烟碱酸衍生物在缓解女性生殖系统衰老损伤中的应用
阅读说明：本技术 烟碱酸衍生物在缓解女性生殖系统衰老损伤中的应用 (Application of nicotinic acid derivative in relieving female reproductive system aging injury ) 是由 贺鑫 于 2020-08-27 设计创作，主要内容包括：女性生殖系统衰老作为女性衰老的关键问题,其核心是细胞衰老,活性氧簇代谢紊乱广泛损伤生物大分子等,是细胞病理性衰老损伤主要分子机制。发明人经过长期实验筛选验证,发现烟酰胺、烟酸与烟酰胺单核苷酸等多种烟碱酸基衍生物均可提高胞内NADH和DNADP水平,矫正活性氧簇代谢紊乱,进而提高女性生殖系统细胞抗病理性氧化损伤的能力。还发现多种烟碱酸基衍生物仅存在药代动力学等方面的不同,一定程度上可以互相替代。在此基础上本发明公开了一种通过烟碱酸基衍生物通过综合矫正活性氧簇代谢紊乱缓解女性生殖系统衰老损伤在药物、保健品或功能食品方面的应用。(The female reproductive system aging is a key problem of female aging, and the key points of the female reproductive system aging are cell aging, active oxygen cluster metabolic disturbance widely damages biomacromolecules and the like, and the main molecular mechanism of cell pathological aging damage. The inventor finds that various nicotinic acid-based derivatives such as nicotinamide, nicotinic acid and nicotinamide mononucleotide can improve intracellular NADH and DNADP levels and correct metabolic disorder of active oxygen clusters through long-term experimental screening verification, and further improves the capacity of female reproductive system cells to resist pathological oxidative damage. It has also been found that various nicotinic acid-based derivatives differ only in terms of pharmacokinetics and the like and can be substituted for each other to some extent. On the basis, the invention discloses application of nicotinic acid-based derivatives in the aspects of medicines, health-care products or functional foods for relieving female reproductive system aging injury by comprehensively correcting active oxygen cluster metabolic disturbance.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种通过烟碱酸衍生物综合矫正代谢紊乱缓解女性生殖系统衰老损伤的药物、保健品或功能食品方面的应用。
背景技术
随着我国人口老龄化的日益加剧，衰老导致的健康问题已成为目前面临的巨大挑战。女性生殖系统的衰老除了引起生育力减退，其伴随的低***和孕激素水平等内分泌紊乱，引发全身多个系统和器官功能衰退，还可能导致精力下降、记忆力减退、睡眠障碍、抑郁症等神经系统和精神心理症状，甚至与糖尿病和心脑血管疾病等重大慢性病的发生发展密切相关，因此女性生殖系统衰老是女性衰老防治的核心问题之一，需要引起高度重视。
