阅读说明：本技术 双吲哚马来酰亚胺类pkc抑制剂在制备治疗心肌炎心律失常药物中的应用 (Application of bisindolylmaleimide PKC inhibitor in preparation of medicine for treating myocarditis arrhythmia ) 是由 钟春莲 赵欢 戚智 卢余盛 贾力 于 2020-05-25 设计创作，主要内容包括：本发明属医药领域,公开了双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂在制备预防或治疗心肌炎心律失常药物中的应用。本发明所述的双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂具有高效低毒性,其作用机制为通过抑制心电图QRS波群的延长达到抗心律失常的作用。其在离体心脏中,显示了良好的抑制QRS波群延长的药物活性；动物实验显示,其对心肌炎心律失常具有显著的治疗效果。本发明首次提出PKC抑制剂可用于安全有效地治疗心肌炎心律失常,可开发为治疗QRS波群延长型心律失常的临床药物。(The invention belongs to the field of medicines, and discloses application of a bisindolylmaleimide PKC inhibitor in preparation of a medicine for preventing or treating myocarditis arrhythmia. The bisindolylmaleimide PKC inhibitor has high efficiency and low toxicity, and the action mechanism of the inhibitor is that the inhibitor achieves the effect of resisting arrhythmia by inhibiting the prolongation of QRS complex of electrocardiogram. It shows good pharmaceutical activity for inhibiting QRS complex prolongation in isolated heart; animal experiments show that the traditional Chinese medicine composition has a remarkable treatment effect on myocarditis arrhythmia. The invention provides a PKC inhibitor for the first time, which can be used for safely and effectively treating myocarditis arrhythmia and can be developed into a clinical medicament for treating QRS complex-prolonged arrhythmia.)

双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂在制备治疗心肌炎心律失常 药物中的应用

技术领域

本发明属于双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂应用技术领域，具体涉及双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂在制备治疗心肌炎心律失常药物中的应用。

背景技术

心律失常是电信号在心肌细胞传导异常的外在表现，恶性的心律失常可诱发患者急性心脏猝死，严重危害患者的身体健康。近年来，随着生活方式的改变和工作压力的增加，中青年猝死率逐年上升，病理活检显示2-42％患者死于心肌炎诱发的心脏猝死，心肌炎性心律失常已成为患者猝死的主要因素。而目前对于心肌炎的治疗主要以改善症状为主，没有有效的治疗药物，如何及时地预防心律失常诱发的心脏猝死，成为心肌炎治疗亟需解决的关键问题。

异常的QRS波群明显增加室性心律失常和心脏猝死的风险。QRS波群是心电图中最宽的波群，反应电信号在心室肌组织中的传导，而延长的QRS波群(≥120ms)反应心室内电信号的不同步性。因此QRS波群的延长及形态的改变可以预测心脏目前的状态和心律失常的情况。大量研究证实延长的QRS波群与心肌病、左心室功能紊乱、较差的预后及较高的死亡率的密切相关。在室性心动过速的患者中，大约72％患者的QRS波群明显延长。QRS波群每延长1ms，患者发生持续性室性心动过速的风险就增加2.4％；QRS波群每延长10ms,室性心律失常的患者死亡率就增加10％。不仅如此，QRS波群延长的患者的预后更差，其复发室性心律失常的风险更高。在心衰患者中，QRS波群延长和QRS波群正常的患者死亡率分别为51％和34％。延长的QRS波群已经成为预测缺血性心肌病、心肌梗死和心律失常患者总体死亡率的一个指标。此外，有研究证实，延长的QRS波群与心脏猝死密切相关。在猝死的冠心病患者中，QRS波群明显延长，其已经成为冠心病患者猝死的独立预测因素。在心肌炎患者和动物模型中存在着严重QRS波群延长的现象，延长的QRS波群明显增加心肌炎患者猝死的风险。

