一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用
阅读说明：本技术 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用 (Cyclodextrin glucosyltransferase mutant and application thereof ) 是由 韩瑞枝 柴宝成 倪晔 于 2019-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用,属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明CGTase突变体对长链糖基化染料木素的产物特异性高；利用本发明的CGTase突变体A156V/L174P、A156V/L174P/A166Y、A156V/L174P/A166V、A156V/L174P/A166G和A156V/L174P/A166K分别以麦芽糊精作为糖基供体,以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量较利用野生型环糊精葡萄糖基转移酶以麦芽糊精作为糖基供体,以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量分别提高了62.5％、165％、112.5％、112.5％和59.4％。(The invention discloses a cyclodextrin glucosyltransferase mutant and application thereof, belonging to the technical field of enzyme engineering and microbial engineering. The CGTase mutant has high product specificity on long-chain glycosylation genistein; the yields of the long-chain glycosylated genistein produced by using the CGTase mutants A156V/L174P, A156V/L174P/A166Y, A156V/L174P/A166V, A156V/L174P/A166G and A156V/L174P/A166K of the invention respectively take maltodextrin as glycosyl donors, and the yields of the long-chain glycosylated genistein produced by using genistein as glycosyl acceptor are respectively improved by 62.5%, 165%, 112.5% and 59.4% compared with the yields produced by using wild-type cyclodextrin glucosyltransferase and taking maltodextrin as glycosyl donor.)
技术领域
本发明涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。
背景技术
染料木素(又名金雀异黄素、染料木黄酮等)被认为是活性功能最高的大豆异黄酮类物质，常以其葡萄糖苷衍生物即染料木苷(又名4',5,7-三羟异黄酮-7-糖苷)的形式存在于槐角、山豆根等豆科植物中。
染料木素在人体及动物细胞中具有广泛的药理学功效，主要表现为：(1)具有化学防癌(乳腺癌和***癌等)作用。染料木素具有类***及抗激素作用，可以抑制肿瘤细胞合成过程中相关酶的活性，在肿瘤细胞形成过程中抑制肿瘤血管增生，延缓或阻止肿瘤变成癌细胞。(2)可以预防心血管疾病。染料木素会激发低密度的脂蛋白受体产生正向调节作用，同时可以促进胆固醇的清除，抑制血小板的凝集，对于动脉粥样硬化等疾病具有预防和治疗作用。(3)可以预防绝经后疾病。染料木素是典型的植物***，所具有的***活性能够缓解妇女更年期综合症及预防绝经后疾病。(4)抗骨质疏松作用。染料木素的***活性能够激活***受体，提高成骨细胞活性；另外还可以增加骨密度，抑制骨量丢失，对骨质疏松具有较好的改善作用。因此，染料木素在医药领域具有极高的应用前景。
然而，染料木素具有很强疏水性，几乎不溶于水，在一般的有机溶媒中溶解度较差，这大大限制了其作为口服药物及静脉注射药剂的药用效果，限制了其在医药领域中的应用。因此，如何提高染料木素在水溶液中的溶解度，成为目前国内外关注的焦点。
目前，有研究表明，二葡萄糖基染料木素和三葡萄糖基染料木素在水中的溶解度分别是染料木素的3700倍和44000倍(具体可见参考文献：Li D,Roh SA,Shim JH,MikamiB,Baik MY,Park CS,Park KH.2005.Glycosylation of genistin into solubleinclusion complex form of cyclic glucans by enzymatic modification.JAgricFood Chem 53:6516-24)。也有研究表明，将染料木素进行糖基化并不影响其生理生化功能(具体可见参考文献：Chung MJ,KangAY,Lee KM,Oh E,Jun HJ,Kim SY,Auh JH,Moon TW,Lee SJ,Park KH.2006.Water-soluble genistin glycoside isoflavones up-regulateantioxidant metallothionein expression and scavenge free radicals.JAgric FoodChem 54:3819-26)。并且，有研究表明，糖基化染料木素在体内内会水解为可被人体吸收的葡萄糖与染料木素，安全性较高(具体可见参考文献：Chung MJ,KangAY,Lee KM,Oh E,JunHJ,Kim SY,Auh JH,Moon TW,Lee SJ,Park KH.2006.Water-soluble genistin glycosideisoflavones up-regulate antioxidant metallothionein expression and scavengefree radicals.JAgric Food Chem 54:3819-26)。因此，可通过将染料木素进行糖基化以提高其水溶性。
