阅读说明：本技术 油酰基-L-α-溶血磷脂酸在制备自然流产保胎药物中的应用 (Application of oleoyl-L-alpha-lysophosphatidic acid in preparation of medicament for preventing miscarriage due to spontaneous abortion ) 是由 李明清 杨慧丽 李大金 赖真真 于 2020-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及油酰基-L-α-溶血磷脂酸在用于制备治疗、预防自然流产药物中的用途。本发明的油酰基-L-α-溶血磷脂酸可显著促进巨噬细胞对蜕膜基质细胞的黏附。经油酰基-L-α-溶血磷脂酸处理后的巨噬细胞可促进滋养细胞的增殖和侵袭。构建流产孕鼠模型并经体内实验证实,应用油酰基-L-α-溶血磷脂酸可通过其富集不足所致的蜕膜巨噬细胞丢失,从而维持蜕膜免疫成分稳态,并显著降低孕鼠胚胎吸收率,从而改善不良妊娠结局。因此,油酰基-L-α-溶血磷脂酸有望作为自然流产的保胎药物。(The invention relates to application of oleoyl-L-alpha-lysophosphatidic acid in preparing a medicament for treating and preventing spontaneous abortion. The oleoyl-L-alpha-lysophosphatidic acid can remarkably promote the adhesion of macrophages to periostracum stromal cells. Macrophages treated with oleoyl-L- α -lysophosphatidic acid promote the proliferation and invasion of trophoblasts. An abortive pregnant mouse model is constructed and in vivo experiments prove that the application of oleoyl-L-alpha-lysophosphatidic acid can maintain the steady state of an decidua immune component through decidua macrophages lost due to insufficient enrichment, and the absorptivity of a pregnant mouse embryo is obviously reduced, so that the poor pregnancy outcome is improved. Therefore, oleoyl-L-alpha-lysophosphatidic acid is expected to be a fetus-protecting drug for spontaneous abortion.)

油酰基-L-α-溶血磷脂酸在制备自然流产保胎药物中的应用

技术领域

本发明属医药技术领域，涉及一种溶血磷脂酸(LPA)油酰基-L-α-溶血磷脂酸的药用用途，具体涉及油酰基-L-α-溶血磷脂酸用于制备治疗自然流产保胎药物的用途。

背景技术

正常妊娠类似于成功的同种异体移植，母体对携带父系抗原的胚胎不仅不排斥，而且通过精细的母-胎对话建立独特的母-胎界面免疫耐受微环境，允许胎儿在子宫内生长发育直至分娩。母-胎界面主要由胚胎来源的滋养细胞、母体来源的蜕膜基质细胞和蜕膜免疫细胞共同组成。正常母-胎交互对话是建立和维持成功妊娠的关键。一旦出现异常母-胎交互对话，必将导致滋养细胞功能异常及母体对胚胎的免疫排斥，表现为早期妊娠失败(如反复自然流产)，中晚期妊娠并发症(如胎儿宫内生长受限、子痫前期等)，严重危害母婴健康；而中晚期妊娠并发症的发生与否，常常取决于早孕期母-胎关系建立的良好与否。近年统计资料表明，自然流产发病率高达15％。即便是在辅助生育技术飞速发展的今天，仍不能克服因母-胎免疫调节紊乱造成的妊娠失败。咎其原因，在于母-胎免疫耐受的形成机制和母-胎免疫调节紊乱的致病机制不甚了解。

母-胎免疫调节是母-胎交互对话的核心内容。母-胎界面存在多种免疫细胞如自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞(Mφ)、T细胞及少量树突状细胞等。蜕膜免疫细胞在母-胎免疫调节中扮演主要角色，其在母-胎界面募集和驻留的调控机制以及分化和发育的分子机制是母-胎免疫调节和耐受的研究重点，有着重要的理论和临床意义。母-胎界面蜕膜免疫细胞中Mφ近20％，仅次于NK细胞。蜕膜Mφ(decidua Mφ,dMφ)主要参与胚胎植入、螺旋动脉重塑、胎盘发育、宫颈成熟和分娩等妊娠生理过程。dMφ功能调控的复杂性Mφ的表型具有可塑性，并参与宿主抵抗病原体、清除凋亡细胞、血管生成等多种生理过程。

