阅读说明：本技术 基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法 (Nucleic acid detection method of digital microfluidic chip based on constant-temperature amplification and gene editing ) 是由 李博安 杨朝勇 张睿 孙珍 林康凤 郭剑光 洪欣欣 于 2019-12-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了本发明描述了基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法,所述方法包含以下试剂和步骤,包括：将待测样品的核酸、恒温扩增混合液以及基因编辑核酸检测液同时注入数字微流控芯片中相对应的位置；接着启动程序通过电流自动驱动液滴,使待检测样品的核酸液滴先与恒温扩增混合液的液滴混合并在芯片上反复流动混匀,在37-42℃,10-15分钟来进行核酸恒温扩增；随后将基因编辑核酸检测液的液滴通过电流自动驱动,并与上述混合液滴混匀,在37℃反应10-30分钟后用荧光探测装置,从而推断目的核酸的有无；该方法显示出恒温下高灵敏度和快速检测的巨大潜能,整个检测过程缩短在1小时之内,自动化程度高,不涉及开盖,杜绝气溶胶污染。(The invention discloses a nucleic acid detection method of a digital microfluidic chip based on constant-temperature amplification and gene editing, which comprises the following reagents and steps: simultaneously injecting nucleic acid of a sample to be detected, the constant-temperature amplification mixed solution and the gene editing nucleic acid detection solution into corresponding positions in the digital microfluidic chip; then starting a program to automatically drive liquid drops through current, so that the nucleic acid liquid drops of the sample to be detected are mixed with the liquid drops of the constant-temperature amplification mixed liquid and flow on the chip repeatedly and uniformly mixed, and the nucleic acid constant-temperature amplification is carried out at 37-42 ℃ for 10-15 minutes; then automatically driving the droplets of the gene editing nucleic acid detection solution by current, uniformly mixing the droplets with the mixed droplets, reacting at 37 ℃ for 10-30 minutes, and then using a fluorescence detection device to deduce the existence of the target nucleic acid; the method shows great potential of high sensitivity and rapid detection at constant temperature, shortens the whole detection process within 1 hour, has high automation degree, does not involve uncovering, and avoids aerosol pollution.)

基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法。

背景技术

随着科学技术日新月异，目前越来越多的高自动化仪器平台被发明用于解放人力、代替人类工作。数字微流控技术基于由液体表面张力引起的液滴生成，运用电场产生液体表面的极性亲水性，使液滴变平，通过电荷与电场梯度控制极化位置以生成张力梯度，使受控液滴在微流控平台表面发生移动。通过在一系列步骤中一系列层次组合并重复多次操作，得以实现复杂的实验程序自动化。数字微流控平台的通常由介电材料(如玻璃)构成，其底层为电极，负责电荷和电场梯度的积累，顶层通常涂有疏水层，用以在微滴接触点处生成低表面能。当施加电压时，电极被激活，通过沿着电极线的电荷与电场梯度变化来操纵液滴。

数字微流控技术，也称之为芯片技术，在生命科学研究领域拥有众多优势。包括其在便携性方面的高潜力，可提供高通量高自动化的检测平台以及稀有或昂贵试剂或样品消耗量的显著减少。数字微流控技术已经应用于创建免疫测定装置，数字微流控技术通过自动递送、混合、培养和洗涤芯片上的分析物，极大地简化并扩展了复杂的实验程序。

而高度自动化，快速，灵敏的核酸检测可以应用于诸多方面，例如对流行性的病原体检测，体检中对特定基因的检测，分辨基因分型，以及各种实验室的研究任务。对预防传染病的传播，疾病的早期筛查，以及加快实验室的实验进度有着重大意义。目前核酸检测的方法还停留在实时荧光定量PCR的方法，耗费时间长，步骤十分复杂，且成本较高。实时荧光定量PCR方法需要对温度进行设置，从而限制了其使用范围。同时，实时荧光定量PCR的灵敏度达不到单拷贝检出，很可能漏检极微量的核酸，同时操作中开盖会造成十分严重的气溶胶污染，对接下来的检测造成假阳性的干扰。

因此，为解决目前核酸检测耗费时间长，步骤复杂，成本较高且可能漏检极微量的核酸等问题，本发明提供了一种基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法。

发明内容

发明的目的在于提供一种基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法，解决了目前核酸检测耗费时间长，步骤复杂，成本较高且可能漏检极微量的核酸等问题。