环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase，简称CGTase或CGT酶，EC2.4.1.19)是常见的可催化糖基化反应的酶，可使用此酶对染料木素进行糖基化。但是，现有的环糊精葡萄糖基转移酶合成长链糖基染料木素效率较低，合成短链糖基染料木素效率较高，而研究表明，糖基化染料木素所连糖链越长，水溶性越好(具体可见参考文献：Li D,Roh SA,Shim JH,Mikami B,Baik MY,Park CS,Park KH.2005.Glycosylation ofgenistin into soluble inclusion complex form of cyclic glucans by enzymaticmodification.J Agric Food Chem53:6516-24)。因此，急需找到一种对长链糖基化染料木素产物特异性高的环糊精葡萄糖基转移酶以早日实现长链糖基染料木素的大规模工业化生产。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种对长链糖基化染料木素产物特异性高的环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase，简称CGTase或CGT酶，EC2.4.1.19)。
[技术方案]
为解决上述技术问题，本发明提供了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第156位丙氨酸以及第174位亮氨酸进行突变得到的；
或者，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第156位丙氨酸、第174位亮氨酸以及第166位丙氨酸进行突变得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第156位丙氨酸突变为缬氨酸以及第174位亮氨酸突变为脯氨酸得到的，命名为A156V/L174P；
或者，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第156位丙氨酸突变为缬氨酸、第174位亮氨酸突变为脯氨酸以及第166位丙氨酸突变为酪氨酸得到的，命名为A156V/L174P/A166Y；
或者，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第156位丙氨酸突变为缬氨酸、第174位亮氨酸突变为脯氨酸以及第166位丙氨酸突变为缬氨酸得到的，命名为A156V/L174P/A166V；
或者，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第156位丙氨酸突变为缬氨酸、第174位亮氨酸突变为脯氨酸以及第166位丙氨酸突变为甘氨酸得到的，命名为A156V/L174P/A166G；
或者，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第156位丙氨酸突变为缬氨酸、第174位亮氨酸突变为脯氨酸以及第166位丙氨酸突变为赖氨酸得到的，命名为A156V/L174P/A166K。
在本发明的一种实施方式中，编码所述环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了编码上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因。
本发明还提供了携带上述基因的重组质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET-20b(+)质粒、pET-22b(+)质粒或pET-28a(+)质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET-20b(+)质粒。
本发明还提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
本发明还提供了上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备方法，所述方法为将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，获得发酵液；将发酵液进行离心，获得发酵上清液；将发酵上清液进行分离，获得上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体。
本发明还提供了一种生产长链糖基化染料木素的方法，所述方法为以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体，在含有麦芽糊精和染料木素的反应体系中加入上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体进行反应，得到反应液；将反应液进行分离，获得长链糖基化染料木素。所述长链糖基化染料木素是指四糖基化染料木素、五糖基化染料木素和/或六糖基化染料木素。
本发明还提供了上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述制备方法或上述生产长链糖基化染料木素的方法在生产长链糖基化染料木素中的应用。
[有益效果]
本发明环糊精葡萄糖基转移酶突变体对长链糖基化染料木素的产物特异性高；利用本发明的环糊精葡萄糖基转移酶突变体A156V/L174P、A156V/L174P/A166Y、A156V/L174P/A166V、A156V/L174P/A166G和A156V/L174P/A166K分别以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量较利用野生型环糊精葡萄糖基转移酶以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量分别提高了62.5％、165％、112.5％、112.5％和59.4％。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的大肠杆菌JM109以及大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自北纳生物，pET-20b(+)质粒购自Novagen公司。(上述菌株大肠杆菌E.coli BL21(DE3)可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、氨苄青霉素100μg·L-1。