器官衰老的核心是细胞衰老，而端粒缩短、DNA损伤、氧化应激和线粒体功能障碍是导致细胞衰老的主要原因。细胞衰老不仅表现为增殖停滞、生理功能下降，还会分泌一系列细胞因子，包括促炎因子、生长因子、趋化因子和基质重塑酶等，称为衰老相关分泌表型，进而恶化局部微环境，导致恶性循环，严重加速衰老进程。
女性生殖系统的结构和功能随着年龄增长逐渐衰退是正常的生理性过程，但衰老不仅包含年龄相关的生理性衰老，还包括各种致病因素导致的早衰和病理性衰老，后者是预防和治疗的关键。其中端粒是细胞内置的衰老时钟，因此可以将复制性端粒缩短作为生理性衰老的指示标；但是激活端粒酶可能导致细胞癌变等严重风险，因此不是好的治疗靶点。而DNA损伤、氧化应激、线粒体功能障碍是导致病理性衰老的原因，其中活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)代谢异常产生是其中的根本原因，因为是ROS是氧化应激、DNA损伤和线粒体障碍产生的根本原因，因此防治病理性衰老应该从调控优化胞内ROS水平入手，从根本上解决问题。
线粒体呼吸链泄露的超氧阴离子是细胞ROS的主要来源，在女性生殖系统衰老进程中，不断增加的呼吸链ROS泄露会反过来损伤线粒体，加剧ROS泄露，这个正反馈过程是病理性衰老损伤的重要机制；因为超氧阴离子能被超氧化物歧化酶催化为过氧化氢，后者能被铁离子催化为羟自由基，产生DNA和蛋白质等大分子损伤，以及线粒体和细胞膜结构损伤，进而导致严重的病理性衰老。
正常情况下，机体内促氧化剂水平与抗氧化剂水平处在动态平衡之中，但ROS的产生和存在细胞区域性，也有极性相和非极性相的重要区别，而ROS的消除也有着其它代谢自由能驱动和反应本身自由能驱动两种模式，因此在细胞衰老性代谢紊乱中，线粒体损伤导致自由能供应不足，常产生ROS局域失控等病理现象。高浓度的ROS损伤细胞内生物大分子，抑制机体抗氧化系统，降低超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽硫转移酶等抗氧化酶活性，进一步加剧了促氧化剂水平与抗氧化剂的不平衡，加速女性生殖系统病理性衰老进程。
DNA 是ROS攻击的重要靶标，ROS能够造成DNA 链断裂、位点突变、双链畸变导致DNA 脱氨基和碱基氧化等，与核DNA 相比，线粒体DNA更容易遭受氧化伤害。大多数ROS致DNA突变的形式使G氧化为8-氧鸟嘌呤( 8-oxoG)，而8-oxoG不再与C配对，反而与A配对，使得G转变为 A，产生进行性的DNA损伤导致基因突变不断累积，是病理性衰老的重要原因。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH氧化酶，Nox)通过 NADPH 依赖过程将体内氧分子还原成超氧负离子，是体内唯一直接产生ROS的酶，其催化产生的适度ROS在细胞内有信号传导作用，是细胞增殖等过程的必要调控因子。并且Nox产生ROS是一个自由能驱动的可控代谢过程，其自由能来自细胞代谢产生的NADPH，并且与线粒体泄露ROS有一定的互补性。
综上所述，女性生殖系统衰老的核心是细胞衰老，其中DNA损伤、氧化应激和线粒体功能障碍是导致细胞病理性衰老的主要原因，而细胞内ROS代谢紊乱又是产生DNA损伤、氧化应激、线粒体功能障碍的根本原因，因此将端粒主导的生理性衰老之外的，由上述ROS因素诱导的病理性损伤称为ROS代谢紊乱相关性衰老损伤。
目前缓解细胞ROS衰老损伤的预防保健方案，普遍存在副作用大或效果不佳等问题，例如申请号为201810104899.X、201610041188.3和201910680707.4等专利试图利用益生菌等有效维护菌群平衡，且不说传统上用于调节肠道菌群的益生菌组合疗效本身存疑，更为重要的是***等女性生殖系统的菌群显著不同于肠道，肠道益生菌组合并不适应定居于***等组织，因此这一技术路线存在根本缺陷，疗效堪忧。申请号为201811644710.2、201910893065.6等专利利用中药复合剂定期清洗***，首先中药配方复杂，内含多种生物碱等复杂化学成分，难以保证不引起患者过敏等问题，另外清洗可能会破坏***糖原发酵形成的乳酸抑菌环境，削弱***抵抗力，引起额外的感染。专利201710140768.2利用维生素E、叶酸、维生素B12等促进育龄女性生殖健康，此类营养物质在绝大多数女性饮食摄入中并不缺乏，而过量补充可能无益有害。总之，女性生殖系统是个复杂的多器官互作系统，因此只能从细胞衰老这一根本问题出发解决问题，但截至专利申请前夕，尚无安全有效的针对细胞ROS损伤来防治女性生殖系统病理性衰老的成熟方案。
