阅读说明：本技术 一种用于检测调味品中难培养菌的培养基和检测方法 (Culture medium and detection method for detecting refractory bacteria in seasoning ) 是由 黄寿聪 王洪江 桂军强 于 2020-06-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于检测调味品中难培养菌的培养基,包含MRS 0.040～0.070g/mL、蔗糖0.005～0.030g/mL、复配生长因子0.0005～0.0020g/mL和待测调味品稀释液200～500mL/L；所述复配生长因子包含以下重量份的组分：L-半胱氨酸30～70份、FeSO<Sub>4</Sub>·7H<Sub>2</Sub>O 30～70份和吐温-80 0～30份；所述待测调味品稀释液中待测调味品的质量浓度为40～70％。本发明所述培养基中添加待测调味品稀释液和复配生长因子,为变质菌的生长提供适宜的微量元素和生长因子,缩短了变质菌的培养时间,提高了检测效率。本发明还公开了一种调味品的质量检测方法。(The invention discloses a culture medium for detecting refractory bacteria in a seasoning, which comprises 0.040-0.070 g/mL of MRS, 0.005-0.030 g/mL of sucrose, 0.0005-0.0020 g/mL of compound growth factor and 200-500 mL/L of seasoning diluent to be detected; the compound growth factor comprises the following components in parts by weight: 30-70 parts of L-cysteine and FeSO 4 ·7H 2 30-70 parts of O and 800-30 parts of Tween-; the mass concentration of the condiment to be detected in the condiment diluent to be detected is 40-70%. The culture medium is added with the condiment diluent to be detected and the compound growth factor, so that appropriate trace elements and growth factors are provided for the growth of spoilage bacteria, the culture time of the spoilage bacteria is shortened, and the detection efficiency is improved. The invention also discloses a quality detection method of the seasoning.)

一种用于检测调味品中难培养菌的培养基和检测方法

技术领域

本发明涉及微生物的检测方法，具体涉及一种用于检测调味品中难培养菌的培养基和检测方法。

背景技术

调味品是指能增加菜肴的色、香、味，促进食欲，有益于人体健康的辅助食品。它的主要功能是增进菜品质量，满足消费者的感官需要，从而刺激食欲，增进人体健康。调味品在生产过程中若灭菌处理不当，部分嗜热耐酸菌会引调味品货架期出现变质的现象。对于调味品难培养型的微生物检测，目前相关的技术主要有以下方面：

专利号：201811113012.X《一种料酒中产气菌的培养基和检测方法》公开了一种料酒中产气菌的培养基和检测方法，包括步骤：将待测料酒样品稀释，然后接种入含有培养基的发酵管中，在30℃±1℃条件下培养48±2h后，根据发酵管的产气与否来检测产气菌；培养基由以下重量份的原料组成：蔗糖10～30份，酵母膏3～6份，蛋白胨4～10份，氯化钠3～10份，黄酒2～8份，吐温-80 1～2份，巯基乙酸钠0.05～1份，七水硫酸镁0.2～0.6份，甲硫氨酸0.01～0.1份，半胱氨酸0.01～0.2份，蒸馏水1000份。使用本发明的检测方法，能检测出难于在常规培养基上生长的料酒难培养菌，该检测方法的检测结果与食品变质产气存在良好的相关性，为改善生产工艺、控制产品品质和提高产品质量提供了依据；该方法具有检测高效、简单、成本低、易推广等优点，适合生产工业化应用。该方法主要是通过对料酒产品变质产气，对产气难培养菌进行监控，但未对非产气菌，但是产酸的难培养菌进行监控。

专利号CN201410579443.0《用于检测食醋中产气、产膜菌的培养基及检测方法》公开了一种用于检测食醋中产气、产膜菌的培养基及检测方法，培养基是以土豆、葡萄糖、酵母膏、牛肉膏和硫酸铵等为原料制成的液体培养基，检测方法以装有杜氏小管的试管接种待测食醋样品后培养72小时进行观察，若试管中出现气泡、菌膜时，说明食醋不合格不能直接出厂。该方法主要确定食醋中产气、产膜菌的培养基及检测方法，通过试管中出现气泡、菌膜表象确定醋产品是否变质，但是未公开对非产气菌，但是产酸的难培养菌进行监控。

