阅读说明：本技术 一种髓细胞触发受体2的激活用药及其应用 (Medicine for activating marrow cell trigger receptor 2 and application thereof ) 是由 孙秀兰 薛腾飞 程虹 郭若冰 杨进 季娟 范益 胡刚 于 2019-11-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了磷酸化芬戈莫德在制备髓细胞触发受体2的激活用药中的应用,应用于调节细胞吞噬。本发明首次披露了磷酸化芬戈莫德是TREM2的激动剂,并揭示了磷酸化芬戈莫德通过激活TREM2增强小胶质细胞的吞噬功能,阐明了磷酸化芬戈莫德调节小胶质细胞吞噬功能的新机制。(The invention discloses application of phosphorylated fingolimod in preparation of a medicine for activating a myeloid cell trigger receptor 2, and the phosphorylated fingolimod is applied to regulation of phagocytosis of cells. The invention discloses that phosphorylated fingolimod is an agonist of TREM2 for the first time, and discloses that phosphorylated fingolimod enhances the phagocytic function of microglia by activating TREM2, and a novel mechanism for regulating the phagocytic function of the microglia by phosphorylated fingolimod is elucidated.)

一种髓细胞触发受体2的激活用药及其应用

技术领域

本发明涉及药物研发技术领域，特别是涉及一种髓细胞触发受体2的激活用药及其应用。

背景技术

小胶质细胞是中枢神经系统中固有的免疫效应细胞。在神经系统的正常发育中，小胶质细胞发挥对凋亡神经元的迅速清除，对神经元突触的修剪，分泌细胞因子等调节神经元的存活等功能；在病理情况下，小胶质细胞是最早发生反应的免疫细胞之一。如缺血性脑卒中等脑损伤时，伴随着大量神经元死亡，死亡的神经元释放诸多危险分子如核酸，蛋白质，脂质，进而导致炎症反应，这些具有神经毒性的细胞碎片若得不到有效的清除，会减弱损伤后神经元的可塑性，引发二次炎症、加剧损伤。因此，调节小胶质细胞的吞噬功能，是减轻神经损伤的重要途径之一。

髓细胞触发受体2(Triggering receptor expressed on myeliod cells，TREM2)是I型单跨膜蛋白，是免疫球蛋白受体家族的一员。TREM2高表达于巨噬细胞，树突细胞，破骨细胞以及小胶质细胞。在中枢神经系统内，TREM2特异地表达于小胶质细胞。由于缺乏胞内段，TREM2须通过其共受体12kDa的DNAX活化蛋白(DAP12)实现信号的传导，最终发挥调节吞噬、促进细胞生长、抑制凋亡、调节炎症等功能。迄今，虽然已发现诸多物质能与TREM2结合引发下游信号，如磷脂类，核酸，蛋白聚糖，热休克蛋白60和载脂蛋白等，但激活TREM2的药物仍未发现。

磷酸化芬戈莫德(FTY720-Phosphate,FTY720-P)是芬戈莫德(FTY720)于体内在鞘氨醇激酶2(SphK2)的催化下形成的活性形式，是鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,S1P)的结构类似物，能激活S1PR1/3/4/5，参与其介导的诸多生理功能，如细胞存活，凋亡，增殖等过程。发明人新发现FTY720具有增强小胶质细胞吞噬的功能，但是否通过激活小胶质细胞的吞噬相关受体，如髓细胞触发受体2(TREM2)介导促吞噬功能尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供磷酸化芬戈莫德在制备髓细胞触发受体2的激活用药中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过明确磷酸化芬戈莫德与髓细胞触发受体2间的关系，确定磷酸化芬戈莫德是髓细胞触发受体2的激活剂。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供磷酸化芬戈莫德在制备髓细胞触发受体2的激活用药中的应用，应用于调节细胞吞噬。所述磷酸化芬戈莫德(FTY720-P)的结构式如式Ⅰ所示，