LB固体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、琼脂粉15g·L-1、氨苄青霉素100μg·L-1。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
环糊精葡萄糖基转移酶酶活测定方法：取酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用50mM磷酸缓冲液(pH 6.5)配制的浓度为30g·L-1的可溶性淀粉溶液中，在40℃下反应10min后，加入1.0mL 1.0M的盐酸停止反应，再加入1.0mL用50mM磷酸缓冲液配制的0.1mM甲基橙，在16℃下保温20min，在505nm下测定吸光度。
环糊精葡萄糖基转移酶酶活的定义：在该条件下每分钟生成1μmolα-环糊精所需酶量为一个酶活力单位。
实施例1：不同环糊精葡萄糖基转移酶的制备及表达
具体步骤如下：
化学合成编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的基因(基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)；将获得的基因与pET-20b(+)质粒经双酶切(NcoI和Xho I)后进行连接，转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，获得测序正确的重组质粒pET20b-CGT；将测序正确的重组质粒pET20b-CG转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，即获得重组大肠杆菌pET20b-CGT/E.coliBL21。
利用全质粒PCR技术，以获得的重组质粒pET20b-CGT为模板进行定点突变，获得突变体A156V/L174P(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)、A156V/L174P/A166Y(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)、A156V/L174P/A166V(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)、A156V/L174P/A166G(氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)、A156V/L174P/A166K(氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)、A156S、A156L以及L174M；
其中，突变A156V所用引物如下：
正向引物：5’-GCAGAAAATGGTGTTCTGTAT-3’(SEQ ID No.8)；
反向引物：5’-GTTATCATACAGAACACCATT-3’(SEQ ID No.9)；
突变L174P所用引物如下：
正向引物：5'-GACACCGCTGGCCCGTTCCAT-3'(SEQ ID No.10)；
反向引物：5'-GTTGTGATGGAACGGGCCAGC-3'(SEQ ID No.11)；
突变A166Y所用引物如下：
正向引物：5'-TCACTGCTGGGTTACTACTCGAAT-3'(SEQ ID No.12)；
反向引物：5'-GTCATTCGAGTAGTAACCCAGCAG-3'(SEQ ID No.13)；
突变A166V所用引物如下：
正向引物：5'-TCACTGCTGGGTGTTTACTCGAAT-3'(SEQ ID No.14)；
反向引物：5'-GTCATTCGAGTAAACACCCAGCAG-3'(SEQ ID No.15)；
突变A166G所用引物如下：
正向引物：5'-TCACTGCTGGGTGGTTACTCGAAT-3'(SEQ ID No.16)；
反向引物：5'-GTCATTCGAGTAACCACCCAGCAG-3'(SEQ ID No.17)；
突变A166K所用引物如下：
正向引物：5'-TCACTGCTGGGTAAATACTCGAAT-3'(SEQ ID No.18)；
反向引物：5'-GTCATTCGAGTATTTACCCAGCAG-3'(SEQ ID No.19)；
突变A156S所用引物如下：
正向引物：5'-GCAGAAAATGGTTCTCTGTAT-3'(SEQ ID No.20)；
反向引物：5'-GTTATCATACAGAGAACCATT-3'(SEQ ID No.21)；
突变A156L所用引物如下：
正向引物：5'-GCAGAAAATGGTCTGCTGTAT-3'(SEQ ID No.22)；
反向引物：5'-GTTATCATACAGCAGACCATTG-3'(SEQ ID No.23)；
突变L174M所用引物如下：
正向引物：5'-GACACCGCTGGCATGTTCCAT-3'(SEQ ID No.24)；
反向引物：5'-GTTGTGATGGAACATGCCAGC-3'(SEQ ID No.25)，
PCR反应体系均为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus)5μL，2.5mM dNTPs 4μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA 1μL，2.5U/μLPrimeSTAR Taq HS 0.5μL，加入双蒸水至50μL；
PCR产物扩增条件均为：98℃预变性3min；随后进行98℃10s，57℃15s，72℃6min，30个循环；最后72℃保温10min。
PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结束后，向10μL扩增产物中加入0.5μL甲基化模板消化酶(Dpn I)，枪头吹吸进行混匀，于37℃条件下反应1.5h，将Dpn I处理后的扩增产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，获得测序正确的含有编码突变体A156V/L174P、A156V/L174P/A166Y、A156V/L174P/A166V、A156V/L174P/A166G、A156V/L174P/A166K、A156S、A156L以及L174M的基因的重组质粒；将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，即获得含有编码突变体A156V/L174P、A156V/L174P/A166Y、A156V/L174P/A166V、A156V/L174P/A166G、A156V/L174P/A166K、A156S、A156L以及L174M的基因的重组大肠杆菌。
