Trem-1在监测血吸虫病肝纤维化发展过程方面的应用
阅读说明：本技术 Trem-1在监测血吸虫病肝纤维化发展过程方面的应用 (Application of TREM-1 in monitoring schistosomiasis liver fibrosis development process ) 是由 朱丹丹 段义农 陈金铃 高文曦 段练 沈培 黄爱龙 于 2020-06-17 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种TREM-1在监测血吸虫病肝纤维化发展过程方面的应用,其特征在于,采用动物模型动态监测TREM-1在血吸虫病肝脏中的表达方法。本发明还提供TREM-1在制备监测血吸虫病药物方面的应用。所述药物为药物试剂盒,所述药物试剂盒用于监测TREM-1的表达。本发明通过检测感染血吸虫的不同时间时,检测TREM-1在血吸虫病肝脏中的表达,从而监测肝纤维化发展过程,为监测肝纤维化发展过程,提供了新的监测靶点,从而提供一种新的药物试剂盒。(The invention provides an application of TREM-1 in monitoring schistosomiasis liver fibrosis development process, which is characterized in that an animal model is adopted to dynamically monitor the expression method of TREM-1 in schistosomiasis liver. The invention also provides an application of TREM-1 in preparing drugs for monitoring schistosomiasis. The drug is a drug kit used for monitoring the expression of TREM-1. The invention detects the expression of TREM-1 in the liver of schistosomiasis by detecting different time of infecting schistosomiasis so as to monitor the development process of hepatic fibrosis, and provides a new monitoring target for monitoring the development process of hepatic fibrosis, thereby providing a new medicine kit.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及TREM-1在监测血吸虫病肝纤维化发展过程方面的应用。
背景技术
髓系细胞触发受体（triggering receptor expressed on myeloid cells,TREM）是一类隶属于免疫球蛋白超家族的细胞表面受体，主要包括TREM-1和TREM-2等，在炎症和免疫调节中发挥重要作用。研究表明，TREM-1与巨噬细胞的M1型极化存在较大的相关性，TREM-1的缺失能够促进 M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化。在曼氏血吸虫病模型中，曼氏血吸虫感染早期脾脏巨噬细胞中 TREM-1表达上调，与 M1极化趋势相一致。然而，曼氏血吸虫病纤维化模型肝脏组织中TREM-1的表达未见明显变化。日本血吸虫与曼氏血吸虫虽然同属于裂体属，但其生物学特性及引起虫卵肉芽肿、肝纤维化的机制不尽完全相同。TREM-1在血吸虫病肝纤维化进程中的表达及应用未见报道。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在问题或不足，本发明提供TREM-1在监测血吸虫病肝纤维化发展过程方面的应用。
为实现上述发明目的，本发明的实施例提供一种TREM-1在监测血吸虫病肝纤维化发展过程方面的应用，其特征在于，采用动物模型动态监测TREM-1在血吸虫病肝脏中的表达方法。
进一步的，一种TREM-1在监测血吸虫病肝纤维化发展过程方面的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、建立小鼠动物模型
（1-1）动物分组：选取30只的8周龄雌性C57BL/6小鼠，饲养于12h昼夜循环，且湿度为55%的洁净空间内；随机选取6只小鼠作为健康对照组，其余分配为血吸虫病组；
（1-2）动物模型制备
取血吸虫病组的小鼠，剃除小鼠腹部毛暴露出皮肤，固定于小鼠架，从感染性钉螺中溢出日本血吸虫尾蚴，取血吸虫尾蚴挑取于盖玻片上，并紧贴小鼠腹部皮肤保持15min，使尾蚴充分进入小鼠皮肤感染小鼠；
（2）RNA抽提
（2-1）分别取步骤（1-2）所感染血吸虫后0周、3周、6周、9周、12周小鼠肝脏组织，按 50-100mg组织中加入1ml Trizol 的比例加入 Trizol，置于匀浆器中，冰上研磨后转至EP管内；随后按照0.2ml氯仿/ml Trizol 加入氯仿，轻轻混匀后室温放置10min；
（2-2）4℃ 12000rpm 离心 15min；
（2-3）小心吸取上层水相0.5ml，按照1:1体积比加入异丙醇，轻轻混匀后室温放置10min；