可见，现有的各种培养基组分的差异明显，均无法实现同时对所有难培养菌进行培养和快速检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种用于检测调味品中难培养菌的培养基和检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于检测调味品中难培养菌的培养基，包含MRS肉汤0.040～0.070g/mL、蔗糖0.005～0.030g/mL、复配生长因子0.0005～0.0020g/mL和待测调味品稀释液200～500mL/L；

所述复配生长因子包含以下重量份的组分：L-半胱氨酸30～70份、FeSO₄·7H₂O 30～70份和吐温-80 0～30份；

所述待测调味品稀释液中待测调味品的质量浓度为40～70％。

部分微生物难于通过常规培养基培养，常规方法无法检测，不能提前有效地杀灭微生物，货架期过程中出现浑浊、产气、不产气但产酸，并且具有难闻的气味，严重影响产品质量。本发明所述培养基中添加待测调味品稀释液和复配生长因子，为变质菌的生长提供适宜的微量元素和生长因子，缩短了变质菌的培养时间，提高了检测效率。

优选地，所述培养基的pH＝3.5～4.2。

优选地，所述待测调味品为酱油、调味料酒、食醋或复合调味酱(包括番茄沙司、排骨酱以及蒜蓉辣酱等)。本发明所述培养基的检测范围广，可以酱油、调味料酒或复合调味酱等调味品中产气、发黏拉丝和总酸升高等变质菌的检测，监测更全面。

优选地，所述培养基的制备方法包括以下步骤：

(1)将MRS肉汤、蔗糖和复配生长因子加入三级水中，煮沸溶解，冷却，得料A；

(2)将过滤后的待测调味品稀释液加入料A中，混合均匀，得料B；

(3)调节pH至3.5～4.2，灭菌，得所述培养基。

本发明的目的还在于提供一种调味品的质量检测方法，所述调味品的质量检测方法采用上述所述用于检测调味品中难培养菌的培养基进行检测。

采用本发明所述培养基对调味品进行检测，检测时间短，对于有难检测菌，最短2天可以检出；对于无难检测菌，7天若无变质菌特征即可确定。比传统MRS乳酸菌培养基检测时间大大缩短，可以及时有效发现质量不合格的产品。

优选地，所述调味品的质量检测方法包括以下步骤：

(a)将待测调味品接种至所述培养基中，在29～31℃下培养2～7天，每个样品设置多组平行；

(b)在培养期内，出现(i)～(iii)中的至少一种情况时，所述待测调味品判定为质量不合格；否则待测调味品判定为合格；

(i)至少有1个样品观察到气泡；

(ii)至少有1个样品观察到发粘、拉丝现象；

(iii)至少有1个样品出现X₁-X₀≥0.20g/100mL，X₁表示培养基在培养期的总酸，X₀为培养基的初始总酸。

在调味品中生长的变质菌，是引起产气、发黏拉丝或总酸升高等特征的一类微生物的总称，本发明所述检测方法可同时培养和检测引起产气、发黏拉丝和总酸升高等变质现象的变质菌，提高了检测的准确性。对于非产气难培养菌，通过总酸升幅、返浑、拉丝发粘等全方位确定调味产品是否存在变质，提前把控质量，确保后续产品质量。

优选地，步骤(a)中，将1mL待测调味品接种至培养基中，所述培养基装在杜氏小管中。

优选地，所述杜氏小管中的培养基中无气泡。表示选择杜氏小管中的培养基中无气泡来接种待测调味品，以减少后续培养期观察气泡的误差。

本发明的目的还在于提供上述所述用于检测调味品中难培养菌的培养基在检测调味品中难培养菌的用途。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种用于检测调味品中难培养菌的培养基，本发明所述培养基中添加调味品稀释液和复配生长因子，为变质菌的生长提供适宜的微量元素和生长因子，缩短了变质菌的培养时间，提高了检测效率。本发明还提供了一种调味品的质量检测方法，采用本发明所述培养基对调味品进行检测，检测时间短，对于有难检测菌，最短2天可以检出；对于无难检测菌，7天若无变质菌特征即可确定。比传统MRS乳酸菌培养基检测时间大大缩短，可以及时有效发现质量不合格的产品。本发明还提供了所述用于检测调味品中难培养菌的培养基在检测调味品中难培养菌的用途。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例中，待测调味品为料酒。