发明内容
本专利所指烟碱酸衍生物(Nicotinic derivatives)，其结构通式为图1所示的结构A或者结构B，其中R1和R2可以为氢原子、胺基或其它基团(例如烟酰胺是结构B中R1为胺基，烟酰胺单核苷酸是结构A中R1为胺基、R2为核苷酸基团)，X-为某种电负性基团。
作为病理性女性生殖系统衰老损伤的关键，胞内ROS在代谢中产生，也在代谢中消除，ROS代谢紊乱归根到底是一种代谢问题，而代谢调节的核心是各种高效的催化酶和辅助因子，因此矫正ROS代谢紊乱也应该从上述酶和其辅助因子入手。
具体而言，随着女性生殖系统的生理或者病理性衰老进程，细胞内促氧化剂水平与抗氧化剂水平开始失衡，尤其是超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽硫转移酶等抗氧化酶活性降低导致ROS浓度增加和损伤加剧，因此我们需要寻找一种温和促进抗氧化酶表达水平的小分子物质，经过发明人长期实验筛选，发现烟酰胺、烟酸、烟酸肌醇酯、烟酰胺核苷、烟酸核苷与烟酰胺单核苷酸等烟碱基衍生物可以显著促进抗氧化酶系的表达，降低胞内ROS浓度，相关实验显示其起效浓度与毒性浓度差值大，因而安全性好。
从生物化学和分子生物学理论入手，在人类消除ROS酶类的辅助因子中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)居于核心地位，NADH存在于每个细胞中，它直接参与人体生命活动的物质代谢、能量合成、细胞DNA修复等多种生理活动。其中最值得一提的应是，NADH是 DNA修复酶的唯一底物，是细胞内DNA修复系统的重要原料。而DNA损伤是细胞老化与多种疾病发生的重大根本原因；并且NADH还可以直接改善线粒体的功能，防止线粒体呼吸链ROS泄露，从源头上减少ROS产量。更为重要的是，NADH是机体ROS消除的核心辅助因子，作为一种转递电子，是体内很多脱氢酶的辅酶，例如NADH可将还原型自由能通过NADPH传递给GSH用于消除脂质过氧化等，可以说NADH是机体主动消除ROS的自由能和还原电势的核心中间载体，是延缓ROS致女性生殖系统病理性衰老损伤的关键。
然而，NADH和DNADP的分子量过大，无法被人体直接吸收。鉴于此，本发明人经过长期实验筛选和验证，发现尽管存在有效剂量和作用效果的差异，但烟酰胺、烟酸、烟酸肌醇酯、烟酰胺核苷、烟酸核苷与烟酰胺单核苷酸等烟碱酸衍生物均能提高女性生殖系统细胞抗病理性氧化损伤的能力，因为从生化代谢上讲，他们都可以作为细胞合成NADH和DNADP的烟酰基团的有效来源，只是存在药代动力学方面的不同。
在上述分析和实验的基础上，发明人参考了前期工作研究阶段系统阐明的“女性生殖系统衰老损伤的核心是细胞衰老，其中ROS代谢紊乱诱导的DNA损伤、氧化应激和线粒体功能障碍是产生细胞病理性衰老损伤的主要原因”这一理论框架，在其指导下针对性的筛选ROS代谢紊乱矫正配方，之后经过长期的细胞实验和人类志愿者随机双盲对照实验改进和验证，得出烟碱酸基衍生物最适合防治ROS诱导的细胞损伤这一结论，并且相关化合物化学结构清楚明确，整体上理化性质较为稳定，对口服摄入方法等问题无特殊要求。
与现有技术相比，本发明有以下优势。
1.发明创新性强，本专利是发明人在长期从事女性生殖系统ROS损伤细胞机理研究的基础上，逐渐建立了“女性生殖系统衰老的核心是细胞衰老，其中ROS代谢紊乱诱导的DNA损伤、氧化应激和线粒体功能障碍是产生细胞病理性衰老损伤的主要原因”这一理论框架，在其指导下针对性的筛选出综合缓解细胞ROS的成熟技术方案，通过添加烟碱酸基衍生物提高抗氧化酶表达水平，缓解ROS诱导的细胞损伤。
机体氧气摄入中约3%在线粒体呼吸链泄露转化为ROS，事实上利用二氢硫辛酸等还原剂消除ROS的实际机理是作为开关利用机体代谢产生的自由能和还原势，但这些自由能只能来自磷酸戊糖通路这一代谢过程，因此单纯补充效果不佳。而发明人利用烟碱酸基衍生物促进NADH和NADPH的产生，后两者是机体重要的载氢体，也是代谢产生的自由能和还原势的主要载体，可以持续的将已经氧化的硫辛酸还原为二氢硫辛酸，因此能切实发挥彼此效果，消除细胞ROS水平。
机体有自由能驱动的ROS消除，也有非自由能驱动的ROS消除，而烟碱酸基衍生物能够提高ROS消除的自由基驱动性酶系的活力水平。但是ROS消除的自由能和非自由能系统是互相依赖和补充的，例如线粒体泄露的超氧阴离子必须通过超氧化物歧化酶才能转化为过氧化氢，后者在铁离子催化下进行芬顿反应转化为羟自由基损伤细胞膜系统，就必须通过自由能驱动的GPX4才能消除，而GPX4 的自由能来自NADPH-GSH这一代谢通路，鉴于此，烟碱酸基衍生物的补充能起到增加NADPH浓度等重要辅助作用，有效消除细胞ROS损伤。