人类蜕膜化进程中CD14⁺dMφ的数量已被证实是增加或相对恒定的。耗竭孕鼠巨噬细胞导致孕鼠胚胎吸收率增加，表明母-胎界面局部蜕膜巨噬细胞的密度及驻留异常可导致不良妊娠结局。在感染或损伤发生时，淋巴细胞从血液循环被募集、黏附于血管并渗出至受损区域的过程是炎症反应中十分重要的环节。这个过程也称为淋巴细胞归巢，即淋巴细胞通过淋巴细胞归巢受体与对应器官血管内皮细胞上相应的血管地址素相互作用从而在相应器官内富集的过程。期间需要许多细胞因子、趋化因子以及黏附分子(如选择素，整合素)等的参与。子宫虽然不属于淋巴器官，但胚胎植入和妊娠维持是促炎与抗炎动态平衡的过程，有大量蜕膜免疫细胞的参与。而且蜕膜及螺旋动脉有选择素等黏附分子表达，有利于囊胚的黏附及种植。因此，外周血单核细胞可能通过受体与蜕膜对应配体的相互作用，从而在子宫局部驻留，但仍需进一步研究证实。既往报道中，胚胎植入部位的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)/集落刺激因子1(CSF1)的含量显著高于未孕子宫。一方面，M-CSF刺激内膜巨噬细胞的增殖，尤其是促进CD209⁺dMφ的增殖；另一方面，其诱导巨噬细胞表达单核细胞趋化因子CCL2，以促进血源性单核细胞的外渗并分化为蜕膜巨噬细胞。

溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid，LPA)是迄今发现的一种最小、结构最简单的磷脂，是真核细胞甘油磷脂代谢的中间产物。LPA是一种由甘油主干、单一的脂肪酰基链和游离磷酸基团构成的简单脂。LPA主要是溶血磷脂酰胆碱经由一种具有溶血磷脂酶D活性的酶——自毒素(ATX/ENPP2)分解而来。尽管结构简单，但LPA可作为脂质信号分子发挥重要的生物学作用，近年来逐渐成为脂类研究的热点。LPA由血小板、单核-巨噬细胞、成纤维细胞、癌细胞和脂肪细胞等分泌，是一种多功能的“磷脂信使”，可以激活G蛋白偶联受体,引起生长激素样作用，从而产生广泛的生物学效应。它对细胞的生长、增殖、分化、迁移及细胞内信息传递产生多种影响，在维持机体正常的生理功能，参与各种病理过程的发生发展均有着重要的作用；亦在多种重大疾病如心脑血管病、肾病、肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。至今，生物膜上已有6种溶血磷脂酸受体(LPA receptors，LPARs)被发现，即LPAR1-6。此外，LPA存在胞内受体——氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferatoractivated receptor，PPAR)。研究表明，LPA是PPARγ的一种胞内激动剂，相比游离脂肪酸或其他小分子磷脂而言具有更高的结合力。

首先，LPA在早孕期发挥重要生物学功能。LPA通过LPAR1作用并依赖NF-κB信号通路介导滋养细胞产生GRO-α、IL-8和MCP-1(单核细胞趋化因子-1)，进而可调节早孕期的血管生成和免疫细胞的趋化。LPA/LPAR3调节参与血管生成和蜕膜化过程中关键分子(COX-2，IGFBP-1和IL-10)的生成，为着床期胚胎侵入创造合适的子宫微环境。人内膜基质细胞蜕膜化过程中高表达LPA，且LPAR1信号通路参与蜕膜化调控，提示LPA下游信号转导在子宫内膜蜕膜化和胚胎种植中扮演着重要作用。其次，LPA具有免疫调节功能。心肌梗死时LPA可导致联接蛋白-43的降解和表达降低，这一作用与LPA对免疫炎症细胞的调控密切相关；LPA还可在体外活化单核细胞。已有研究表明，LPA可将小鼠CD11b⁺单核细胞诱导为F4/80⁺巨噬细胞，这一过程中，LPA激活mTOR信号通路可能发挥着至关重要的作用。转录组分析表明，PPARγ是LPA诱导巨噬细胞分化过程中关键的转录因子。此外，LPA可通过类似的途径介导人单核细胞发育为一群高表达CD206的巨噬细胞。最后，LPA可调节细胞黏附。LPA可以激活p38MAPK信号，诱导肿瘤细胞迁移、侵袭及粘附，例如人肝癌细胞、卵巢癌细胞等。LPA对钙蛋白酶介导的FAK和其他粘附蛋白的蛋白水解的复杂作用可能在LPA促进***癌细胞的附着，迁移和存活的能力中发挥作用。另外，LPA通过介导RhoA信号的增强，诱导人内皮细胞细胞内粘附分子-1(ICAM-1)和VCAM-1的晚期表达；促进肌肉组织中CD68⁺组织巨噬细胞的浸润。