1、培养基配制

(1)本实施例所述培养基包括：MRS肉汤55g、蔗糖20g、复配生长因子1.1g、待测调味品稀释液350mL和三级水650mL；其中，复配生长因子包含以下重量份的组分：L-半胱氨酸55份、FeSO₄·7H₂O 40份和吐温-80 5份；本实施例中待测调味品稀释液中待测调味品的质量浓度为50％。

(2)培养基的配制方法包括以下步骤：

(a)将MRS肉汤、蔗糖和复配生长因子加入三级水中，煮沸溶解，冷却，得料A；

(b)将经滤纸过滤后的待测调味品稀释液加入料A中，搅拌混合均匀，得料B；

(c)使用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至4.1，分装到有杜氏小导管的试管中，每管10mL，在115℃下灭菌15min，得所述培养基。

2、接种培养

(1)将待测调味品样品在无菌操作，样品混匀后，用1mL移液器吸取1mL待测调味品于培养基中，于29℃培养，每个样品设4次平行。

(2)取1支接种后的发酵管，测定初始总酸(以乙酸计)4.69g/100mL。

3、结果判断见表1。

表1

注：表中“+”表示阳性。

根据以上结果可知，有产气、拉丝发粘的变质菌，该待测调味品为不合格产品。

实施例2

本实施例中，待测调味品为番茄沙司。

1、培养基配制

(1)本实施例所述培养基包括：MRS肉汤55g、蔗糖20g、复配生长因子1.1g、待测调味品稀释液300mL和三级水700mL；其中，复配生长因子包含以下重量份的组分：L-半胱氨酸50份、FeSO₄·7H₂O 45份和吐温-80 5份。本实施例中待测调味品稀释液中待测调味品的质量浓度为70％。

(2)培养基的配制方法包括以下步骤：

(a)将MRS肉汤、蔗糖和复配生长因子加入三级水中，煮沸溶解，冷却，得料A；

(b)将经滤纸过滤后的待测调味品稀释液加入料A中，搅拌混合均匀，得料B；

(c)使用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至4.0，分装到有杜氏小导管的试管中，每管10mL，115℃，灭菌15min，得所述培养基。

2、接种培养

(1)将待检测样品在无菌操作，样品混匀后，用1mL移液器吸取1mL样品待测样品于培养基中，于29℃培养，每个样品设4次平行。

(2)取1支接种后的发酵管，测定初始总酸(以乙酸计)1.22g/100mL。

3、结果判断见表2。

表2

注：表中“+”表示阳性。

根据以上结果可知，有产气、拉丝发粘的变质菌，结论该待测调味品为不合格产品。

实施例3

本实施例中，待测调味品为食醋。

1、培养基配制

(1)本实施例所述培养基包括：MRS肉汤60g、蔗糖20g、复配生长因子1.5g、待测调味品稀释液400mL和三级水600mL；其中，复配生长因子按照质量份包括：L-半胱氨酸60份、FeSO₄·7H₂O 30份和吐温-80 10份。本实施例中待测调味品稀释液中待测调味品的质量浓度为40％。

(2)培养基的配制方法包括以下步骤：

(a)将MRS肉汤、蔗糖和复配生长因子加入三级水中，煮沸溶解，冷却，得料A；

(b)将经滤纸过滤后的待测调味品稀释液加入料A中，搅拌混合均匀，得料B；

(c)使用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至3.9，分装到有杜氏小导管的试管中，每管10mL，115℃，灭菌15min，得所述培养基。