优选的是，应用于增强小胶质细胞的吞噬功能。

优选的是，所述磷酸化芬戈莫德通过激活髓细胞触发受体2增强小胶质细胞的吞噬功能。

优选的是，应用于调节炎症。具体的：磷酸化芬戈莫德通过激活S1PR1/3/4/5，调节炎症。

本发明公开了以下技术效果：

本发明应用计算机模拟预测人源性TREM2(hTREM2)和FTY720-P结合的可能性，显示hTREM2通过47位精氨酸，65位丝氨酸和77位精氨酸与FTY720P结合(如图1所示)。通过微量热涌动(MST)的方法进一步证明，FTY720-P能够直接与TREM2结合，表明FTY720-P是TREM2的一个配体。此外，神经元与小胶质细胞共培养时，氧糖剥夺-再灌注损伤后，FTY720处理能增强小胶质细胞对神经元碎片的吞噬，将TREM2敲低表达后，FTY720促进吞噬的功能显著减弱，进一步从功能角度说明FTY720-P通过激活TREM2受体发挥促吞噬功能。本发明揭示了FTY720-P是TREM2的一种激动剂，FTY720-P通过作用于TREM2增强小胶质细胞的吞噬功能，促进对病理损伤情况下细胞碎片的清除，揭示了FTY720调控小胶质细胞功能的新作用和新机制。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明TREM2分子对接结果图；

图2为本发明实施例1微量热涌动(MST)结果图；

图3为本发明小胶质细胞与神经元共标免疫荧光染色结果图；其中，a：WB验证小胶质细胞上进行TREM2 RNA干扰(RNA interference，RNAi)的敲低效率；b：经Iba1与NeuN免疫荧光双染色，反映小胶质细胞的吞噬情况；c：统计出现吞噬的小胶质细胞的占比；

图4为本发明Iba1与CD68免疫荧光共标结果图；其中，a：经Iba1与CD68免疫荧光染色结果；b：基于荧光染色、统计CD68表达量；

图5为本发明微量热涌动(MST)法检测hTREM2与FTY720的结合关系图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

微量热涌动方法揭示FTY720-P与TREM2间的关系

以pET-24a(+)为载体，构建C端His-tag标记的各种源性的TREM2蛋白表达质粒，人源性，大鼠源性和小鼠源性TREM2所用序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示。

将重组质粒转化入BL(DE3)大肠杆菌：取新鲜制备的感受态BL(DE3)细胞100μL，加入10μL重组质粒，轻弹混匀后冰上放置30min；42℃热激80s，快速转移至冰浴中，冷却5min；加入400μL、37℃的LB培养基，再转移至孵箱，于37℃温育1h复苏细胞；取适量转化产物涂布于含卡那霉素的LB平板(琼脂15g、蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g、水1000mL)上，37℃孵箱倒置培养16h，挑取单菌落扩增培养至400mL培养液，直至OD₆₀₀达到0.8左右，加入终浓度1mmoL/L的IPTG继续培养8h，诱导目的蛋白的表达。将培养液转移至离心管，于4℃、5000rpm条件下离心5min，收集菌体；用预冷的tris buffer(Tris pH8.0 150mM，EDTA 10mM、NaCl150mM)重悬菌体，5000rpm再次离心5min收集菌体；用His标签蛋白纯化试剂盒纯化收集目的蛋白，并使用Monolith His-Tag Labeling Kit对带有His标签的目的蛋白进行荧光标记，按说明书检测TREM2与S1P的结合情况。

结果如图2所示，FTY720-P与人源性，大鼠源性，小鼠源性的TREM2具有结合能力，其KD值分别为6.38μM、7.17μM、72.60μM(详见图2a、b、c)。通过分子对接预测，由该实施例的微量热涌动(MST)方法证明了：FTY720-P直接与TREM2结合，表明FTY720-P是TREM2的一个配体。

实施例2

实验分组及给药处理

分别提取大鼠原代神经元和小胶质细胞，原代神经元用Neurobasal培养基+2％B27+1％双抗培养于24孔板(20万个/孔)，隔天半换液，培养一周至细胞成熟；原代小胶质细胞用10％Gibco FBS+DMEM+1％双抗培养，每三天换一次液，培养一周至细胞成熟。