中国专利文献CN109646443A公开了溶血磷脂酸的应用。溶血磷脂酸可用于调控炎症因子例如IL-1和/或IL-6的表达，减轻炎症反应；并可以促进成纤维细胞分泌胶原、促进表皮增殖和再生。中国专利文献CN109852654A公开了能够诱导干细胞分泌细胞因子的组合物及其应用，一种能够诱导干细胞分泌细胞因子的组合物，其特征在于，所述的组合物包括：1mg～5mg维生素A、50mg～100mg谷氨酰胺、0.5mg～2mg溶血磷脂酸、0.01mg～0.1mg淫羊藿素。

但是关于油酰基-L-α-溶血磷脂酸在用于制备治疗、预防自然流产药物中的应用，目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种油酰基-L-α-溶血磷脂酸的新用途，具体涉及的是其在自然流产保胎治疗中的用途和方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

油酰基-L-α-溶血磷脂酸在用于制备治疗、预防自然流产药物中的用途。

进一步技术方案，所述的自然流产是复发性自然流产。

进一步技术方案，所述的自然流产是蜕膜巨噬细胞代谢酶自毒素水平低的自然流产。

进一步技术方案，所述的自然流产是LPA受体水平低的自然流产。

进一步技术方案，应用油酰基-L-α-溶血磷脂酸可显著促进巨噬细胞对蜕膜基质细胞的黏附。

进一步技术方案，应用油酰基-L-α-溶血磷脂酸可提高蜕膜巨噬细胞在组织局部的驻留。

进一步技术方案，应用油酰基-L-α-溶血磷脂酸可提高蜕膜巨噬细胞对滋养细胞增殖和侵袭的促进作用。

进一步技术方案，应用油酰基-L-α-溶血磷脂酸可改善自然流产。

本发明中比较自然流产和正常妊娠蜕膜巨噬细胞的LPA代谢状态和驻留水平，进一步通过构建自然流产小鼠模型来评价代谢物油酰基-L-α-溶血磷脂酸在调节孕鼠蜕膜巨噬细胞的驻留和改善胚胎吸收率中的潜在价值；提供了油酰基-L-α-溶血磷脂酸作为自然流产保胎治疗药物的一种新用途。结果显示：1)相较于外周血单核细胞，正常早孕妇女蜕膜巨噬细胞中油酰基-L-α-溶血磷脂酸水平升高，该代谢物上游关键代谢酶自毒素ENPP2水平及受体LPAR1和PPARγ水平均处于较高水平；在自然流产患者蜕膜巨噬中，ENPP2、LPAR1和PPARγ水平均较正常对照组低；2)在自然流产患者蜕膜组织中，蜕膜驻留的巨噬细胞数量显著低于正常妊娠妇女，且巨噬细胞的黏附分子普遍低表达，呈现低黏附状态；3)体外经外源性油酰基-L-α-溶血磷脂酸处理的巨噬细胞表现出对蜕膜基质细胞的强黏附力；4)体外经外源性油酰基-L-α-溶血磷脂酸处理的巨噬细胞可显著促进滋养细胞JEG3细胞的增殖和侵袭；5)体内应用油酰基-L-α-溶血磷脂酸可挽救自然流产小鼠模型的胚胎丢失和胎盘发育不良，逆转自然流产小鼠子宫的巨噬细胞的低占比、低数量及黏附分子的低水平。这些结果提示油酰基-L-α-溶血磷脂酸可用于子宫蜕膜巨噬细胞LPA富集障碍和驻留不良所致的自然流产的保胎治疗。

