阅读说明：本技术 一种笔筒树核外dna快速提取和分析鉴别的方法 (Method for quickly extracting, analyzing and identifying DNA outside pen container tree nucleus ) 是由 张君毅 周扬 蔡邦平 刘嘉 于 2019-12-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法,通过裂解液提取破除细胞壁后的笔筒树植物样品中的总DNA,再通过0.45μm的微孔径滤膜过滤实现去除细胞核基因组,得到包括mtDNA和cpDNA在内的核外DNA；设计笔筒树mtDNA中atp1基因的特异性引物,选择植物cpDNA-trnH基因序列引物,利用两对引物分别对核外DNA进行PCR扩增并对扩增产物进行测序分析。(The invention discloses a method for quickly extracting, analyzing and identifying DNA outside a pen container tree nucleus, which comprises the steps of extracting total DNA in a pen container tree plant sample with broken cell walls by lysate, and removing a nuclear genome by filtering through a micro-aperture filter membrane of 0.45 mu m to obtain the DNA outside the nucleus including mtDNA and cpDNA; designing specific primers of atp1 gene in mtDNA of the pen container tree, selecting plant cpDNA-trnH gene sequence primers, respectively carrying out PCR amplification on extranuclear DNA by using the two pairs of primers, and carrying out sequencing analysis on the amplified product.)

一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法

技术领域

本发明涉及一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法。

背景技术

已有的线粒体DNA常见提取方法概括起来可分为密度梯度离心法、酶消化法、柱层析法、氯化铯超速离心法、碱变性法、DNase法、Triton法和改进高盐沉淀法等。其中氯化铯试剂昂贵，碱变性法和酶消化法对试验条件的要求十分严格，Triton法的产量低，易降解，密度梯度离心法操作繁杂。改进高盐沉淀法具有简便、经济、易重复等优点，被很多文献认为是较好的提取方法，但是仍然要求较高的操作环境。

目前用于高等植物叶绿体DNA提取的方法主要有DNase I法、蔗糖密度梯度离心法、Percoll梯度法、无水法、高盐低pH法等，许多植物研究中虽然已经应用这些方法，但是仍存在仪器设备要求较高，步骤繁琐，耗时较长等问题。

笔筒树的核外DNA主要指要指线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(cpDNA)，核外DNA的快速提取技术对笔筒树基因库的构建及全测序的完成至关重要。

植物核外DNA鉴别常利用叶绿体或核糖体基因序列，如matK、rbcL、ITS等。植物线粒体存在较大变异性，需费心设计相关的特异性引物。

笔筒树核外DNA的快速提取与分析有利于深入研究植物系统进化以及细胞质基因功能等的科学问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法，解决了上述背景技术中提取步骤繁琐、耗时较长的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供了一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法，包括如下步骤：

1)核外DNA的提取

通过裂解液提取破除细胞壁后的笔筒树植物样品中的总DNA，再通过0.45μm的微孔径滤膜过滤实现去除细胞核基因组，得到包括mtDNA和cpDNA在内的核外DNA；

2)核外DNA的分析鉴别

设计笔筒树mtDNA中atp1基因的特异性引物，其中

atp1(F)：TGTAGGAAAGGCCATGCCAG(SEQ ID NO：01)；

atp1(R)：TGCCCTATGCGTTGATTGGT(SEQ ID NO：02)；

选择植物trnH-psbA基因序列引物，其中

psbA(F)：GTTATGCATGAACGTAATGCTC(SEQ ID NO：03)；

trnH(R)：CGCGCATGGTGGATTCACAATCC(SEQ ID NO：04)；

利用两对引物分别对核外DNA进行PCR扩增并对扩增产物进行测序分析。

在本发明一较佳实施例中，1)核外DNA的提取包括如下步骤：

a)将笔筒树植物样品在液氮中研磨为样品粉末，破除细胞壁；转移样品粉末至离心管，加入65℃预热的裂解液，所述样品粉末与裂解液的用量比为1g：2mL；在65℃水浴30分钟，每5分钟上下颠倒摇晃离心管至均匀，过滤得到含笔筒树总DNA的滤液；

b)使用针筒过滤器通过0.45μm的微孔径滤膜过滤所述含笔筒树总DNA的滤液至离心管，并置于液氮中冻结1小时；随后将滤液室温解冻后，离心管上下颠倒2～3次，8000g转4℃的条件下离心2分钟；转移上清液至新的离心管中，加入两倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，于16800g的转速4℃条件下离心5分钟；丢弃上清液后加入洗涤液重新悬浮；将悬浮液以16800g离心一分钟，丢弃上清液后加入TE缓冲液溶解沉淀，-20℃条件下冷冻保存，得到包括mtDNA和cpDNA在内的核外DNA。

在本发明一较佳实施例中，所述笔筒树植物样品为新鲜的笔筒树叶片。

在本发明一较佳实施例中，所述步骤1)的a)中，过滤时使用两层纱布过滤，并使用裂解液冲洗纱布两次。

在本发明一较佳实施例中，所述裂解液的pH为7.6，配方为350mM的甘露醇、30mM3-吗啉丙磺酸、1mM EDTA乙二胺四乙酸、50μM PVPP交联聚乙烯吡咯烷酮和11.2μM半胱氨酸。

在本发明一较佳实施例中，所述步骤1)的b)中，洗涤液的pH为7.2，配方为300mM的甘露醇、20mM的MOPS和1mM EDTA。

在本发明一较佳实施例中，TE缓冲液的pH为8.0，配方为10mM Tris和1mM EDTA。

在本发明一较佳实施例中，所述步骤2)中，PCR扩增程序为90℃预变性4分钟，然后进行35个循环，循环程序为94℃变性30秒、55℃退火1分钟35秒、72℃延伸一分钟，最后72℃延伸10分钟。