将获得的重组大肠杆菌pET20b-CGT/E.coli BL21以及编码突变体A156V/L174P、A156V/L174P/A166Y、A156V/L174P/A166V、A156V/L174P/A166G、A156V/L174P/A166K、A156S、A156L以及L174M的基因的重组大肠杆菌涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，获得单菌落；挑取单菌落接入LB液体培养基，于37℃培养12～14h，获得种子液；将种子液按照4％(v/v)的接种量接入LB液体培养基，于30℃、120rpm培养至OD600＝0.6后，在发酵液中加入终浓度为0.01mM的IPTG，于25℃、120rpm继续诱导培养90h，得到发酵液；将发酵液于4℃、1000rpm离心20min后，收集发酵上清液；在发酵上清液中加入70％固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心20min，取沉淀物用适量含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH7.4的缓冲液A溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用缓冲液A、含20～480mM咪唑的缓冲液A、含480mM咪唑的缓冲液A的洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含环糊精葡萄糖基转移酶酶活的洗脱液；活力组分在50mM磷酸钠缓冲液(pH＝6)中透析过夜后，分别得到突变体A156V/L174P、A156V/L174P/A166Y、A156V/L174P/A166V、A156V/L174P/A166G、A156V/L174P/A166K、A156S、A156L以及L174M的纯酶，并冻干备用。
实施例2：不同环糊精葡萄糖基转移酶对长链糖基化染料木素的产物特异性
具体步骤如下：
将染料木素(购自Sigma公司)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中配制成终浓度为7.5g/L的染料木素溶液；将麦芽糊精(购自上海生工生物工程有限公司)溶解于PBS缓冲液(50mM，pH 6.5)中配制成终浓度为40g/L的麦芽糊精溶液；分别将实施例1获得的冻干后的突变体A156V/L174P、A156V/L174P/A166Y、A156V/L174P/A166V、A156V/L174P/A166G、A156V/L174P/A166K、A156S、A156L以及L174M的纯酶溶解于PBS缓冲液(50mM，pH 6.5)中配制成终浓度为15U/L的CGTase酶液；分别取300μL染料木素溶液，500μL麦芽糊精溶液和200μLCGTase酶液混合于2mL的带盖小管内，放于40℃、120rpm摇床缓慢振荡20～24h，得到反应液。
通过HPLC检测反应液中短链糖基化染料木素(此处短链糖基化染料木素为一糖基化染料木素、二糖基化染料木素和三糖基化染料木素的混合物)和长链糖基化染料木素(此处长链糖基化染料木素为四糖基化染料木素、五糖基化染料木素和六糖基化染料木素的混合物)的摩尔含量，并计算反应液中短链糖基化染料木素和长链糖基化染料木素的摩尔含量占反应液中总糖基化染料木素摩尔含量的比例(％)以及反应液中短链糖基化染料木素以及长链糖基化染料木素的含量(g/L)，检测结果见表1-2；其中，HPLC检测反应液中短链糖基化染料木素以及长链糖基化染料木素的含量占反应液中总糖基化染料木素含量的比例(％)的方法为：反应液通过0.22μm滤膜过滤，使用Amethyst C18-H柱(4.6×250mm,Sepax,America)检测(具体检测条件见表3)；其中，长链糖基化染料木素的含量＝六糖基化染料木素的摩尔含量×六糖基化染料木素的分子量+五糖基化染料木素的摩尔含量×五糖基化染料木素的分子量+四糖基化染料木素的摩尔含量×四糖基化染料木素的分子量，短链糖基化染料木素的含量＝三糖基化染料木素的摩尔含量×三糖基化染料木素的分子量+二糖基化染料木素的摩尔含量×二糖基化染料木素的分子量+一糖基化染料木素的摩尔含量×一糖基化染料木素的分子量。
由表1-2可知，仅有突变体A156V/L174P、A156V/L174P/A166Y、A156V/L174P/A166V、A156V/L174P/A166G、A156V/L174P/A166K对长链糖基化染料木素的产物特异性高较野生型有了明显的提高；
其中，利用突变体A156V/L174P以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量较利用野生型环糊精葡萄糖基转移酶以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量提高了62.5％；
利用突变体A156V/L174P/A166Y以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量较利用野生型环糊精葡萄糖基转移酶以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量提高了165％；
利用突变体A156V/L174P/A166V以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量较利用野生型环糊精葡萄糖基转移酶以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量提高了112.5％；
利用突变体A156V/L174P/A166G以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量较利用野生型环糊精葡萄糖基转移酶以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量提高了37.5％；
利用突变体A156V/L174P/A166K以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量较利用野生型环糊精葡萄糖基转移酶以麦芽糊精作为糖基供体，以染料木素作为糖基受体生产长链糖基化染料木素的产量提高了59.4％。