具体而言，本发明公开了一种通过应用油酰基-L-α-溶血磷脂酸可通过作用于其受体从而促进其在蜕膜局部的黏附和驻留，进而改善孕鼠胚胎吸收，可用于制备治疗自然流产的药物。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

收集正常早孕妇女的外周血和蜕膜组织，分离外周血单个核细胞和蜕膜免疫细胞，磁珠分选富集CD14⁺外周血单核细胞和蜕膜巨噬细胞，代谢组学检测代谢物水平，发现蜕膜巨噬细胞中油酰基-L-α-溶血磷脂酸显著富集。Real-time PCR检测外周单核细胞和蜕膜巨噬细胞中ENPP2、LPAR1和PPARγ的转录水平，结果显示蜕膜巨噬细胞中上述基因转录水平显著高于外周血单核细胞。收集自然流产(流产次数≥3次，术后绒毛染色体检测无异常、孕前内分泌激素检查无异常)患者的蜕膜组织，分离收集蜕膜免疫细胞，磁珠分选CD14⁺巨噬细胞，并通过Real time-PCR比较其与正常早孕蜕膜巨噬细胞ENPP2、LPAR1和PPARγ的转录水平，发现自然流产组蜕膜巨噬细胞ENPP2、LPAR1和PPARγ呈现低水平(如图1所示)。正常早孕组和自然流产组蜕膜进行石蜡包埋切片后，借助免疫组化技术检测组织局部CD68⁺巨噬细胞，40倍镜下进行细胞计数，发现自然流产组蜕膜巨噬细胞数量较正常早组低，提示巨噬细胞驻留不良状态。Real-time PCR检测CD14⁺蜕膜巨噬细胞上黏附分子血管细胞黏附分子1(VCAM-1)、L-选择素(L-Selectin/LSEL)、细胞间黏附分子-2(ICAM-2)、E-选择素(E-Selectin/ESEL)及VE-钙粘蛋白(VE-Cadherin/CDH5)的转录水平。结果显示，与正常妊娠妇女相比，自然流产患者蜕膜巨噬细胞中上述黏附分子的表达普遍下降(如图2所示)。体外对经MCSF(50ng/mL)诱导的巨噬细胞给予油酰基-L-α-溶血磷脂酸(5uM或10uM)处理48小鼠，与贴壁的蜕膜基质细胞进行黏附实验，结果中油酰基-L-α-溶血磷脂酸可显著促进巨噬细胞对蜕膜基质细胞层面的黏附(如图3所示)。而后将经油酰基-L-α-溶血磷脂酸预处理过的巨噬细胞(10uM，48小时)与经CFSE染料处理的JEG3细胞或与接种至麦氏胶上的JEG3细胞进间接共培养，流式细胞术或显微镜摄片以评估滋养细胞的增殖能力和侵袭能力。结果显示油酰基-L-α-溶血磷脂酸刺激后的巨噬细胞可促进JEG3细胞的增殖和侵袭(如图4所示)。最后通过构建自然流产孕鼠(CBA/J♀×DBA/2♂)模型，腹腔注射生理盐水或者油酰基-L-α-溶血磷脂酸(10nmol/次，从见栓D0.5天开始，每3天腹腔注射1次至孕D13.5)。油酰基-L-α-溶血磷脂酸可改善自然流产孕鼠的胚胎丢失，使其高胚胎吸收率显著降低，改善胎盘发育不良；给予油酰基-L-α-溶血磷脂酸后，孕鼠子宫巨噬细胞的数量得以回复，驻留巨噬细胞占比显著上调，绝对数量明显回升，且多种黏附分子表达上调(如图5所示)。

本发明提供了油酰基-L-α-溶血磷脂酸用于自然流产保胎治疗的用途和方法；尤其是经动物实验证实，补充油酰基-L-α-溶血磷脂酸可通过改善蜕膜巨噬细胞在组织局部的驻留，进而改善孕鼠胚胎丢失。因此，所述的油酰基-L-α-溶血磷脂酸可用于自然流产的保胎治疗。

