一种基于肠道类器官筛选药物的方法

文档序号:1374344 发布日期:2020-08-14 浏览:12次 >En<

阅读说明:本技术 一种基于肠道类器官筛选药物的方法 (Method for screening drugs based on intestinal organoids ) 是由 秦环龙 蔚青 李曼 于 2020-04-17 设计创作,主要内容包括:本发明公开了一种基于肠道类器官筛选药物的方法,包括如下步骤:用手术切除的新鲜结直肠癌组织或肠镜活检标本构建肠道类器官;将培养好的肠道类器官消化为单细胞,然后将单细胞按照一定数量铺于96孔酶标板中;将待筛选的药物加入孔中,放入培养箱中培养5天;培养完成后,每孔加入CellTiter-Glo 3D细胞活力检测试剂10min后,置于OrionⅡ仪器读值,评估细胞活力。本发明提供的一种基于肠道类器官筛选药物的方法采用肠道类器官模型作为疗效评估的手段,通过术中或肠镜活检标本构建肠道类器官,体外应用抗肿瘤药物及靶向药物等处理肠道类器官,效果数据接近真实效果,可为个体化治疗提供依据。(The invention discloses a method for screening drugs based on intestinal organoids, which comprises the following steps: constructing intestinal organoids by using fresh colorectal cancer tissues or enteroscope biopsy specimens which are excised in an operation; digesting the cultured intestinal organoids into single cells, and then paving the single cells in a 96-hole enzyme label plate according to a certain quantity; adding the drug to be screened into the hole, and putting the hole into an incubator for 5 days; after the culture is completed, CellTiter-Glo 3D cell viability detection reagent is added into each well for 10min, and then the cell viability is evaluated by reading the cell viability in an Orion II instrument. The method for screening the medicines based on the intestinal organoids adopts the intestinal organoid model as a curative effect evaluation means, constructs the intestinal organoids through intraoperative or enteroscope biopsy specimens, treats the intestinal organoids by applying anti-tumor medicines, targeted medicines and the like in vitro, has effect data close to a real effect, and can provide a basis for individualized treatment.)

一种基于肠道类器官筛选药物的方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域,尤其涉及一种基于肠道类器官筛选药物的方法。

背景技术

荷兰Hubrecht研究所Hans Clevers实验室于2009年报道了体外培养小鼠肠道类器官的方法,自此开辟了体外3D细胞培养的技术1。Toshiro Sato等人由结直肠癌患者样本体外构建人的肠道类器官(patient-derived tumor organoids,PDOs),该技术可在体外模拟体内3D生长环境,与传统二维培养系统相比,能够更加真实反映肠道功能及体内的信号传导及形态,并且与原发肿瘤灶基因突变类型高度一致2。因此科学家们借助类器官这一研究工具,用于研究肠癌发生发展的病理机制及抗肿瘤药物的体外筛选。GeorgiosVlachogiannis等人运用PDOs模型于体外筛选结直肠癌(CRC)患者有效药物,结果表明在PDOs中有效的药物,患者服用后有效率达88%,若在PDOs模型中无效,患者服用后亦无效,证明PDOs能够作为一种有效的抗肿瘤药物筛选手段,实现个体化治疗3

本发明拟采用PDOs模型作为疗效评估的手段,为个体化治疗提供策略。

参考文献:

1.Sato T,Vries RG,Snippert HJ,etal.Single Lgr5 stem cells buildcrypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.Nature 2009,459(7244):262-265.

2.Sato T,Stange DE,Ferrante M,et al.Long-term expansionof epithelialorganoids from human colon,adenoma,adenocarcinoma,and Barrett'sepithelium.Gastroenterology 2011,141(5):1762-1772.

3.Vlachogiannis G,Hedayat S,Vatsiou A,et al.Patient-derived organoidsmodel treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.Science2018,359(6378):920-926.

发明内容

本发明针对现有技术的不足,提供了一种基于肠道类器官筛选药物的方法,通过术中或肠镜活检标本构建PDOs,体外应用抗肿瘤药物及靶向药物等处理PDOs,通过细胞活力检测评估上述治疗的有效性。

为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:

本发明的提供了一种基于肠道类器官筛选药物的方法,包括如下步骤:

步骤一,用手术切除的新鲜结直肠癌组织或肠镜活检标本构建肠道类器官;

步骤二,将培养好的肠道类器官消化为单细胞,然后将单细胞按照一定数量铺于96孔酶标板中;

步骤三,将待筛选的药物加入96孔酶标板的孔中,放入培养箱中培养;

步骤四,培养完成后,每孔加入CellTiter-Glo 3D细胞活力检测试剂10min后,置于OrionⅡ仪器读值,评估细胞活力。

进一步地,药物为5-Fu、奥沙利铂、SN-38、雷替曲塞或溶瘤病毒。

进一步地,细胞活力是基于ATP数值进行评估。

进一步地,步骤一中构建肠道类器官的具体方法包括如下步骤:

(1)将新鲜结直肠癌组织彻底清洗后,然后剪切成碎块,离心,弃上清;