本发明是这样实现的，本发明描述了一种在数字微流控(Digitalmicrofluidics,DMF)芯片平台上结合恒温扩增与基因编辑技术进行核酸检测的方法，所述方法包含以下试剂和步骤，包括：将待测样品的核酸、恒温扩增混合液以及基因编辑核酸检测液同时注入数字微流控芯片中相对应的位置；接着启动程序通过电流自动驱动液滴，使待检测样品的核酸液滴先与恒温扩增混合液的液滴混合并在芯片上反复流动混匀，在37-42℃，10-15分钟来进行核酸恒温扩增；随后将基因编辑核酸检测液的液滴通过电流自动驱动，并与上述混合液滴混匀，在37℃反应10-30分钟后用荧光探测装置，如荧光显微镜、蓝光、紫外灯等探测芯片上混合液滴的荧光，从而推断目的核酸的有无。

所述操作系统中，数字微流控平台包含数字微流控仪器，芯片，以及电脑端控制软件。芯片由两部分组成，分别为上极板和下极板。上极板为玻璃材质，其中一面覆盖一层氧化铟锡(ITO)膜以及特氟龙形成的疏水层；下极板基底材质为玻璃，上面依次覆盖金属铬电极、保护电极的介质层、特氟龙形成的疏水层。上极板与下极板之间距离约360um，用硅油填充缝隙。

所述的待测核酸为DNA或RNA。

所述的恒温扩增混合液包括：重组酶，辅助蛋白，单链DNA结合蛋白，DNA聚合酶，正向引物，反向引物以及反应缓冲液。如果模板是RNA核酸扩增反应溶液还需要逆转录酶。其中逆转录酶将RNA转化为DNA，前后引物，uvs X蛋白，uvs Y蛋白，gp32蛋白保证了核酸的恒温扩增，从而增加了被基因编辑酶Cas12a蛋白识别的概率。

进一步地，所述的恒温扩增混合液包括：80-600ng/ul重组酶T4噬菌体uvs X蛋白或大肠杆菌RecA，20-380ng/ul辅助蛋白T4噬菌体uvs Y蛋白，200-800ng/ul单链结合蛋白gp32，10-300ng/ul DNA聚合酶，0.2-0.6uM正向引物，0.2-0.6uM反向引物以及反应缓冲液。如果模板是RNA核酸扩增反应溶液还需要10-600ng/ul逆转录酶。

所述的反应缓冲液包括：MgAc，Tris-HCl，DTT，聚乙二醇，乙酸钾，ATP，dNTPs，磷酸肌酸，肌酸激酶。

进一步地，所述的反应缓冲液包括：5-20mM MgAc，20-200mM Tris-HCl，1-10mMDTT，4-12％(w/v)聚乙二醇，20-100mM乙酸钾，1-20mM ATP，0.1-4mM dNTPs，10-100mM磷酸肌酸，10-80ug/U肌酸激酶,缓冲液的PH值为7.5-8.5。

所述的基因编辑核酸检测液包括：引导RNA(crRNA)，荧光探针，基因编辑酶Cas12a蛋白。

进一步地，所述的基因编辑核酸检测液包括：100-800nM引导RNA(crRNA)，10-400nM荧光探针，50-500ng/ul基因编辑酶Cas12a蛋白。其中，基因编辑酶为Cas12a蛋白来自于毛螺菌科细菌：Lachnospiraceae bacterium ND2006。经基因工程将Cas12a蛋白基因克隆到大肠杆菌中进行大量提纯。

所述的荧光探针，其碱基长度为5，序列为TTATT或TCCCT或TTCTT，一端含有荧光基团修饰：5-FAM或FITC，另一端含有淬灭基团修饰：BHQ1或TAMRA。进一步地探测荧光的装置，可以为荧光显微镜、蓝光、紫外灯或其他任何能够读取芯片上荧光的仪器。

本发明的有益效果：本发明采用的方法显示出恒温下高灵敏度和快速检测的巨大潜能，且结合数字微流控平台将整个检测过程缩短在45分钟之内，检测全程高度自动化，反应全部在芯片内，不涉及开盖，杜绝气溶胶污染。并且微流控芯片所需的无论是待测样本的核酸、酶或反应液都是极其微量的，极大的降低了核酸检测的成本。解决了目前核酸检测耗费时间长，步骤复杂，成本较高且可能漏检极微量的核酸等问题。