细胞成熟后将小胶质细胞加入神经元中共培养(2万个/孔)，按1:10的比例共培养，换用不含B27的Neurobasal培养基:(10％Gibco FBS+DMEM+1％双抗)＝3:1的培养基培养，分为正常组、正常给药组、正常敲低组、敲低给药组，以及氧糖剥夺-复灌(OGD/R)损伤后各时间点(3h，5h，7h，9h，12h)的这四组。氧糖剥夺-复灌具体操作为：敲低转染后48h进行OGD处理3h，复灌时换正常培养基或10nM的S1P处理，于各时间点0.01MPBS洗涤后用多聚甲醛固定1h。

实施例3

免疫荧光染色试验

细胞固定后用0.01M PBS洗3次，弃净后加入封闭液(含5％山羊血清和0.1％的Triton X-100)室温封闭1h；滴加一抗(抗体滴度见表1)，4℃孵育过夜。次日取出后用0.01MPBS洗净一抗，洗3次，每次5min，滴加相应的荧光二抗(抗体滴度见表2)，室温避光孵育1h，再用0.01M PBS洗3次，每次5min；滴加5μg/mL的Hoechst溶液避光反应20min，0.01M PBS洗3次，每次5min，摄片。

表1免疫荧光染色一抗

表2免疫荧光染色二抗

结果如图3a为WB验证小胶质细胞上进行TREM2 RNA干扰(RNA interference，RNAi)的敲低效率；如图3b所示，通过Iba1与NeuN免疫荧光双染色，结果显示未进行OGD损伤时小胶质细胞极少有吞噬现象，对照组造模后至3h小胶质细胞对神经元碎片的清除都较少，5h出现明显增加，在7h吞噬清除作用达到高峰，随后清除作用逐时减弱；如图3c所示，给予S1P处理后3h起就有明显的清除，一直到12h都有明显的清除作用；TREM2敲低后各组小胶质细胞的均未出现明显的清除作用，说明FTY720-P促进氧糖剥夺-复灌损伤后小胶质细胞对神经元碎片的吞噬，且TREM2敲低后S1P的促吞噬作用显著降低。

如图4所示，CD68作为巨噬细胞特异性溶酶体标记物，可以反映小胶质细胞的激活水平以及吞噬能力。从图4a和b为Ibal和CD68免疫荧光共标结果，从图中可以看出，未进行OGD损伤时，小胶质细胞CD68表达很少，造模后对照组在5h出现明显表达增加，持续至7h达到高峰，到9h时明显减少；给予S1P处理后3h已出现明显的CD68表达增加，一直持续至12h仍有高水平CD68表达；TREM2敲低后CD68的表达全程无明显增加；这些结果均表明FTY720-P增强了小胶质细胞对神经元碎片的吞噬清除，且TREM2具有重要作用。

从上述结果可以看出，神经元与小胶质细胞共培养时，氧糖剥夺-再灌注损伤后，FTY720处理能增强小胶质细胞对神经元碎片的吞噬，而敲低TREM2的表达明显抑制了吞噬功能的增强，因此，从功能角度说明FTY720-P通过激活TREM2受体发挥促吞噬功能。

从实施例2可以看出，本发明是直接给药FTY720，为排除FTY720直接作用影响，进一步检测了TREM2与FTY720的相互作用关系。结果如图5所示，TREM2与FTY720无结合关系，表明FTY720磷酸化成FTY720-P才能结合TREM2发挥激活作用。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 南京医科大学

<120> 一种髓细胞触发受体2的激活用药及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 693

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggagcctc tccggctgct catcttactc tttgtcacag agctgtccgg agcccacaac 60

accacagtgt tccagggcgt ggcgggccag tccctgcagg tgtcttgccc ctatgactcc 120

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ctccaaactc tgccagggct gagagacacg tga 693

<210> 2

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggaacctc tccacgtgtt tgtcctgttg ctggtcacag agctgtccca agccctcaac 60

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<210> 3

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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ccgctcaaca ccacggtgct gcagggcatg gccggccagt ccttgagggt gtcatgtact 120

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cagggtcaga gaccagaagt atacagtgac ctcaacacac agaggcaata ttacaga 777