(2)加入消化液,重悬沉淀,剧烈震荡,置于冰上孵育;将孵育后的上清液过滤并离心,弃上清;

(3)重悬步骤(2)获得的细胞沉淀,计数;取细胞悬液于另一离心管中,离心,弃上清;

(4)将步骤(3)获得的细胞沉淀与液态温敏性基质胶混合;孵育,然后加入人结直肠类器官培养基,置于培养箱中培养5-7天。

进一步地,步骤(1)中清洗采用的清洗液为含有1%青霉素/链霉素的PBS溶液。

进一步地,步骤(1)中碎块的大小为2-4mm3

进一步地,基质胶与细胞的比例为50μl/20000个。

进一步地,基质胶在与细胞沉淀混合之前需要用预冷后枪头吹吸。

本发明采用以上技术方案,与现有技术相比,具有如下技术效果:

本发明提供的一种基于肠道类器官筛选药物的方法采用PDOs模型作为疗效评估的手段,通过术中或肠镜活检标本构建PDOs,体外应用抗肿瘤药物及靶向药物等处理PDOs,效果数据接近真实效果,可为个体化治疗提供依据。

附图说明

图1为本发明一实施例肠癌患者类器官体外生长过程中的状态图片;

图2为本发明一实施例中PDOs模型体外筛药的柱状结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种基于肠道类器官筛选药物的方法采用PDOs模型作为疗效评估的手段,通过术中或肠镜活检标本构建PDOs,体外应用抗肿瘤药物及靶向药物等处理PDOs,通过细胞活力检测评估上述治疗的有效性。

上述基于肠道类器官筛选药物的方法包括如下步骤:

步骤一,用手术切除的新鲜结直肠癌组织或肠镜活检标本构建肠道类器官;

步骤二,将培养好的肠道类器官消化为单细胞,然后将单细胞按照一定数量铺于96孔酶标板中;

步骤三,将待筛选的药物加入孔中,放入培养箱中培养;

步骤四,培养完成后,每孔加入CellTiter-Glo 3D细胞活力检测试剂10min后,置于OrionⅡ仪器读值,评估细胞活力。

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍,以使更好地理解本发明,但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例1

本实施例提供PDOs的构建方法,包括如下步骤:

1.将手术切除的新鲜结直肠癌组织(离体30min内)置于含5ml PBS+1%青霉素/链霉素培养皿内清洗2遍;

2.将肿瘤组织彻底清洗后,持无菌器械将肿瘤组织切成2-4mm3大小的碎块,置于15ml离心管(含冰PBS缓冲液10ml)中,1500rpm×3min离心,弃上清。

3.加入5ml组织消化液(stemcell,cat:07174),重悬第二步得到的肿瘤碎块组织,剧烈震荡后,置于冰上孵育30min。

4.将孵育后的上清液经100μm滤网过滤至50ml离心管,获得过滤液。

5.取1ml第4步获得的过滤液,以190g转速离心5min,弃上清。

6.以1ml基础培养基重悬细胞后,计数。

7.取出所需细胞悬液转至EP管内,以190g转速离心5min,弃上清后,将EP管置于冰上。

8.在EP管内以预冷的枪头吸取适量4℃液态温敏型Matrigel基质胶(加入比例为50μl Matrigel基质胶/20000个细胞),并以预冷后枪头吹吸Matrigel基质胶十次,注意在此过程中避免产生气泡。

9.将细胞与基质胶混合液以每孔50μl滴加入预热24孔板上,凝胶在遇热后迅速转变为果冻状。

10.将滴加细胞与基质胶混合物的24孔板置于37℃,5%CO2培养箱孵育30min后,每孔加入700μl人结直肠类器官培养基(stemcell,cat:06011,06012)后置于37℃,5%CO2培养箱培养,显微镜下观察类器官生长状态,如图1所示。

实施例2

本实施例应用实施例1中构建好的PDOs筛选抗肿瘤的药物,其具体的过程包括如下步骤:

1.将实施例1中培养好的类器官消化为单细胞,以4000个细胞每孔铺于96孔板。

2.在孔内加入不同的药物处理,其中,5-Fu浓度为25μg/ml,奥沙利铂浓度为5μg/ml,SN-38浓度为0.1μg/ml,雷替曲塞浓度为0.8μg/ml,溶瘤病毒感染复数MOI值为1。加药后置于37℃,5%CO2培养箱培养5天。

3.经药物处理5天后,每孔加入80微升CellTiter-Glo 3D细胞活力检测试剂10min后,置于OrionⅡ仪器读ATP检测数值,与未加药物对照组对比细胞活力状态,结果如图2所示。

如图2所示,制备的PDOs模型对于5-Fu、奥沙利铂、SN-38及溶瘤病毒均敏感,但对于雷替曲塞不敏感。其中,该PDOs模型对于SN-38的处理极为敏感,细胞存活率不足10%,提示SN-38可以作为该患者治疗方案的优选药物,为临床患者个体化治疗提供依据。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述,但其只是作为范例,本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言,任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此,在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改,都应涵盖在本发明的范围内。

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