本发明优点在于：本申请的发明人拟通过检测自然流产和正常妊娠蜕膜巨噬细胞的LPA代谢状态和驻留水平，进一步通过构建自然流产小鼠模型来评价在油酰基-L-α-溶血磷脂酸调节蜕膜巨噬细胞驻留和改善胚胎吸收率中的潜在价值，提供了油酰基-L-α-溶血磷脂酸用于自然流产保胎治疗的用途和方法，为自然流产的临床治疗提供新方法和新思路。

油酰基-L-α-溶血磷脂酸可显著促进巨噬细胞对蜕膜基质细胞的黏附。经油酰基-L-α-溶血磷脂酸处理后的巨噬细胞可促进滋养细胞的增殖和侵袭。构建流产孕鼠模型并经体内实验证实，应用油酰基-L-α-溶血磷脂酸可通过其富集不足所致的蜕膜巨噬细胞丢失，从而维持蜕膜免疫成分稳态，并显著降低孕鼠胚胎吸收率，从而改善不良妊娠结局。因此，油酰基-L-α-溶血磷脂酸有望作为自然流产的保胎药物。

附图说明

图1是正常早孕妇女蜕膜巨噬细胞油酰基-L-α-溶血磷脂酸富集而自然流产患者蜕膜巨噬细胞中富集和功能异常，

其中，pMo：外周单核细胞，

dMφ：蜕膜巨噬细胞，

NP：正常妊娠，

SA：自然流产，

LPA(18：1(9z)/0：0)：油酰基-L-α-溶血磷脂酸，

ENPP2：自毒素编码基因，

LPAR1，PPARG：LPA受体相关基因，

ACTB：内参基因，

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，***P<0.0001。

图2是自然流产患者蜕膜巨噬细胞驻留减少且黏附分子表达较低，

其中，NP：正常妊娠，

SA：自然流产，

红色箭头：CD68⁺蜕膜巨噬细胞，

VCAM1,LSEL，ICAM2，ESEL，CDH5：黏附相关基因，

ACTB：内参基因，

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，***P<0.0001。

图3是油酰基-L-α-溶血磷脂酸促进巨噬细胞对蜕膜基质细胞的黏附，

其中，DSC：蜕膜基质细胞(绿光)，

Mφ：巨噬细胞(红光)，

Merge：重叠，

Ctrl：对照组，

LPA 5uM/10uM：油酰基-L-α-溶血磷脂酸组，

*P<0.05，**P<0.01。

图4是油酰基-L-α-溶血磷脂酸诱导的巨噬细胞促进滋养细胞的增殖和侵袭，

其中，Isotype：同型对照，

Ctrl/Ctrl M0：对照组，

LPA/LPA M0：油酰基-L-α-溶血磷脂酸组，

FITC-CFSE：CFSE染色后细胞增殖经FITC通道检测，

MFI：平均荧光密度，

*P<0.05，**P<0.01。

图5是应用油酰基-L-α-溶血磷脂酸挽救自然流产孕鼠胚胎吸收和蜕膜巨噬细胞丢失，

其中，Ctrl：对照组(流产孕鼠模型)，

LPA：油酰基-L-α-溶血磷脂酸组(流产孕鼠模型)，

Embryo resorption rate(％)：胚胎吸收率，

Number of implanted embryos：种植胚胎个数，

Weight of embryos/placenta：胚胎/胎盘重量，

CD11b⁺F4/80⁺Mφof UICs(％)：子宫免疫细胞中巨噬细胞占比，

E-Selectin：E-选择素，

CD51：整合素αV链，

L-Selectin：L-选择素，

ICAM-1：细胞间黏附因子-1，

*P<0.05,**P<0.01，NS无显著差异。

其中，吸收胚胎因伴有缺血、出血和坏死，其体积明显小于正常存活胚胎，此外吸收胚胎与存活胚胎的色泽表现亦有明显差别，前者为黑褐色(如图红色箭头所示)而后者为粉红色。据此计数吸收胚胎数和存活胚胎数。胚胎吸收率R：R＝Re/(Re+F)×100％。Re为吸收胚胎数，F为存活胚胎数。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

