阅读说明：本技术 烟酸在制备慢性乙型肝炎治疗药物中的用途 (Application of nicotinic acid in preparing medicine for treating chronic hepatitis B ) 是由 唐松青 吴春凤 李雪 陈欣悦 樊苏萍 朱海珍 于 2019-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种烟酸在制备慢性乙型肝炎治疗和\或辅助治疗药物中的应用。本发明能够显著降低HBV的S抗原、Core蛋白的表达水平,阻止HBV成熟病毒颗粒释放至细胞外,从而使得细胞内HBV的cccDNA、Total DNA和pgRNA等病毒源性的核酸物质发生积累,并促进MAPK信号通路发生活化,增强抗病毒的炎症细胞因子TNF-α产生,最终导致细胞内HBV的S抗原、Core蛋白以及HBV的遗传物质cccDNA发生显著较低,从而达到明显的抗病毒长期慢性感染的作用。(The invention can obviously reduce the expression level of S antigen and Core protein of HBV and prevent mature virus particles of HBV from being released to the outside of cells, thereby accumulating viral nucleic acid substances of cccDNA, Total DNA, pgRNA and the like of HBV in the cells, promoting the activation of MAPK signal channels and enhancing the generation of antiviral inflammatory cytokine TNF- α, finally leading the generation of S antigen, Core protein of HBV in the cells and genetic substance cccDNA of HBV to be obviously lower, and further achieving the obvious effect of resisting long-term chronic infection of virus.)

烟酸在制备慢性乙型肝炎治疗药物中的用途

技术领域

本发明属药品技术领域，具体涉及一种烟酸在制备慢性乙型肝炎治疗药物中的用途。

背景技术

慢性乙型肝炎是由乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)持续慢性感染，而引起的一种重大传染性疾病。作为一种嗜肝DNA病毒，HBV持续慢性感染还能进一步促使慢性乙型肝炎向肝硬化以及肝癌等重大恶性疾病转变。全球目前大约有2.57亿人患有慢性乙型肝炎，其中三分之一以上患者来自于我国。然而，目前医学上对于慢性乙型肝炎的治疗，还只能从功能上达到控制HBV的疗效，而不能从根本上彻底治愈慢性乙型肝炎患者。其中一个主要原因就是无法彻底清除患者体内被HBV感染的肝细胞中的病毒cccDNA，导致一旦停药，患者又有复发的风险。

HBV感染能够诱发急性乙型肝炎和慢性乙型肝炎。90％以上的成年人被HBV感染之后，主要诱发急性感染，患者体内的HBV病毒很快能被机体的免疫系统彻底清除；只有少部分成年人被HBV感染之后，会形成慢性感染，引起慢性乙型肝炎发生。而对于新生儿和婴幼儿，则刚好相反，95％以上的新生儿和婴幼儿，被HBV感染之后，都会导致慢性乙型肝炎的发生。慢性乙型肝炎一旦形成，目前仍无法彻底将其治愈。

有研究表明，在慢性乙型肝炎患者体内，由HBV触发的低水平炎症微环境，可驯化肝脏定居的枯否细胞向M2型巨噬细胞发生转变，进而可介导免疫抑制微环境的形成以及后续HBV特异性CD⁸⁺T细胞耗竭，导致机体免疫系统无法彻底清除HBV病毒。

目前，临床上对慢性乙型肝炎患者的治疗主要采用干扰素和核苷类似物，但这种治疗存在耐药性以及副反应大等问题，且不能达到彻底清除病毒cccDNA这一理想的治疗目标，一旦停药，患者又有再次发病的风险，因此，探索新的治疗药物，具有非常重要的应用价值。