现有技术抗心律失常药物包括五类，第一类为膜抑制剂，有膜稳定作用，阻滞钠通道。抑制0相去极化速率，并延缓极化过程；第二类为β肾上腺素受体阻滞剂，其间接作用为β-受体阻断作用，而直接作用细胞膜效应，具有与第一类药物相似的作用机理；第三类为延长动作电位间期的药物，可能通过肾上腺素能效应起作用，具有延长动作电位间期和有效不应期的作用；第四类为钙通道阻滞剂，通过阻断钙离子内流而对慢反应心肌电活动超抑制作用；第五类为洋地黄类药物，主要通过兴奋迷走神经起作用。

蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)属于丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族，调节广泛的信号转导通路。PKC过度的激活与心肌肥大、扩张性心肌病、缺血再灌注损伤、心肌纤维化、心肌梗死、心衰等多种心脏疾病密切相关。研究表明，PKC具有促心律失常的作用。膜片钳单通道记录显示，在原代心肌细胞中，PKCδ的激活明显抑制Na⁺通道的传导性；在内皮细胞和成纤维细胞，单通道记录显示，激活PKC增加了Cx43 368位的磷酸化，改变了Cx43缝隙连接通道主频率的传导性。PKC作为胞内信号转导通路中间的分子，不仅为心脏疾病药物的研制和发展提供了一个很好的作用靶点，而且PKCδ的抑制剂作为治疗急性心肌梗死的药物已完成了II期临床试验，且取得较好的结果。

目前临床应用的抗心律失常药物主要以β受体阻滞剂为主，主要通过对心肌细胞多种离子通道的阻断，发挥抗心律失常的作用，却不能从本质上抑制心律失常。而针对长QRS波群型心律失常，现有技术没有有效的治疗药物。因此，亟需开发一种针对QRS波群延长型心律失常的安全有效药物。

发明内容

本发明的目的在于提供双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂应用于制备治疗心肌炎心律失常药物，恢复心肌细胞间Cx43缝隙连接通道的功能，从本质上缓解QRS波群的延长，达到抗心律失常的作用。

本发明的具体内容如下：

双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂，已知作用为抑制T细胞激活、抗炎、抗肿瘤、缓解心衰等。本发明提供了其在在制备抗心肌炎心律失常药物中的应用。且本发明人通过构建心肌炎动物模型，验证双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂在心肌炎心律失常中的作用，且验证了双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂可作为一种安全有效地治疗心肌炎心律失常的药物。

所述双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂化学名为：

3-[8-[(dimethylamino)methyl]-6,7,8,9-tetrahydropyrido[1,2-a]indol-10-yl]-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione，

分子式为C28H28N4O2，

化学结构如下：

进一步的，所述双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂用于制备抑制心电图QRS波群延长药物中的应用。

以及所述双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂用于制备由PKC激活导致的QRS波群延长和心律失常的药物中的应用。

申请人对PKC研究发现，激活PKC可以明显促进心电图QRS波群的延长，诱发心律失常(附图2)。且首次在离体心脏大鼠验证激活PKC可明显引起心电图QRS波群的延长，进一步证明PKC在心律失常中的作用。本发明证明了激活PKC可引起心电图QRS波群的延长，从而引发心律失常，还为PKC抑制剂作为一种潜在的可抑制心肌炎心律失常的药物提供有力的实验证据。

进一步的，所述双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂用于制备抑制缝隙连接蛋白43形态和分布异常的药物中的应用。

以及所述双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂用于制备抑制缝隙连接蛋白43缝隙连接通道功能异常的药物中的应用。

心脏内电活动的形成主要依靠各种离子通道，调节蛋白及心肌细胞间的缝隙连接通道。因此，本发明检测了双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂对心肌细胞间缝隙连接蛋白Cx43的影响。实验结果显示：EAM组大鼠心肌组织Cx43的形态由正常的致密状态变为弥散状，分布由闰盘处向细胞两侧转移；而治疗组大鼠心肌组织Cx43的形态和分布逐渐恢复正常状态(附图3)。以上结果表明双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂可以改善心肌炎引起的Cx43缝隙连接通道的功能，从而缓解QRS波群的延长。