在本发明一较佳实施例中，所述步骤2)中，将PCR的扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳。

在本发明一较佳实施例中，所述核外DNA的A260/A280比值为1.032～1.042，得率为172ng/g～255ng/g。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

1.本发明设计了针对笔筒树线粒体atp1基因的特异引物，该基因编码ATP合酶α亚基蛋白ATP1，提取出的核外DNA样品可分别进行mtDNA和cpDNA的PCR扩增，且测序效率高；

2.与已有的植物核外DNA提取方法相比，本发明先提取笔筒树材料的总DNA，再使用针筒过滤器使提取液通过0.45μm的微孔径膜，以实现去除核基因组，保留核外DNA的目的，从而简化提取步骤，缩短操作时间；

3.与已有的植物核外DNA提取方法相比，本发明提取方案中不使用β-巯基乙醇等具有强烈刺激性的有毒试剂，安全环保。

附图说明

图1为线粒体atp1目标基因片段电泳照片；

图2为trnH-psbA目标基因片段电泳照片；

图3为PCR扩增产物的测序峰图。

具体实施方式

实施例1

本实施例的一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法，以新鲜的笔筒树叶片作为植物样品，包括如下步骤：

1)核外DNA的提取

a)取新鲜的笔筒树叶片，在液氮中研磨为尽可能细的粉末；以每克样品2ml裂解液的配比向研磨好的植物样品粉末加入裂解液。

其中，裂解液的配方为：350mM甘露醇，30mM 3-吗啉丙磺酸(MOPS)，1mM EDTA乙二胺四乙酸，50μM PVPP交联聚乙烯吡咯烷酮，11.2μM半胱氨酸；pH 7.6。

将上述液体分装至离心管当中，65℃水浴30分钟，不时摇晃均匀；使用两层纱布过滤上述液体至50ml小烧杯中，裂解液冲洗纱布两次，得到含笔筒树植物样品总DNA的滤液。

b)将步骤a)得到的含笔筒树植物样品总DNA的滤液使用针筒过滤器通过0.45μm的微孔径滤膜过滤至离心管当中；离心管放入一次性手套手指处，使用橡皮筋固定在液氮罐中冻结1小时；随后在室温下解冻，倒置2～3次，8000g转速低温(4℃)离心2分钟；将上清液转移到新的离心管中，加入两倍上清液体积的无水乙醇，利用DNA在有机溶剂中的低溶解度提高得率，观察离心管内气泡产生情况或透明絮状物质；上述离心管配平后放入离心机当中，在16800g最大转速下低温离心5分钟；小心丢弃上清液，每管加入500μL洗脱液，移液枪吹打沉淀使其重新悬浮；该悬浮液以16800g离心一分钟，小心丢弃上清液；沉淀用20μL TE缓冲液重新悬浮，即得到笔筒树的核外DNA，所述核外DNA包括mtDNA和cpDNA。

其中，洗涤液的配方为：300mM甘露醇、20mM MOPS、1mM EDTA；pH 7.2；TE缓冲液的配方为：10mM Tris、1mM EDTA；pH 8.0。

2)核外DNA的分析鉴别

a)线粒体mtDNA的PCR扩增

PCR反应体系为25μL，其中包括100ngDNA，1μL的10μmol/L正向引物atp1(F)(引物序列为TGTAGGAAAGGCCATGCCAG)，1μL的10μmol/L负向引物atp1(R)(引物序列为TGCCCTATGCGTTGATTGGT)，12.5μL PCR混合剂(2×Mix)。PCR扩增程序为：95℃预变性3分钟；35个循环(94℃变性30秒，61.2℃退火30秒，72℃延伸一分钟)，最后72℃延伸10分钟。

b)叶绿体cpDNA的PCR扩增

PCR反应体系为25μL，其中包括100ng模板DNA，1μL的10μmol/L正向引物psbA(F)(引物序列为GTTATGCATGAACGTAATGCTC)，1μL的10μmol/L负向引物trnH(R)(引物序列为CGCGCATGGTGGATTCACAATCC)，12.5μL PCR混合剂(2×Mix)。PCR扩增程序为：90℃预变性4分钟；35个循环(94℃变性30秒，55℃退火1分钟35秒，72℃延伸一分钟)，最后72℃延伸10分钟。

一、DNA纯度、得率

测定笔筒树的核外DNA在260nm、280nm的光密度值，并分别通过A260、A260/A280来计算所提DNA的纯度及得率，得到核外DNA的A260/A280比值在1.032～1.042之间，得率在172ng/g～255ng/g之间。

二、PCR扩增产物的电泳分析

采用本发明方法提取的笔筒树核外DNA为模板，进行线粒体DNA的PCR扩增，结果表明6个样本的笔筒树均扩增出线粒体atp1目标基因片段，条带清晰，见图1。以相同的核外DNA为模板，进行叶绿体DNA的PCR扩增，结果表明，10个样本的笔筒树trnH-psbA均得到单一有效扩增，条带清晰，见图2。

三、测序分析

对叶绿体DNA和线粒体DNA扩增结果产物进行测序，测序峰图表明，波峰与波谷清晰，峰与峰之间的距离均匀，没有杂峰干扰。说明测序结果可靠，见图3。通过序列比对，测序结果与NCBI数据库目标基因序列相似性达到98％以上。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 华侨大学

厦门市园林植物园

<120> 一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtaggaaag gccatgccag 20

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tgccctatgc gttgattggt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gttatgcatg aacgtaatgc tc 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcgcatggt ggattcacaa tcc 23