更为关键的是，细胞生理调控需要一定浓度的ROS水平作为增值的第二信使，但是当前的各个方案都没法解决ROS消除过量干扰细胞代谢的问题。然而本发明通过补充烟碱基衍生物提高NADPH浓度，通过NADPH氧化酶催化反应产生ROS，因此高NADPH浓度可以在特定细胞区域内促进信使用的ROS产生，进而维持和促进细胞活力，综上所述，本配方的烟碱基衍生物可以巧妙的避免单纯补充还原剂带来的低ROS水平副作用。
2.从细胞核动物模型实验数据看，本发明配方效果明显。
详见实施例1和实施例2，本复合配方在标准化的高通量细胞和动物模型实验上有明显的作用效果。
3.从志愿者试用数据看，本发明配方显著强于市面主流方案。
在作用效果上，通过综合利用细胞活力实验与志愿者多中心大样本随机双盲对照等实验方法，在获取大量数据基础上统计分析，发现本方案比某些上市配方效果更为良好(详见实施例3)。
4.在安全性上，本方案的成分来自业内公认的低毒性的代谢调节性营养物质，并且在预实验中专门检查了配方的细胞毒性，保证使用剂量不超过毒性阈值的10%。另外，本发明的前期工作通过标准化的高通量细胞实验，精确探明了成分的作用范围和毒性阈值，从而使各组分的使用剂量有一定的宽容度，利于产品开发上市。
附图说明
图1是烟碱酸衍生物(Nicotinic derivatives)的结构通式(结构A或者结构B，X-为某种电负性基团，其中R1和R2可以为氢原子、胺基或其它基团，例如烟酰胺是结构B中R1为胺基，烟酰胺单核苷酸是结构A中R1为胺基、R2为核苷酸基团)。
具体实施方式
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下面结合具体实施例对本发明的技术实施方案做进一步详细说明。
实施例1 基于高通量的标准化细胞实验评估有效性和安全性。
在前期工作基础上，利用高通量的标准细胞实验，筛选烟酰胺、烟酸、烟酰胺核糖与烟酰胺单核苷酸等烟碱酸基衍生物的剂量范围。
基于本发明的前期工作，在梯度处理基础上，利用吸光度法测定细胞活力、ATP产量、胞内ROS水平和β-半乳糖苷酶活性，在上述数据归一化基础上取平均值作为效果指数，在5次独立实验的数据基础上进行T检验分析；以P＜0.05为差异显著标准，分析出配方中该组分的起效和实效范围；为提高配方安全性，以P＞0.01的最低剂量作为该组分的毒性剂量阈值.数据显示几种代表性烟碱酸基衍生物的有效范围、最佳剂量和毒性阈值分别为烟酰胺(10-500mg/d，300 mg/d，6000mg/d)，烟酸(10-500mg/d，200 mg/d，5000mg/d)，烟酰胺核糖 (20-1000mg/d，400 mg/d，10000mg/d)，烟酰胺单核苷酸(100-1500mg/d，500 mg/d，15000mg/d)。可见烟碱酸基衍生物的有效性和安全性均较为良好。
实施例2 卵巢早衰动物模型小鼠效果实验。
基于实施例1中的得出的最佳剂量，测定小鼠***恢复情况，3次120只小鼠的独立实验发现预处理组比阴性对照组高21.6%， T检验发现差异显著。以上数据说明烟碱酸基衍生物可以有效提高卵巢早衰动物模型小鼠的***水平。
实施例3 本配方在较优浓度下的随机双盲对照多中心志愿者实验。
2018年6月至2019年10月，在北京、西安和咸阳三座城市，分别选取各城市女性卵巢早衰志愿者共150人，平均年龄36.2岁，体质指数21.9。志愿者分别每日外用外观无法分辨的烟碱酸基衍生物、已上市产品B和C共120天(配方A按照实施例1给出最佳剂量，产品B和C按照说明书服用)，采用随机双盲对照原则进行志愿者实验。
分别测定志愿者的血清***水平、月经状况和血清***水平，对上述结果进行归一化，生成雌性生殖系统功能损伤评分。结果显示，配方A最终能使志愿者的雌性生殖系统功能损伤评分平均降低71.2%，分别是单纯使用已上市产品B和C干预效果的10.2倍和7.5倍，另外不论使用配方A、已上市产品B和C组的志愿者都未报告额外不适，相关体检也未发现额外异常。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的配方范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换，也应视为本发明的保护范围。