附图说明

图1是本发明提供的微流控芯片极板对应位置示意图；

图2是本发明提供的基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测流程示意图；

图3是本发明提供的检测鼻咽拭子样本中肺炎支原体DNA的结果图；

图4是本发明提供的检测呼吸道分泌物中甲型与乙型流感病毒RNA的结果图；

图5是本发明提供的检测血清中乙型肝炎病毒DNA的结果图；

图6是本发明提供的检测植物中烟草花叶病毒RNA的结果图；

图7是本发明检测呼吸道分泌物中甲型流感病毒灵敏度的结果图；

图8是对照运用实时荧光定量PCR检测呼吸道分泌物中甲型流感病毒灵敏度的结果图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，及本发明较为优选的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，本发明的保护范围并不局限于本文所描述的实施例。相反地，提供以下具体实施例的目的是对本发明的内容理解更加全面透彻。

除非另有定义，本文所使用的所有的科学技术术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意和所有的组合。

实施例一：鼻咽拭子中肺炎支原体的检测

准备1份肺炎支原体病毒培养液(已灭活)作为阳性对照，1份已用荧光定量PCR确诊的肺炎支原体感染的鼻咽拭子样本与1份健康人的鼻咽拭子样本作为阴性对照(拭子保存于hanks液或生理盐水中)，充分震荡后将拭子沿离心管壁按压使得拭子上的液体完全压出。接着运用天根试剂盒Hi-Swab DNA Kit高效口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(DP362)提取上述3组样本中的核酸，操作严格按照说明书描述的步骤。

在PCR管中配制恒温扩增混合液，所用的恒温扩增液包含重组酶T4噬菌体uvs X蛋白，辅助蛋白T4噬菌体uvs Y蛋白，单链结合蛋白gp32，DNA聚合酶bsu，正向引物，反向引物，以及反应缓冲液；反应缓冲液包括MgAc，Tris-HCl，DTT，聚乙二醇，乙酸钾，ATP，dNTPs，磷酸肌酸，肌酸激酶。其中重组酶T4噬菌体uvs X蛋白的质量浓度为80ng/ul，辅助蛋白T4噬菌体uvs Y蛋白的质量浓度为40ng/ul，单链结合蛋白gp32的质量浓度为500ng/ul，DNA聚合酶bsu的质量浓度为100ng/ul，正向引物的摩尔浓度为0.4uM，反向引物的摩尔浓度为0.4uM；其中反应缓冲液的MgAc的摩尔浓度为14mM，Tris-HCl的摩尔浓度50mM，DTT的摩尔浓度为5mM，聚乙二醇的质量体积比为7％，乙酸钾的摩尔浓度为50mM，ATP的摩尔浓度为6mM，dNTPs的摩尔浓度为1.2mM，磷酸肌酸的摩尔浓度为50mM，肌酸激酶的酶活为20ug/U，反应缓冲液的pH值为8.0；

同时在另一个PCR管中配置基因编辑核酸检测液，所用的基因编辑核酸检测液包含Cas12a基因编辑酶，引导RNA(crRNA)，荧光探针。其中Cas12a基因编辑酶的质量浓度为120ng/ul。引导RNA(crRNA)的摩尔浓度为0.6uM，荧光探针的摩尔浓度为0.2uM。

将芯片放入数字微流控仪器上并安装，上下极板之间注满硅油，连接电脑控制系统。并将上述准备好的样本核酸、配置好的恒温扩增混合液、及基因编辑核酸检测液各7ul注入微流控芯片相对应的区域。

通过电脑控制系统启动程序，首先操纵2ul样本核酸液滴与2ul恒温扩增混合液液滴在芯片中央位置混合，并于37℃反应15分钟，反应后控制液滴一分为二，一份移动到废液池，一份继续留在芯片中央位置。

接着操纵2ul基因编辑核酸检测液液滴移动到芯片中央位置，与上述溶液混合，并于37℃反应30分钟，反应后结束后该混合液移动到检测区检测。

通过图3荧光显微镜的拍摄图像结果分析，发现待测样本与阳性对照肺炎支原体阳性病毒培养液的样本均呈现强烈的荧光，检测结果为阳性；而1份健康人的鼻咽拭子样本并未出现荧光信号，检测结果为阴性。与实际用荧光定量PCR确诊的结果相一致，准确性好。整个检测过程缩短在45分钟之内，检测全程高度自动化，反应全部在芯片内，不涉及开盖，杜绝气溶胶污染。并且微流控芯片所需的无论是待测样本的核酸、酶或反应液都是极其微量的，极大的降低了核酸检测的成本。解决了目前核酸检测耗费时间长，步骤复杂，成本较高且可能漏检极微量的核酸等问题。