2、接种培养

(1)将待测调味品样品在无菌操作，样品混匀后，用1mL移液器吸取1mL样品待测样品于培养基中，于29℃培养，每个样品设4次平行。

(2)取1支接种后的发酵管，测定初始总酸(以乙酸计)4.68g/100mL。

3、结果判断见表3。

表3

注：表中“+”表示阳性；“-”表示阴性。

根据以上结果可知，有提升产品中酸浓度的变质菌，该待测调味品为不合格产品。

对比例1

本对比例中，待测调味品为与实施例3相同批次的食醋。

1、培养基配制

(1)本对比例所述培养基包括：MRS肉汤60g、蔗糖20g、待测调味品稀释液400mL和三级水600mL；本对比例中待测调味品稀释液中待测调味品的质量浓度为40％。

(2)培养基的配制方法包括以下步骤：

(a)将MRS肉汤和蔗糖加入三级水中，煮沸溶解，冷却，得料A；

(b)将经滤纸过滤后的待测调味品稀释液加入料A中，搅拌混合均匀，得料B；

(c)使用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至3.9，分装到有杜氏小导管的试管中，每管10mL，115℃，灭菌15min，得所述培养基。

2、接种培养

(1)将待检测样品在无菌操作，样品混匀后，用1mL移液器吸取1mL样品待测样品于培养基中，于29℃培养，每个样品设3次平行。

(2)取1支接种后的发酵管，测定初始总酸(以乙酸计)4.68g/100mL。

3、结果判断见表4。

表4

注：表中“-”表示阴性。

根据以上结果可知，对比例1中由于未添加复配生长因子，无法准确检出产品中的难培养菌；实施例3中以本发明的培养基，准确快速检出了难培养菌，有效剔除了不合格产品。

实施例4

本实施例中，待测调味品为酱油。

1、培养基配制

(1)本实施例所述培养基包括：MRS肉汤55g、蔗糖20g、复配生长因子1.1g、待测调味品稀释液300mL和三级水700mL；其中，复配生长因子包含以下重量份的组分：L-半胱氨酸50份、FeSO₄·7H₂O 45份和吐温-80 5份。待测调味品稀释液中酱油的质量浓度为50％。

(2)培养基的配制方法包括以下步骤：

(a)将MRS肉汤、蔗糖和复配生长因子加入三级水中，煮沸溶解，冷却，得料A；

(b)将经滤纸过滤后的待测调味品稀释液加入料A中，搅拌混合均匀，得料B；

(c)使用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至4.0，分装到有杜氏小导管的试管中，每管10mL，115℃，灭菌15min，得所述培养基。

2、接种培养

(1)将待测调味品样品在无菌操作，样品混匀后，用1mL移液器吸取1mL样品待测样品于培养基中，于30℃培养，每个样品设3次平行。

(2)取1支接种后的发酵管，测定初始总酸(样品1X₀为0.39g/100mL、样品2X₀为0.34g/100mL)。

3、结果判断见表5。

表5

注：表中“+”表示阳性。

对比例2

本对比例中，待测调味品为与实施例4相同批次的酱油。

1、培养基配制

(1)本对比例所述培养基包括：葡萄糖20g、麦芽糖15g、蛋白胨10g、酵母膏粉4g、牛肉膏粉10g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g、吐温-801g、可溶性淀粉1g、七水合硫酸亚铁0.5g、待测调味品稀释液100mL和蒸馏水900mL，调节pH值为5.0，分装10mL于无菌试管中，115℃，15min灭菌。待测调味品稀释液中酱油的质量浓度为50％。

2、接种培养

待测调味品样品摇匀后，每个样品接种4管，每管分别接种1mL。随机取其中2管测定总酸(以乳酸计)，取其平均值作为总酸初始值X₀(样品1为0.39g/100mL、样品2为0.34g/100mL)每个稀释度剩余的2管于30±1℃培养。培养3天后，对剩余2管测定总酸(以乳酸计)，取其平均值作为培养后总酸值X₁。

3、结果判定见表6。

表6

注：表中“+”表示阳性；“-”表示阴性。

从实施例4和对比例2的检测结果可以看出，虽然两种检测方法得到的结论都是不合格，实施例4能额外检测出拉丝发粘的变质菌。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。