烟酸又称尼克酸，属于维生素B3，是人体必需的13种维生素之一。人体血液中烟酸的含量约为0.1～0.3mg/dl，而在肝组织中烟酸的含量可达到15mg/100g肝组织。食物中的烟酸被消化吸收后，主要被运往肝脏进行利用及代谢。肉类食物中烟酸的含量非常高，而在蔬菜水果中烟酸的含量非常低，特别是在母乳中，烟酸的含量也特别低，只有大约0.15mg/dl。对于婴幼儿，特别是对于新出生婴儿来说，母乳是他/她们获取烟酸的唯一食物来源，母乳中烟酸含量偏低，就会导致婴幼儿对烟酸的摄入不足，就会引起婴幼儿肝组织细胞中烟酸缺乏(而成年人可以通过肉食性食入的摄入来满足体内对烟酸需求)。这种在婴幼儿肝组织细胞中烟酸缺乏的现象与95％以上被HBV感染的婴幼儿容易转变成慢性乙型肝炎密切相关。然而，目前对于能否使用烟酸作为有效药物成分来治疗慢性乙型肝炎仍不清楚。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种烟酸在制备慢性乙型肝炎治疗药物中的应用。

为解决上述问题，本发明的技术方案如下：

本发明保护一种烟酸在制备慢性乙型肝炎治疗和\或辅助治疗药物中的应用。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述烟酸在制备慢性乙型肝炎治疗和\或辅助治疗药物中作为抑制HBV复制的抑制剂。

进一步，所述烟酸在制备慢性乙型肝炎治疗和\或辅助治疗药物中作为抑制HBV出胞释放的抑制剂。

进一步，所述烟酸在制备慢性乙型肝炎治疗和\或辅助治疗药物中作为促进抗病毒炎症细胞因子TNF-α产生的促进剂。

进一步，所述烟酸在制备慢性乙型肝炎治疗和\或辅助治疗药物中作为抑制HBV的S抗原、Core蛋白以及HBV的遗传物质cccDNA产生的抑制剂。

进一步，所述烟酸作为慢性乙型肝炎治疗和\或辅助治疗药物的有效成分之一或唯一有效成分。

相比于其它方法，本发明的优点可体现在如下一个或几个方面：

1.较优的，烟酸可抑制HBV成熟病毒颗粒释放至细胞外；

2.较优的，烟酸可增强HBV持续感染细胞中MAPK信号通路的活化；

3.较优的，烟酸可促进HBV持续感染细胞中具有抗病毒作用的炎症细胞因子TNF-α产生；

4.较优的，烟酸可显著降低HBV持续感染细胞中HBV的S抗原、Core蛋白以及HBV的遗传物质cccDNA，有望实现对慢性乙型肝炎进行根治。

本发明的有益效果是：本发明首次阐明将烟酸作用于HBV持续慢性感染的肝细胞，能够抑制HBV病毒的S抗原以及Core蛋白的产生，阻止HBV成熟病毒颗粒释放至细胞外，从而使得细胞内HBV的cccDNA、Total DNA和pgRNA等病毒源性的核酸物质发生积累，并促进MAPK信号通路发生活化，增强抗病毒的炎症细胞因子TNF-α产生，最终导致细胞内HBV的S抗原、Core蛋白以及HBV的遗传物质cccDNA发生显著降低，从而达到明显的抗病毒作用。