（2-4）4℃ 12000rpm 离心 20min，去除上清；
（2-5）加入1ml预冷的75%乙醇，震荡混匀4℃ 12,000rpm 离心5min；
（2-6）弃上清，静置干燥RNA，用DEPC水溶解沉淀；
（3）RT-qPCR检测
将步骤（2）所获得的RNA用Thermo生产的REVERTAID 1ST CDNA SYNTH KIT 逆转录为cDNA；
获得的cDNA用TAKARA生成的TB Green™ Premix Ex Taq™ II 试剂盒进行实时定量PCR检测TREM-1的表达。
进一步的，所述步骤（3）中，定量PCR检测中，所用引物序列如下：
mTREM-1 F: CTGCTGTGCGTGTTCTTTGTCTC；
mTREM-1 R: AGGGTTCCTTCCCGTCTGGTA；
mGAPDH F: TGGAAAGCTGTGGCGTGAT；
mGAPDH R: TGCTTCACCACCTTCTTGAT。
本发明的实施例还提供TREM-1在制备监测血吸虫病药物方面的应用。
进一步的，所述药物为药物试剂盒，所述药物试剂盒用于监测TREM-1的表达。
进一步的，所述药物试剂盒包括EP管、氯仿、异丙醇、75%乙醇、定量PCR检测所用引物mTREM-1 F、mTREM-1 R、mGAPDH F、mGAPDH R。
其中，定量PCR检测中所用引物的序列如下：
mTREM-1 F: CTGCTGTGCGTGTTCTTTGTCTC；
mTREM-1 R: AGGGTTCCTTCCCGTCTGGTA；
mGAPDH F: TGGAAAGCTGTGGCGTGAT；
mGAPDH R: TGCTTCACCACCTTCTTGAT。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明通过检测感染血吸虫的不同时间时，检测TREM-1在血吸虫病肝脏中的表达，从而监测肝纤维化发展过程，为监测肝纤维化发展过程，提供了新的监测靶点，从而提供一种新的药物试剂盒。本发明的实施例通过日本血吸虫病小鼠肝脏中TREM-1的检测，结果表明，日本血吸虫病小鼠肝脏中TREM-1的表达上升，感染日本血吸虫12周后，小鼠肝脏组织中TREM-1表达有所下降，但仍维持在较高水平。
附图说明
图1为本发明的实施例1中日本血吸虫病肝脏组织中0到12周TREM-1表达变化图。
图2为本发明的实施例1中TREM-1定量PCR溶解曲线图。
图3为本发明的实施例1中内参GAPDH定量PCR溶解曲线图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
实施例1 动态监测血吸虫病肝纤维化发展过程
一种TREM-1在监测血吸虫病肝纤维化发展过程方面的应用，包括以下步骤：
（1）、建立小鼠动物模型
（1-1）动物分组：选取30只的8周龄雌性C57BL/6小鼠，饲养于12h昼夜循环，且湿度为55%的洁净空间内；随机选取6只小鼠作为健康对照组，其余分配为血吸虫病组。
（1-2）动物模型制备
取血吸虫病组的小鼠，剃除小鼠腹部毛暴露出皮肤，固定于小鼠架，从感染性钉螺中溢出日本血吸虫尾蚴，取血吸虫尾蚴 （15±2）挑取于盖玻片上，并紧贴小鼠腹部皮肤保持15min，使尾蚴充分进入小鼠皮肤感染小鼠。
（2）RNA抽提
（2-1）分别取步骤（1-2）所感染血吸虫后0周、3周、6周、9周、12周小鼠肝脏组织，按 50-100mg组织中加入1ml Trizol 的比例加入 Trizol，置于匀浆器中，冰上研磨后转至EP管内；随后按照0.2ml氯仿/ml Trizol 加入氯仿，轻轻混匀后室温放置10min；
（2-2）4℃ 12000rpm 离心 15min；
（2-3）小心吸取上层水相0.5ml，按照1:1体积比加入异丙醇，轻轻混匀后室温放置10min；
（2-4）4℃ 12000rpm 离心 20min，去除上清；
（2-5）加入1ml预冷的75%乙醇，震荡混匀4℃ 12,000rpm 离心5min；
（2-6）弃上清，静置干燥RNA，用DEPC水溶解沉淀；
（3）RT-qPCR检测
将步骤（2）所获得的RNA用Thermo生产的REVERTAID 1ST CDNA SYNTH KIT (货号K1622)逆转录为cDNA。获得的cDNA用TAKARA生成的TB Green™ Premix Ex Taq™ II (TliRNaseH Plus) 试剂盒(货号RR820B)进行实时定量PCR检测。
定量PCR检测，引物序列如下(m代表小鼠，F代表上游引物，R代表下游引物)：
mTREM-1 F: CTGCTGTGCGTGTTCTTTGTCTC；
mTREM-1 R: AGGGTTCCTTCCCGTCTGGTA；
mGAPDH F: TGGAAAGCTGTGGCGTGAT；
mGAPDH R: TGCTTCACCACCTTCTTGAT。
对TREM-1定量PCR溶解曲线和内参GAPDH定量PCR溶解曲线进行溶解曲线分析，如图2和图3所示，可以看出，TREM-1定量PCR溶解曲线和内参GAPDH定量PCR溶解曲线均呈现单峰，引物特异性较好，实验结果有效。
日本血吸虫病小鼠肝脏中TREM-1的检测，结果如图1所示，其表明，日本血吸虫病小鼠0周、3周、6周、9周小鼠肝脏组织中TREM-1的表达逐渐升高，感染日本血吸虫12周后，小鼠肝脏组织中TREM-1表达有所下降，但仍维持在较高水平。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。