分析正常早孕和自然流产妇女蜕膜巨噬细胞油酰基-L-α-溶血磷脂酸富集和功能相关基因水平

收集正常早孕妇女的外周血和蜕膜组织，使用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞和蜕膜免疫细胞，磁珠分选(CD14磁珠和分析相关试剂购于美天旎公司)富集CD14⁺外周血单核细胞和蜕膜巨噬细胞，代谢组学检测代谢物水平，发现蜕膜巨噬细胞中油酰基-L-α-溶血磷脂酸显著富集(图1A，P＝0.0433)。Real-time PCR(逆转录和PCR相关试剂购于Takara公司)检测外周单核细胞和蜕膜巨噬细胞中LPA上游关键代谢酶ENPP2、胞膜和胞内受体LPAR1和PPARγ的转录水平，结果显示蜕膜巨噬细胞中上述基因转录水平显著高于外周血单核细胞(图1B，ENPP2 P＜0.0001，LPAR1 P＝0.0035，PPARG P＝0.0002)。收集自然流产(流产次数≥3次，术后绒毛染色体检测无异常、孕前内分泌激素检查无异常)患者的蜕膜组织，分离收集蜕膜免疫细胞，磁珠分选CD14⁺巨噬细胞，并通过RT-PCR比较其与正常早孕蜕膜巨噬细胞ENPP2、LPAR1和PPARγ的转录水平，发现自然流产组蜕膜巨噬细胞ENPP2(P＝0.0006)、LPAR1(P＝0.0315)和PPARG(P＝0.0180)呈现低水平(图1C)。这些结果表明：自然流产患者蜕膜巨噬细胞中油酰基-L-α-溶血磷脂酸富集和功能异常。

实施例2

分析正常早孕和自然流产妇女蜕膜巨噬细胞驻留数量和黏附分子水平

正常早孕组和自然流产组蜕膜进行石蜡包埋切片(由武汉赛维尔生物技术公司提供技术支持)后，借助免疫组化技术检测组织局部CD68⁺巨噬细胞(抗体来源Abcam公司，1：200)，40倍镜下对每个样本随机选取多个视野进行细胞计数，求得平均值后进行比较，发现自然流产组蜕膜巨噬细胞数量较正常早组低(图2A和2B，P＝0.0442)，提示巨噬细胞驻留不良状态。Real-time PCR检测CD14⁺蜕膜巨噬细胞上黏附分子血管细胞黏附分子1(VCAM-1)、L-选择素(L-Selectin/LSEL)、细胞间黏附分子-2(ICAM-2)、E-选择素(E-Selectin/ESEL)及VE-钙粘蛋白(VE-Cadherin/CDH5)的转录水平(逆转录和PCR相关试剂购于Takara公司)。结果显示，与正常妊娠妇女相比，自然流产患者蜕膜巨噬细胞中上述黏附分子的表达普遍下降(图2C)，提示了其低黏附状态。

实施例3

体外实验验证油酰基-L-α-溶血磷脂酸促进巨噬细胞对蜕膜基质细胞的黏附

从正常早孕蜕膜组织中分离原代蜕膜基质细胞，纯化培养后经活细胞PKH67绿色染料(购于sigma公司)处理后以适当密度接种于孔板，培养过夜待其贴壁。体外对经MCSF(来源于Pepro Tech公司，50ng/mL，5天)诱导的巨噬细胞给予油酰基-L-α-溶血磷脂酸(来源于Aladdin公司，0，5或10uM)处理48小时，并经活细胞PKH26红色染料(购于sigma公司)与贴壁的蜕膜基质细胞进行黏附实验，结果显示油酰基-L-α-溶血磷脂酸可显著促进巨噬细胞对蜕膜基质细胞层面的黏附(图3，5uM P＝0.0317，10uM P＝0.0079)。