附图说明

图1A.为定量PCR检测HBV持续感染的HLCZ01(HLCZ01-HBV)细胞内HBV的cccDNA相对表达量；

图1B.为定量PCR检测HLCZ01-HBV细胞内HBV pgRNA相对表达量；

图1C.为定量PCR检测HLCZ01-HBV细胞内HBV总DNA相对表达量；

图1D.为定量PCR检测HLCZ01-HBV细胞培养上清中HBV DNA含量；

图1E.为ELISA检测HLCZ01-HBV细胞培养上清中HBV S抗原含量；

图1F.为Western Blot检测HLCZ01-HBV细胞内HBV的S抗原和Core蛋白表达量；

图1G.为定量PCR检测HepG2.2.15细胞内HBV的cccDNA相对表达量；

图1H.为定量PCR检测HepG2.2.15细胞内HBV的pgRNA相对表达量；

图1I.为定量PCR检测HepG2.2.15细胞内HBV总DNA相对表达量；

图1J.为定量PCR检测HepG2.2.15细胞培养上清中HBV的DNA含量；

图1K.为ELISA检测HepG2.2.15细胞培养上清中HBV的S抗原含量；

图2A.为定量PCR检测HLCZ01-HBV细胞内TNF-α的相对表达量；

图2B.为定量PCR检测HepG2.2.15细胞内TNF-α的相对表达量；

图2C.为ELISA检测HLCZ01-HBV细胞培养上清中TNF-α的含量；

图2D.为ELISA检测HepG2.2.15细胞培养上清中TNF-α的含量；

图3A.为Western Blot检测HLCZ01-HBV细胞内P38、ERK1/2的磷酸化水平及其总蛋白水平；

图3B.为Western Blot检测HepG2.2.15细胞内P38、ERK1/2的磷酸化水平及其总蛋白水平；

图4A.为定量PCR检测用烟酸处理不同时间HLCZ01-HBV细胞内HBV的cccDNA相对表达量；

图4B.为定量PCR检测用烟酸处理不同时间HLCZ01-HBV细胞内HBV pgRNA相对表达量；

图4C.为定量PCR检测用烟酸处理不同时间HLCZ01-HBV细胞内HBV总DNA相对表达量；

图4D.为Western Blot检测用烟酸处理不同时间HLCZ01-HBV细胞中S抗原、Core蛋白的表达。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明设计了一种烟酸在制备慢性乙型肝炎治疗和\或辅助治疗药物中的应用的技术方案。

烟酸，又称尼克酸、抗癞皮病因子，分子式：C₆H₅NO₂,化学名称3-吡啶甲酸，属于维生素B3。

烟酸主要存在于动物内脏和肌肉组织中，蔬菜水果以及母乳中含量较低。烟酸作为日常饮食的一部分，没有明显的毒副作用。

发明人发现食物中烟酸含量的高低与慢性乙型肝炎的发生密切相关。例如，发达国家的食物中烟酸含量高于发展中国家，慢性乙型肝炎的发生率在发达国家就比发展中国家低；我国北方大部分省份的食物中烟酸含量高于南方省份，慢性乙型肝炎的发生率在我国北方就比南方低；成年人的食物中烟酸含量显著高于婴幼儿，慢性乙型肝炎的发生率在成年人中就显著低于婴幼儿。

进一步，所述烟酸在制备慢性乙型肝炎治疗和\或辅助治疗药物中作为抑制HBV复制的抑制剂。

进一步，所述烟酸在制备慢性乙型肝炎治疗和\或辅助治疗药物中作为抑制HBV出胞释放的抑制剂。

进一步，所述烟酸在制备慢性乙型肝炎治疗和\或辅助治疗药物中作为促进抗病毒炎症细胞因子TNF-α产生的促进剂。

进一步，所述烟酸在制备慢性乙型肝炎治疗和\或辅助治疗药物中作为抑制HBV的S抗原、Core蛋白以及HBV的遗传物质cccDNA产生的抑制剂。

进一步，所述烟酸作为慢性乙型肝炎治疗和\或辅助治疗药物的有效成分之一或唯一有效成分。

本发明的具体实施方式如下：

本发明设计了烟酸在制备抑制HBV的S抗原和/或Core蛋白以及HBV的遗传物质cccDNA的慢性乙型肝炎治疗药物中的应用。

进一步，所述烟酸在药物中的使用量为5～10mM/L。

发明人设计了研究烟酸对HBV病毒影响的实验方法：

试剂：烟酸购自sigma-Aldrich公司，抗体购自Cell Signaling Technology(CST)公司，病毒DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，RNA提取试剂盒和反转录试剂盒购自南京诺维赞生物科技有限公司，荧光定量PCR试剂购自罗氏生物科技有限公司，ELISA试剂盒购自Biolegend公司。

细胞HBV长期感染的HLCZ01细胞和HepG2.2.15细胞来源于湖南大学液氮冻存保种的细胞，均使用DMEM细胞培养基进行培养。

定量PCR使用的定量PCR引物序列如下：

GAPDH：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’

5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’

HBV DNA：5’-CACCTCTGCCTAATCATC-3’

5’-GGAAAGAAGTCAGAAGGCAA-3’

cccDNA：5’-GTGCCTTCTCATCTGCCGG-3’