实施例二：呼吸道分泌物中甲型与乙型流感病毒的检测

准备1份甲型流感病毒培养液(已灭活)作为阳性对照，1份已用荧光定量PCR确诊的甲型流感感染的分泌物样本，1份已用荧光定量PCR确诊的乙型流感感染的分泌物样本，与1份健康人的呼吸道分泌物样本作为阴性对照。接着运用天根试剂盒病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(DP315)提取上述4组样本中的核酸，操作严格按照说明书描述的步骤。

在PCR管中配制恒温扩增混合液，所用的恒温扩增液包含重组酶T4噬菌体uvs X蛋白，辅助蛋白T4噬菌体uvs Y蛋白，单链结合蛋白gp32，DNA聚合酶bsu，逆转录酶MMLV，正向引物，反向引物，以及反应缓冲液；反应缓冲液包括MgAc，Tris-HCl，DTT，聚乙二醇，乙酸钾，ATP，dNTPs，磷酸肌酸，肌酸激酶。其中重组酶T4噬菌体uvs X蛋白的质量浓度为100ng/ul，辅助蛋白T4噬菌体uvs Y蛋白的质量浓度为50ng/ul，单链结合蛋白gp32的质量浓度为400ng/ul，DNA聚合酶bsu的质量浓度为160ng/ul，逆转录酶MMLV的质量浓度为350ng/ul，正向引物的摩尔浓度为0.46uM，反向引物的摩尔浓度为0.46uM；其中反应缓冲液的MgAc的摩尔浓度为14mM，Tris-HCl的摩尔浓度10mM，DTT的摩尔浓度为10mM，聚乙二醇的质量体积比为5％，乙酸钾的摩尔浓度为20mM，ATP的摩尔浓度为10mM，dNTPs的摩尔浓度为2mM，磷酸肌酸的摩尔浓度为80mM，肌酸激酶的酶活为40ug/U，反应缓冲液的pH值为7.9；

同时在另一个PCR管中配置基因编辑核酸检测液，所用的基因编辑核酸检测液包含Cas12a基因编辑酶，引导RNA(crRNA)，荧光探针。其中Cas12a基因编辑酶的质量浓度为100ng/ul。引导RNA(crRNA)的摩尔浓度为0.5uM，荧光探针的摩尔浓度为0.2uM。

将芯片放入数字微流控仪器上并安装，上下极板之间注满硅油，连接电脑控制系统。并将上述准备好的样本核酸、配置好的恒温扩增混合液、及基因编辑核酸检测液各7ul注入微流控芯片相对应的区域。

通过电脑控制系统启动程序，首先操纵2ul样本核酸液滴与2ul恒温扩增混合液液滴在芯片中央位置混合，并于42℃反应15分钟，反应后控制液滴一分为二，一份移动到废液池，一份继续留在芯片中央位置。

接着操纵2ul基因编辑核酸检测液液滴移动到芯片中央位置，与上述溶液混合，并于37℃反应30分钟，反应后结束后该混合液移动到检测区检测。

通过图4荧光显微镜的拍摄图像结果分析，发现待测样本与阳性对照均呈现强烈的荧光，检测结果为阳性；而1份健康人的呼吸道分泌物样本并未出现荧光信号，检测结果为阴性。与实际用荧光定量PCR确诊的结果相一致，准确性好。整个检测过程缩短在45分钟之内，检测全程高度自动化，反应全部在芯片内，不涉及开盖，杜绝气溶胶污染。并且微流控芯片所需的无论是待测样本的核酸、酶或反应液都是极其微量的，极大的降低了核酸检测的成本。解决了目前核酸检测耗费时间长，步骤复杂，成本较高且可能漏检极微量的核酸等问题。

实施例三：血清中乙型肝炎HBV病毒的检测

准备1份乙型肝炎HBV病毒培养液(已灭活)作为阳性对照，1份已用荧光定量PCR确诊的乙型肝炎HBV病毒感染的血清样本与1份健康人的血清样本作为阴性对照。接着运用天根试剂盒TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒(DP316)提取上述3组样本中的核酸，操作严格按照说明书描述的步骤。