进一步的，所述药物形式为片剂、胶囊、脂质体、颗粒剂、注射剂及口服剂即其他药学上接受的各种药物形式。

本发明的优点和有益效果：

申请人的研究结果提示，双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂通过心肌炎引发的抑制缝隙连接蛋白Cx43形态和分布异常，恢复Cx43缝隙连接通道的功能，促进心肌细胞间电信号的传导，从而达到抑制心电图QRS波群的延长，发挥抗心律失常的作用。此外，申请人通过对PKC与心律失常的研究，进一步证实了PKC具有促心律失常的作用，从反面证实了PKC抑制剂具有抗心律失常的作用。

目前临床上使用的抗心律失常药物主要以各种离子通道的阻断剂为主。而本发明中双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂主要功能为：通过恢复Cx43缝隙连接通道的功能缓解QRS波群的延长，发挥抗心律失常的作用。本发明所述化合物可从本质上抑制心律失常，与以往阻断离子通道的表面作用不同，有望实现从新的视野寻找抗心律失常药物。

附图说明

图1为双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂对EAM大鼠QRS波群延长的抑制作用实验结果图。

图2为激活PKC对正常大鼠离体心脏QRS波群的影响。

图3为双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂对EAM大鼠Cx43形态和分布异常的抑制作用示意图。

具体实施方式

本发明所述双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂，已知作用为抑制T细胞激活、抗炎、抗肿瘤、缓解心衰等。本发明提供了其在心肌炎心律失常中的新应用，作为PKC抑制剂应用于制备治疗心肌炎心律失常药物，可抑制心电图QRS波群延长，及抑制缝隙连接蛋白43形态和分布异常，以下通过具体实例对本发明进行详细说明。以下实例用来说明本发明，但不限制本发明的实施范围。

实施例1双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂对EAM大鼠心电图QRS波群延长的抑制作用。

心肌炎动物模型(EAM)的建立：首先制作用于大鼠免疫的猪心肌肌球蛋白。取0.3mol/L KCL溶液溶解纯化的猪心肌肌球蛋白，终浓度为10mg/mL。另取2只玻璃注射器，分别吸取等量的肌球蛋白和完全弗氏佐剂(含结核分枝杆菌10mg/mL)，通过三通管，连接2支注射器，来回吹打混匀200次左右直至呈乳糜状，滴入水中呈不散开状态表明抗原已制备好。将含有肌球蛋白和结核杆菌的乳浊液注入大鼠足下脚垫各100μL，每只大鼠给予肌球蛋白的量为1mg。在EAM 2周时采用II导联方式检测大鼠的心电图；同时治疗组大鼠给予腹腔注射双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂(1mg/kg体重)，隔2天注射1次，共注射3次，并实时检测大鼠的心电图变化，于EAM 3周时将所有大鼠处死。记录实验结果，得图1，图1中A为不同组大鼠心电图变化；图1中B为HE染色显示双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂对大鼠肝脏、脾脏、肾脏、肺部等主要器官毒性作用。***为p<0.001vs对照组。

实验结果显示，在自身免疫性心肌炎(EAM)的大鼠模型中，EAM 2周时大鼠心电图QRS波群明显延长，此时给予双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂治疗，一周后检测QRS波群情况。相比于EAM组，治疗组大鼠QRS波群显著缩短(18.5±0.5ms vs 22.4±0.9ms,p<0.05)，QRS振幅明显增大(636.0±65.1μV vs 384.7±57.0μV，p<0.05)(附图1)。且对治疗组大鼠肝脏、脾脏、肺等主要器官进行病理染色，如附图1所示，双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂没有不良毒副作用。上述结果表明，双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂可作为一种安全有效地治疗心肌炎心律失常的药物。

