enterococcus hirae 9

515F1-E-907R1-20 20 Enterococcus hirae 12

515F1-E-907R1-21 20 Enterococcus hirae 13

515F1-E-907R1-22 20 Enterococcus hirae 10

515F1-F-907R1-14 20 Enterococcus hirae 10

515F1-F-907R1-15 20 Enterococcus hirae 9

515F1-F-907R1-18 20 Enterococcus hirae 10

515F1-F-907R1-21 20 Enterococcus hirae 13

515F1-F-907R1-22 20 Enterococcus hirae 9

515F1-G-907R1-15 20 Enterococcus hirae 12

515F1-G-907R1-16 20 Enterococcus hirae 9

515F1-G-907R1-17 20 Enterococcus hirae 8

515F1-G-907R1-18 20 Enterococcus hirae 9

515F1-G-907R1-21 20 Enterococcus hirae 11

515F1-G-907R1-22 20 Enterococcus hirae 11

515F1-G-907R1-23 5 Enterococcus hirae 2

515F1-H-907R1-12 17 Enterococcus hirae 5

515F1-H-907R1-14 20 Enterococcus hirae 14

515F1-H-907R1-15 20 Enterococcus hirae 12

515F1-H-907R1-17 20 Enterococcus hirae 10

515F1-H-907R1-21 20 Enterococcus hirae 11

515F1-H-907R1-22 20 Enterococcus hirae 9

515F1-I-907R1-14 2 Enterococcus hirae 1

515F1-I-907R1-17 10 Enterococcus hirae 5

515F1-I-907R1-18 3 Enterococcus hirae 1

515F1-I-907R1-20 6 Enterococcus hirae 2

515F1-J-907R1-19 5 Enterococcus hirae 2

515F1-K-907R1-15 20 Enterococcus hirae 14

515F1-K-907R1-22 20 Enterococcus hirae 10

515F1-K-907R1-24 5 Enterococcus hirae 2

515F1-L-907R1-15 20 Enterococcus hirae 20

515F1-L-907R1-16 20 Enterococcus hirae 17

515F1-L-907R1-19 20 Enterococcus hirae 13

515F1-M-907R1-14 17 Enterococcus hirae 6

515F1-M-907R1-16 20 Enterococcus hirae 12

515F1-M-907R1-17 20 Enterococcus hirae 16

515F1-M-907R1-18 20 Enterococcus hirae 18

515F1-M-907R1-21 20 Enterococcus hirae 13

515F1-N-907R1-14 3 Enterococcus hirae 1

515F1-N-907R1-16 10 Enterococcus hirae 2

515F1-N-907R1-19 5 Enterococcus hirae 2

515F1-O-907R1-13 5 Enterococcus hirae 2

515F1-O-907R1-14 5 Enterococcus hirae 3

515F1-O-907R1-15 20 Enterococcus hirae 8

515F1-O-907R1-19 20 Enterococcus hirae 12

515F1-O-907R1-20 20 Enterococcus hirae 14

515F1-O-907R1-23 6 Enterococcus hirae 3

515F1-O-907R1-24 4 Enterococcus hirae 1

515F1-P-907R1-16 20 Enterococcus hirae 16

515F1-A-907R1-24 20 Enterococcus gallinarum 13

515F1-D-907R1-15 20 Enterococcus gallinarum 11

515F1-K-907R1-18 20 Enterococcus gallinarum 10

515F1-K-907R1-19 20 Enterococcus gallinarum 14

515F1-K-907R1-20 20 Enterococcus gallinarum 12

515F1-O-907R1-17 20 Enterococcus gallinarum 9

515F1-O-907R1-18 20 Enterococcus gallinarum 10

515F1-O-907R1-21 20 Enterococcus gallinarum 14

515F1-P-907R1-15 20 Enterococcus gallinarum 11

515F1-O-907R1-16 20 Clostridium paraputrificum 4

515F1-A-907R1-2 20 Clostridium butyricum 14

515F1-O-907R1-12 9 Clostridium butyricum 3

515F1-P-907R1-2 20 Clostridium butyricum 14

515F1-P-907R1-11 20 Acinetobacter johnsonii 6

515F1-K-907R1-16 20 [Clostridium] innocuum 10

515F1-I-907R1-16 2 [Clostridium] bolteae 1