实施例4

体外实验验证油酰基-L-α-溶血磷脂酸刺激的巨噬细胞促进滋养细胞的增殖和侵袭

将经CFSE染料(购于Biolegend公司)处理的滋养细胞系接种于24孔细胞培养板下室，经油酰基-L-α-溶血磷脂酸预处理过的巨噬细胞(10uM，48小时)接种于0.4uM孔径的共培养小室(购于Corning公司)。二者经间接共培养48小时后，收集JEG3细胞，流式检测CFSE的平均荧光密度以反映其细胞增殖(图4A)。另外，经油酰基-L-α-溶血磷脂酸预处理过的巨噬细胞(10uM，48小时)与接种至麦氏胶(购于Corning公司)上的JEG3细胞进间接共培养48小时，擦去上室(8uM孔径，来源于Corning)内上层细胞，下层细胞经4％多聚甲醛固定并用结晶紫染色后，显微镜摄片以评估滋养细胞的和侵袭能力(图4C)。结果显示油酰基-L-α-溶血磷脂酸刺激后的巨噬细胞可促进JEG3细胞的增殖(图4B，P＝0.0205)和侵袭(图4D，P＝0.0069)。

实施例5

体内实验证实油酰基-L-α-溶血磷脂酸改善流产孕鼠胚胎吸收和蜕膜巨噬细胞丢失

通过构建自然流产孕鼠(CBA/J♀×DBA/2♂)模型(所有实验动物均购于北京华阜康公司)，腹腔注射生理盐水或者油酰基-L-α-溶血磷脂酸(购于sigma公司，10nmol/次，从见栓D0.5天开始，每3天腹腔注射1次至孕D13.5)。孕第13.5天取孕鼠子宫。流产孕鼠存在显著的胚胎吸收丢失，吸收胚胎因伴有缺血、出血和坏死，其体积明显小于正常存活胚胎，此外吸收胚胎与存活胚胎的色泽表现亦有明显差别，前者为黑褐色(如图5A中红色箭头所示)而后者为粉红色。油酰基-L-α-溶血磷脂酸可改善自然流产孕鼠的胚胎丢失，使其高胚胎吸收率显著降低(图5B，P＝0.0317)，且胎盘发育不良得到改善(图5C，P＝0.0364)。给予油酰基-L-α-溶血磷脂酸后，流产孕鼠子宫驻留巨噬细胞占比显著上调(P＝0.0428)且数量回升(P＝0.0435)(图5D和5E)，且子宫巨噬细胞上黏附分子E-选择素(P＝0.0136)、L-选择素(P＝0.027)、CD51(P＝0.0191)及ICAM-1(P＝0.0088)表达上调(图5F和5G)。这些结果表明，油酰基-L-α-溶血磷脂酸可通过挽救因其富集不足而导致的蜕膜巨噬细胞丢失，从而维持蜕膜免疫成分稳态，改善胚胎吸收和胎盘发育。

相对外周血单核细胞，正常早孕蜕膜巨噬细胞中油酰基-L-α-溶血磷脂酸富集；其上游关键代谢酶自毒素(编码基因为ENPP2)水平升高，且其胞膜表面受体LPAR1及胞内受体PPARγ呈现高水平。相较于正常早孕妇女，反复自然流产患者蜕膜巨噬细胞代谢酶自毒素水平及LPA受体水平均较低，提示其富集或作用受阻与该疾病相关。反复自然流产患者蜕膜组织中驻留的巨噬细胞数量减少，黏附分子表达偏低。体外实验中，油酰基-L-α-溶血磷脂酸可显著促进巨噬细胞对蜕膜基质细胞层的黏附；经油酰基-L-α-溶血磷脂酸处理后的巨噬细胞可使滋养细胞(JEG3细胞)的增殖和侵袭力明显增强。而后构建流产孕鼠模型并经体内实验证实，应用油酰基-L-α-溶血磷脂酸可通过挽救其缺乏所致的蜕膜巨噬细胞驻留减少，维持蜕膜免疫成分稳态，并显著降低孕鼠胚胎吸收率，从而改善不良妊娠结局。因此，油酰基-L-α-溶血磷脂酸有望作为自然流产的保胎药物。

本发明经体外和体内试验结果证实，自然流产患者早孕期子宫蜕膜免疫细胞中巨噬细胞油酰基-L-α-溶血磷脂酸富集和功能障碍，导致其驻留比例和能力降低。油酰基-L-α-溶血磷脂酸补充可明显提高巨噬细胞的黏附能力，挽救蜕膜巨噬细胞驻留不良，并显著改善孕鼠胚胎丢失。这些结果提示了油酰基-L-α-溶血磷脂酸可用于蜕膜巨噬细胞驻留降低所致自然流产的保胎治疗。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。