在PCR管中配制恒温扩增混合液，所用的恒温扩增液包含重组酶T4噬菌体uvs X蛋白，辅助蛋白T4噬菌体uvs Y蛋白，单链结合蛋白gp32，DNA聚合酶bsu，正向引物，反向引物，以及反应缓冲液；反应缓冲液包括MgAc，Tris-HCl，DTT，聚乙二醇，乙酸钾，ATP，dNTPs，磷酸肌酸，肌酸激酶。其中重组酶T4噬菌体uvs X蛋白的质量浓度为60ng/ul，辅助蛋白T4噬菌体uvs Y蛋白的质量浓度为30ng/ul，单链结合蛋白gp32的质量浓度为200ng/ul，DNA聚合酶bsu的质量浓度为180ng/ul，正向引物的摩尔浓度为0.36uM，反向引物的摩尔浓度为0.36uM；其中反应缓冲液的MgAc的摩尔浓度为14mM，Tris-HCl的摩尔浓度10mM，DTT的摩尔浓度为8mM，聚乙二醇的质量体积比为6％，乙酸钾的摩尔浓度为25mM，ATP的摩尔浓度为8mM，dNTPs的摩尔浓度为2mM，磷酸肌酸的摩尔浓度为80mM，肌酸激酶的酶活为25ug/U，反应缓冲液的pH值为8.0；

同时在另一个PCR管中配置基因编辑核酸检测液，所用的基因编辑核酸检测液包含Cas12a基因编辑酶，引导RNA(crRNA)，荧光探针。其中Cas12a基因编辑酶的质量浓度为100ng/ul。引导RNA(crRNA)的摩尔浓度为0.5uM，荧光探针的摩尔浓度为0.18uM。

将芯片放入数字微流控仪器上并安装，上下极板之间注满硅油，连接电脑控制系统。并将上述准备好的样本核酸、配置好的恒温扩增混合液、及基因编辑核酸检测液各7ul注入微流控芯片相对应的区域。

通过电脑控制系统启动程序，首先操纵2ul样本核酸液滴与2ul恒温扩增混合液液滴在芯片中央位置混合，并于37℃反应15分钟，反应后控制液滴一分为二，一份移动到废液池，一份继续留在芯片中央位置。

接着操纵2ul基因编辑核酸检测液液滴移动到芯片中央位置，与上述溶液混合，并于37℃反应30分钟，反应后结束后该混合液移动到检测区检测。

通过图5荧光显微镜的拍摄图像结果分析，发现待测样本与阳性对照均呈现强烈的荧光，检测结果为阳性；而1份健康人的血清样本并未出现荧光信号，检测结果为阴性。与实际用荧光定量PCR确诊的结果相一致，准确性好。整个检测过程缩短在45分钟之内，检测全程高度自动化，反应全部在芯片内，不涉及开盖，杜绝气溶胶污染。并且微流控芯片所需的无论是待测样本的核酸、酶或反应液都是极其微量的，极大的降低了核酸检测的成本。解决了目前核酸检测耗费时间长，步骤复杂，成本较高且可能漏检极微量的核酸等问题。

实施例四：烟草叶片上的烟草花叶病毒的检测

准备1份烟草花叶病毒病毒培养液(已灭活)作为阳性对照，1份已用荧光定量PCR确诊的烟草花叶病毒感染的样本，与1份健康叶片作为阴性对照。接着运用天根试剂盒病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(DP315)提取上述4组样本中的核酸，操作严格按照说明书描述的步骤。

在PCR管中配制恒温扩增混合液，所用的恒温扩增液包含重组酶T4噬菌体uvs X蛋白，辅助蛋白T4噬菌体uvs Y蛋白，单链结合蛋白gp32，DNA聚合酶bsu，逆转录酶MMLV，正向引物，反向引物，以及反应缓冲液；反应缓冲液包括MgAc，Tris-HCl，DTT，聚乙二醇，乙酸钾，ATP，dNTPs，磷酸肌酸，肌酸激酶。其中重组酶T4噬菌体uvs X蛋白的质量浓度为80ng/ul，辅助蛋白T4噬菌体uvs Y蛋白的质量浓度为40ng/ul，单链结合蛋白gp32的质量浓度为220ng/ul，DNA聚合酶bsu的质量浓度为200ng/ul，逆转录酶MMLV的质量浓度为320ng/ul，正向引物的摩尔浓度为0.4uM，反向引物的摩尔浓度为0.4uM；其中反应缓冲液的MgAc的摩尔浓度为14mM，Tris-HCl的摩尔浓度50mM，DTT的摩尔浓度为5mM，聚乙二醇的质量体积比为6％，乙酸钾的摩尔浓度为30mM，ATP的摩尔浓度为12mM，dNTPs的摩尔浓度为2.2mM，磷酸肌酸的摩尔浓度为80mM，肌酸激酶的酶活为50ug/U，反应缓冲液的pH值为7.9；