表1不同环糊精葡萄糖基转移酶反应得到的反应液中短链糖基化染料木素以及长链糖基化染料木素的摩尔含量占反应液中总糖基化染料木素摩尔含量的比例(％)
组别
长链基染料木素
短链糖基化染料木素
野生型
15
85
A156S
7
93
A156L
5
95
L174M
6
94
A156V/L174P
25
75
A156V/L174P/A166V
29
71
A156V/L174P/A166G
20
80
A156V/L174P/A166K
24
76
A156V/L174P/A166Y
40
60
表2不同环糊精葡萄糖基转移酶反应得到的反应液中短链糖基化染料木素以及长链糖基化染料木素的含量(g/L)
表3 HPLC检测反应液中短链糖基化染料木素以及长链糖基化染料木素的含量的条件
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用
<160> 25
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ser Pro Asp Thr Ser Val Asp Asn Lys Val Asn Phe Ser Thr Asp Val
1 5 10 15
Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ala Asp Gly Asp Arg Thr Asn
20 25 30
Asn Pro Ala Gly Asp Ala Phe Ser Gly Asp Arg Ser Asn Leu Lys Leu
35 40 45
Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp Gly
50 55 60
Tyr Leu Thr Gly Met Gly Val Thr Ala Leu Trp Ile Ser Gln Pro Val
65 70 75 80
Glu Asn Ile Thr Ser Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ser
85 90 95
Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Gln Thr Asn Asp Ala Phe
100 105 110
Gly Asp Phe Ala Asp Phe Gln Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His
115 120 125
Asn Ile Lys Val Val Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala
130 135 140
Asp Arg Asp Asn Pro Gly Phe Ala Glu Asn Gly Ala Leu Tyr Asp Asn
145 150 155 160
Gly Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Ser Asn Asp Thr Ala Gly Leu Phe His
165 170 175
His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asp Gly Ile Tyr Lys
180 185 190
Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Ile Asn His Asn Asn Asn Ala Met Asp
195 200 205
Ala Tyr Phe Lys Ser Ala Ile Asp Leu Trp Leu Gly Met Gly Val Asp
210 215 220
Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys
225 230 235 240
Ser Phe Val Ser Ser Ile Tyr Gly Gly Asp His Pro Val Phe Thr Phe
245 250 255
Gly Glu Trp Tyr Leu Gly Ala Asp Gln Thr Asp Gly Asp Asn Ile Lys
260 265 270
Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Asn Leu Leu Asp Phe Glu Tyr Ala Gln
275 280 285
Glu Val Arg Glu Val Phe Arg Asp Lys Thr Glu Thr Met Lys Asp Leu
290 295 300
Tyr Glu Val Leu Ala Ser Thr Glu Ser Gln Tyr Asp Tyr Ile Asn Asn
305 310 315 320
Met Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Gln Val Ala
325 330 335
Gly Ser Gly Thr Arg Ala Thr Glu Gln Ala Leu Ala Leu Thr Leu Thr
340 345 350
Ser Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr
355 360 365
Gly Asp Gly Asp Pro Asn Asn Arg Ala Met Met Thr Ser Phe Asn Thr
370 375 380
Gly Thr Thr Ala Tyr Lys Val Ile Gln Ala Leu Ala Pro Leu Arg Lys
385 390 395 400
Ser Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Thr Thr Thr Glu Arg Trp Val Asn
405 410 415
Asn Asp Val Leu Ile Ile Glu Arg Lys Phe Gly Ser Ser Ala Ala Leu
420 425 430
Val Ala Ile Asn Arg Asn Ser Ser Ala Ala Tyr Pro Ile Ser Gly Leu
435 440 445
Leu Ser Ser Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Ser Asp Val Leu Asn Gly Leu
450 455 460