5’-GGAAAGAAGTCAGAAGGCAA-3’

pgRNA：5’-CTCAATCTCGGGAATCTCAATGT-3’

5’-TGGATAAAACCTAGCAGGCATAAT-3’

TNF-α：5’-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3’

5’-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG-3’

HBV绝对定量引物：5’-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3’

5’-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3’

ELISA按Biolegend公司TNF-α检测试剂盒说明书进行操作。

选取HBV长期感染的HLCZ01细胞和HepG2.2.15细胞。用不同浓度烟酸分别处理HLCZ01细胞和HepG2.2.15细胞，用定量PCR、ELISA以及Western Blot方法分别检测了细胞内外HBV的cccDNA、Total DNA和pgRNA以及HBV的S抗原、Core蛋白的表达情况。具体实验结果见图1。

实验结果表明在HBV长期感染的HLCZ01细胞和HepG2.2.15细胞中，随着烟酸浓度增加，HBV的cccDNA、Total DNA和pgRNA在烟酸处理三天的时候都发生了一定程度的增加，但细胞内HBV的S抗原、Core蛋白以及细胞外HBV的S抗原都发生了一定程度的降低，细胞外HBV的DNA水平也发生了一定程度的降低。

进而，发明人在HBV长期感染的HLCZ01细胞和HepG2.2.15细胞中，用不同浓度烟酸分别处理HLCZ01细胞和HepG2.2.15细胞，用定量PCR和ELISA方法分别检测了TNF-α产生情况。实验结果见图2。

实验结果表明在HBV长期感染的HLCZ01细胞和HepG2.2.15细胞中，随着烟酸浓度增加，HBV触发的炎症细胞因子TNF-α在转录水平和蛋白水平都发生了比较明显的增高。

发明人通过上述实验研究，发现烟酸可以提高HBV诱发的炎症细胞因子TNF-α产生，从而达到明显的抗病毒作用。

为了进一步分析烟酸增强HBV触发TNF-α产生的原因，我们在HBV长期感染的HLCZ01细胞和HepG2.2.15细胞中，分析了用不同浓度烟酸分别处理HLCZ01细胞和HepG2.2.15细胞，再用Western Blot方法检测了MAPK信号通路中ERK1/2和P38的活化情况。实验结果见图3。

实验结果表明在HBV长期感染的HLCZ01细胞和HepG2.2.15细胞中，随着烟酸浓度增加，ERK1/2和P38的磷酸化水平均有一定程度增强。

为了分析烟酸长期作用对抗HBV感染的影响，我们在HBV长期感染的HLCZ01细胞中，使用终浓度分别为5mM/L和10mM/L的烟酸处理细胞，再用Western Blot方法检测细胞中HBV的S抗原、Core蛋白的表达情况。实验结果见图4。

实验结果表明在HBV长期感染的HLCZ01细胞，烟酸长期处理可以显著降低HBV的S抗原、Core蛋白的表达水平。

依据上述发明人设计的实验方法及实验研究，发明人确定烟酸能够应用于制备抑制HBV的S抗原和/或Core蛋白以及HBV遗传物质cccDNA的慢性乙型肝炎治疗药物。可以显著降低HBV的S抗原、Core蛋白的表达水平，阻止HBV成熟病毒颗粒释放至细胞外，从而使得细胞内HBV的cccDNA、Total DNA和pgRNA等病毒源性的核酸物质发生积累，并促进MAPK信号通路发生活化，增强抗病毒的炎症细胞因子TNF-α产生，最终导致细胞内HBV的S抗原、Core蛋白以及HBV的遗传物质发生显著较低，从而达到明显的抗病毒作用。

本发明首次发现烟酸可用于慢性乙型肝炎的治疗。依据慢性乙型肝炎患者年龄、性别、饮食情况以及患病程度和体内HBV载量不同，本领域技术人员可以根据其普通知识和在本领域的经验，调整烟酸的用量、用药时长以及对烟酸进行化学修饰等，都应包括在本发明的范围内。例如对于慢性乙型肝炎患者，人类合适的用药剂量范围为每人每天1～1000mg，用药时长两周以上至最佳治疗时间等。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。