心肌炎常伴随着不同程度的心律失常，有效地预防和治疗心肌炎性心律失常可及时抑制患者突发的心脏猝死。本发明人通过构建心肌炎动物模型，验证双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂在心肌炎心律失常中的作用。

实施例2 PKC激活剂对离体心脏QRS波群的影响

取正常大鼠，经小动物麻醉机麻醉后，迅速开胸，剪开心包，取出心脏置于4℃修正洛氏液中，使心脏停跳，挤净血液，修剪心脏后主动脉插管给予Langendorff灌流。通过记录电极连接到生物信号采集与处理系统，记录心电信号。心脏复跳后在正常洛氏液中稳定20min后给予50μM PMA灌流，对照组给予修正洛氏液。在灌流过程中维持灌流液恒温37℃，同时通入含有5％CO2的氧气。记录心电信号，观察QRS波群的变化，记录结果为图3所示，图3中A为激活PKC不同时间后心电图的变化；B为心电图QRS波群参数统计。*为p<0.05vs对照组；**为p<0.01vs对照组。

如图2实验结果显示：给予50nM PKC激活剂(PMA)灌注30min后，QRS波群由14.8±0.8ms延长至22.4±1.9ms(p<0.01)；给予正常KH缓冲液灌注30min后，QRS波群几乎没有变化(15.3±1.9msvs 15.8±1.7ms)。本发明对PKC与心律失常的研究，不仅证明了激活PKC可引起心电图QRS波群的延长，从而引发心律失常，还为PKC抑制剂作为一种潜在的可抑制心肌炎心律失常的药物提供有力的实验证据。

实施例3双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂对EAM引起的Cx43缝隙连接蛋白形态和分布异常的抑制作用。

实验1中大鼠处死后，心脏置于4％的福尔马林溶液中，后进行脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡后，用3％H₂O₂孵育组织10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，将组织置于0.01M枸橼酸缓冲液(PH 6.0)中煮沸15min，进行抗原修复。PBS冲洗后，滴加10％山羊血清室温封闭30min，甩去多余液体，勿洗。滴加抗Cx43的抗体，4℃过夜或室温1h。滴加HRP标记的二抗，室温孵育1h。在显微镜下控制DAB显色程度，呈棕色即为阳性(显色剂的配置：在1ml纯水中加一滴A液混匀，再加一滴B液混匀，最后加一滴C液混匀)。流水冲洗5min，终止反应。苏木素复染后进行脱水封片。在显微镜下观察得图2所示结果，图2中对照组中箭头表示正常Cx43的分布和形态；EAM组中箭头表示弥散状、分布于细胞两侧的Cx43；EAM+化合物组中箭头代表部分恢复Cx43的形态和分布。

如图3所示，EAM大鼠Cx43的形态由正常的致密变为弥散，分布由闰盘处向细胞两侧转移，而双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂治疗组大鼠明显改善Cx43的异常形态和分布。结果表明双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂可以改善心肌炎引起的Cx43缝隙连接通道的功能，从而缓解QRS波群的延长，验证了双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂对EAM引起的Cx43缝隙连接蛋白形态和分布异常的抑制作用。

以上实验拓展了双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂的应用领域，验证了在预防和抑制心肌炎心律失常方面的应用。双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂可作为单一药物也可与其它药物联合使用，以全面和综合性地抑制引发心律失常的各个因素，以求达到全面有效抑制心律失常的最佳效果。本药物作为单一药物使用时的剂量约为每天0.001mg/kg至500mg/kg体重。

本发明所述双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂可用于预防和治疗心肌炎性心律失常，其主要作用为恢复心肌细胞间Cx43缝隙连接通道的功能，从本质上缓解QRS波群的延长，达到抗心律失常的作用，双吲哚马来酰亚胺类PKC抑制剂可以有效的抑制心肌炎诱发的QRS波群延长，首次提出PKC抑制剂可用于安全有效地治疗心肌炎心律失常，可开发为治疗QRS波群延长型心律失常的临床药物。