Leu Asn Gly Asn Ser Ile Thr Val Gly Ser Gly Gly Ala Val Thr Asn
465 470 475 480
Phe Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Pro
485 490 495
Glu Thr Ser Pro Ala Ile Gly Asn Val Gly Pro Thr Met Gly Gln Pro
500 505 510
Gly Asn Ile Val Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Gly Thr Ala Gly
515 520 525
Thr Val Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ser Gly Ile Val Ser
530 535 540
Trp Glu Asp Thr Gln Ile Lys Ala Val Ile Pro Lys Val Ala Ala Gly
545 550 555 560
Lys Thr Gly Val Ser Val Lys Thr Ser Ser Gly Thr Ala Ser Asn Thr
565 570 575
Phe Lys Ser Phe Asn Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe
580 585 590
Leu Val Asn Gln Ala Asn Thr Asn Tyr Gly Thr Asn Val Tyr Leu Val
595 600 605
Gly Asn Ala Ala Glu Leu Gly Ser Trp Asp Pro Asn Lys Ala Ile Gly
610 615 620
Pro Met Tyr Asn Gln Val Ile Ala Lys Tyr Pro Ser Trp Tyr Tyr Asp
625 630 635 640
Val Ser Val Pro Ala Gly Thr Lys Leu Asp Phe Lys Phe Ile Lys Lys
645 650 655
Gly Gly Gly Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Gly Asn His Thr Tyr Thr
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<210> 2
<211> 2061
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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gtcacggacc gttttgcgga tggtgaccgc accaacaatc cggcaggcga tgctttcagc 120
ggtgaccgtt ctaatctgaa actgtatttt ggcggtgatt ggcagggcat tatcgataaa 180
attaacgacg gttacctgac cggcatgggt gtgacggcgc tgtggatcag ccaaccggtg 240
gaaaacatca cctcagttat caaatactcg ggcgtcaaca atacgtctta tcatggttac 300
tgggcccgtg attttaaaca gaccaacgac gcgtttggcg atttcgccga ctttcaaaat 360
ctgattgata ccgcacatgc tcacaacatt aaagtggtta tcgatttcgc cccgaaccac 420
acctctccgg cagatcgcga caatccgggc tttgcagaaa atggtgctct gtatgataac 480
ggctcactgc tgggtgcata ctcgaatgac accgctggcc tgttccatca caacggcggt 540
acggatttta gtaccattga agacggtatc tataaaaatc tgtacgatct ggctgacatc 600
aaccataaca ataacgcgat ggatgcctat ttcaaatcag caattgacct gtggctgggc 660
atgggtgttg atggcatccg ctttgacgcg gtcaaacaca tgccgttcgg ttggcagaaa 720
tcgtttgtga gcagcattta tggcggtgat cacccggttt ttaccttcgg cgaatggtat 780
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atggtgacct tcatcgacaa tcacgatatg gaccgttttc aggttgcggg ctcaggtacg 1020
cgcgccaccg aacaagcgct ggcactgacg ctgacctcgc gtggcgttcc ggcgatttat 1080
tacggcaccg aacagtatat gacgggcgat ggtgacccga ataaccgcgc catgatgacg 1140
agtttcaata ccggcaccac ggcatataaa gtgattcaag cactggctcc gctgcgtaaa 1200
tccaacccgg caatcgccta cggcaccacc accgaacgtt gggtgaataa cgatgttctg 1260
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tttaccctgg cagcgggcgg caccgcagtt tggcagtata cggctccgga aaccagcccg 1500
gcgatcggta atgtcggtcc gacgatgggc caaccgggta acattgtgac gatcgatggt 1560
cgtggtttcg gcggtacggc tggcaccgtg tactttggta cgaccgcggt caccggcagt 1620
ggtattgtgt cctgggaaga tacgcagatt aaagcggtca tcccgaaagt ggcagctggc 1680
aaaaccggtg tcagcgtgaa aacgagttcc ggcaccgcca gtaatacgtt caaatccttt 1740