同时在另一个PCR管中配置基因编辑核酸检测液，所用的基因编辑核酸检测液包含Cas12a基因编辑酶，引导RNA(crRNA)，荧光探针。其中Cas12a基因编辑酶的质量浓度为120ng/ul。引导RNA(crRNA)的摩尔浓度为0.5uM，荧光探针的摩尔浓度为0.2uM。

将芯片放入数字微流控仪器上并安装，上下极板之间注满硅油，连接电脑控制系统。并将上述准备好的样本核酸、配置好的恒温扩增混合液、及基因编辑核酸检测液各7ul注入微流控芯片相对应的区域。

通过电脑控制系统启动程序，首先操纵2ul样本核酸液滴与2ul恒温扩增混合液液滴在芯片中央位置混合，并于42℃反应15分钟，反应后控制液滴一分为二，一份移动到废液池，一份继续留在芯片中央位置。

接着操纵2ul基因编辑核酸检测液液滴移动到芯片中央位置，与上述溶液混合，并于37℃反应30分钟，反应后结束后该混合液移动到检测区检测。

通过图6荧光显微镜的拍摄图像结果分析，发现待测样本与阳性对照均呈现强烈的荧光，检测结果为阳性；而1份健康叶片的核酸提取样本并未出现荧光信号，检测结果为阴性。与实际用荧光定量PCR确诊的结果相一致，准确性好。整个检测过程缩短在45分钟之内，检测全程高度自动化，反应全部在芯片内，不涉及开盖，杜绝气溶胶污染。并且微流控芯片所需的无论是待测样本的核酸、酶或反应液都是极其微量的，极大的降低了核酸检测的成本。解决了目前核酸检测耗费时间长，步骤复杂，成本较高且可能漏检极微量的核酸等问题。

实施例五：本发明方法与实时定量荧光PCR检测甲型流感病毒质粒灵敏度的对比结果

为对比本发明方法检测病毒核酸的灵敏度，准备甲型流感病毒质粒Matrix gene分别稀释浓度为100000copies、10000copies、1000copies、100copies、10copies、1copy、0.1copy与阴性对照。分别采用本发明方法与实时定量荧光PCR进行灵敏度的检测对比。

本发明的具体操作步骤见实施例二。

实时定量荧光PCR的操作包括以下步骤：取2ul对应浓度的质粒作为模板，加入PCR反应管中，同时加入已配好的PCR反应液(购买自康为世纪Goldstar Probe Mixture)。具体地，PCR反应液包括：WHO流感病毒分子检测手册(2017修订)建议的0.3uM FluA上游引物FluA F：

CCMAGGTCGAAACGTAYGTTCTCTCTATC；0.3uM下游引物FluA R：TGACAGRATYGGTCTTGTCTTTAGCCAYTCCA；0.1uM探针FluA P：(FAM)-ATYTCGGCTTTGAGGGGGCCTG-(MGB)；25ul 2*Taqman mixture；灭菌纯化水补齐至50ul。

于ABI7500或宏石SLAN96P荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增。具体地，扩增程序包括：程序1.预变性95℃，10分钟循环数1；程序2.变性95℃，15秒钟与退火60℃，1分钟循环数40。

通过图7荧光显微镜的拍摄图像结果分析，本发明方法检测甲型流感病毒质粒的最低检测浓度为1copy；而通过图8实时荧光定量PCR的检测结果分析，实时荧光定量PCR的最低检测浓度为100copies。说明本发明在恒温下具有优于实时荧光定量PCR的高灵敏度，且整个检测过程缩短在45分钟之内，对比实时荧光定量PCR的1小时40分钟用时更短，检测全程高度自动化。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有的可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明思路的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权力要求为准。