aacgttctga ccggtgatca ggttacggtc cgctttctgg tcaaccaagc gaataccaac 1800
tatggcacga atgtttacct ggtcggcaac gcggccgaac tgggttcctg ggacccgaat 1860
aaagccattg gtccgatgta taaccaggtt atcgcaaaat acccgagctg gtattacgat 1920
gtgagcgttc cggcgggcac caaactggac ttcaaattca ttaaaaaagg cggtggcacg 1980
gtgacctggg aaggtggcgg taaccatacc tacacgaccc cggcgagcgg cgttggcacg 2040
gtgacggtgg attggcaaaa t 2061
<210> 3
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
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50 55 60
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115 120 125
Asn Ile Lys Val Val Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala
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530 535 540
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Lys Thr Gly Val Ser Val Lys Thr Ser Ser Gly Thr Ala Ser Asn Thr
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Phe Lys Ser Phe Asn Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe
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<211> 687
<212> PRT
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<211> 687
<212> PRT
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<211> 687
<212> PRT
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1 5 10 15
Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ala Asp Gly Asp Arg Thr Asn
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Asn Pro Ala Gly Asp Ala Phe Ser Gly Asp Arg Ser Asn Leu Lys Leu
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Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp Gly
50 55 60
Tyr Leu Thr Gly Met Gly Val Thr Ala Leu Trp Ile Ser Gln Pro Val
65 70 75 80
Glu Asn Ile Thr Ser Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ser
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Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Gln Thr Asn Asp Ala Phe
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Gly Asp Phe Ala Asp Phe Gln Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His
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Asn Ile Lys Val Val Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala
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Asp Arg Asp Asn Pro Gly Phe Ala Glu Asn Gly Val Leu Tyr Asp Asn
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Gly Ser Leu Leu Gly Lys Tyr Ser Asn Asp Thr Ala Gly Pro Phe His
165 170 175
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Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Ile Asn His Asn Asn Asn Ala Met Asp
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Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys
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Ser Phe Val Ser Ser Ile Tyr Gly Gly Asp His Pro Val Phe Thr Phe
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tcactgctgg gtgtttactc gaat 24
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