阅读说明：本技术 一种治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物组合物及其制备方法 (Pharmaceutical composition for treating liver ischemia reperfusion injury and preparation method thereof ) 是由 姜力群 王云 白玉婷 王子尧 杨玲 张咪 周峰 张召辉 于 2019-11-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物组合物及其制备方法,其中,一种治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物组合物,其包括,壳聚糖、醛类、阿魏酸；按质量份数计,所述壳聚糖、醛类、阿魏酸的组成比例为：(20～40)：(0.1～5)：(2～40)；一种治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物组合物的制备方法,其包括,将醛类搅拌溶解；加入壳聚糖搅拌；加入阿魏酸搅拌；按质量份数计,所述壳聚糖、醛类、阿魏酸的组成比例为：(20～40)：(0.1～5)：(2～40)。该药物组合物可直接用于口服和静脉注射,可有效调控肝脏巨噬细胞分型,将M1型巨噬细胞诱导为M2型,对肝缺血再损伤具有明显的治疗作用。(The invention discloses a pharmaceutical composition for treating liver ischemia-reperfusion injury and a preparation method thereof, wherein the pharmaceutical composition for treating liver ischemia-reperfusion injury comprises chitosan, aldehydes and ferulic acid; the chitosan, the aldehydes and the ferulic acid comprise the following components in parts by weight: (20-40): (0.1-5): (2-40); a preparation method of a pharmaceutical composition for treating liver ischemia reperfusion injury comprises dissolving aldehydes under stirring; adding chitosan and stirring; adding ferulic acid and stirring; the chitosan, the aldehydes and the ferulic acid comprise the following components in parts by weight: (20-40): (0.1-5): (2-40). The pharmaceutical composition can be directly used for oral administration and intravenous injection, can effectively regulate and control liver macrophage typing, induces M1 type macrophage to M2 type macrophage, and has obvious therapeutic effect on liver ischemia re-injury.)

一种治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于肝脏缺血再灌注损伤的医药技术领域，具体涉及一种治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物组合物及其制备方法。

背景技术

肝脏缺血再灌注损伤是指肝脏在缺血缺氧达到一定时间和程度时，引起细胞发生病理性改变，在恢复血液供应后，病变的细胞不一定能恢复功能，反而出现损伤进一步加重的现象。临床上肝脏手术常常需要部分或完全阻断肝脏血流，因而肝脏缺血再灌注损伤的发生常常不可避免。多项研究表明，肝脏缺血再灌注发生过程中，大量肝脏巨噬细胞发生M1极化，通过特定方法诱导肝脏巨噬细胞M2型极化，减少肝脏中M1型巨噬细胞比例，可对肝脏缺血再灌注损伤起到有效的缓解作用。

本发明公开了一种具有肝脏缺血再灌注损伤治疗作用的组合物及其制备方法，该组合物可有效作用于肝脏巨噬细胞，将肝脏巨噬细胞由促炎症M1型诱导为抑制炎症的M2型。动物实验表明通过静脉注射，该混合物可显著降低肝脏手术中缺血再灌注后血液中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)等肝损伤指标，对肝缺血再损伤具有明显的治疗作用。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物组合物及其制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物组合物，其包括，壳聚糖、醛类、阿魏酸；按质量份数计，所述壳聚糖、醛类、阿魏酸的组成比例为：(20～40)：(0.1～5)：(2～40)。

作为本发明所述的治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物组合物的优选方案，其中：所述壳聚糖，其为1kDa～500kDa的壳聚糖、壳寡糖及其各种盐型，所述醛包括甲醛、多聚甲醛、戊二醛等单醛或多醛中的一种或几种。

作为本发明所述的治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物组合物的优选方案，其中：还包括纳米级磁性物质，按质量份数计，所述纳米级磁性物质、壳聚糖、醛类、阿魏酸的组成比例为：(20～40)：(20～40)：(0.1～5)：(2～40)。

作为本发明所述的治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物组合物的优选方案，其中：所述纳米级磁性物质为纳米级铁氧化物，其粒径范围为2～50nm。

作为本发明所述的治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物组合物的优选方案，其中：所述纳米级磁性物质纳米级铁氧化物包括γ-Fe₂O₃、β-Fe₂O₃或Fe₃O₄中的一种或几种，其粒径范围为2～50nm。

作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物组合物的制备方法，其包括，将醛类搅拌溶解；加入壳聚糖搅拌；加入阿魏酸搅拌；按质量份数计，所述壳聚糖、醛类、阿魏酸的组成比例为：(20～40)：(0.1～5)：(2～40)。

作为本发明所述的治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物组合物的制备方法的优选方案，其中：还包括，先制备纳米级磁性物质分散液，再将所述醛类搅拌溶解于所述分散液中；按质量份数计，所述纳米级磁性物质、壳聚糖、醛类、阿魏酸的组成比例为：(20～40)：(20～40)：(0.1～5)：(2～40)。

作为本发明所述的治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物组合物的制备方法的优选方案，其中：所述纳米级磁性物质纳米级铁氧化物包括γ-Fe₂O₃、β-Fe₂O₃或Fe₃O₄中的一种或几种，其粒径范围为2～50nm。

作为本发明所述的治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物组合物的制备方法的优选方案，其中：所述将醛类搅拌溶解，其搅拌时间为0.5～1.5h，所述加入壳聚糖搅拌，其搅拌时间为0.1～2h，所述加入阿魏酸搅拌，其搅拌时间为0.1～2h。

作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物组合物的应用，其中，所述组合物可直接用于口服和静脉注射。

本发明的有益效果：

本发明公开的组合物，可有效调控肝脏巨噬细胞分型，将M1型巨噬细胞诱导为M2型，具体表现为组合物可显著提高巨噬细胞IL-10的基因表达水平，并且显著提高细胞表面CD206表达。该组合物可通过静脉给药，给药后可集中分布于肝脏，通过对肝脏巨噬细胞分型的调控作用，降低肝脏手术中缺血再灌注后血液中AST和ALT等肝损伤指标，对肝缺血再损伤具有明显的治疗作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为实施例1制得的组合物的粒径图；

图2为实施例1制得的组合物的电位图；

图3为RT-PCR检测实施例1制得的组合物对M1型RAW264.7细胞IL-10基因表达的影响结果；

图4为实施例3中M1型RAW264.7细胞对施例1制得的组合物的摄取结果；

图5为实施例1制得的组合物对M1型RAW264.7细胞分型表面标志物CD206表达的影响；

图6为实施例1制得的组合物对小鼠肝脏缺血再灌注损伤的ALT和AST指标影响结果；

图7为实施例6制得的组合物的粒径图；

图8为实施例6制得的组合物的电位图；

图9为实施例7制得的组合物的粒径图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1：组合物的制备

本发明采用以下方法制备组合物：将50mg的γ-Fe₂O₃(20nm)于10mL的1％醋酸溶液中室温搅拌1h使其均匀分散，加入10μL的25％戊二醛搅拌1h后，加入5mL10mg/mL的分子量50Kda的壳聚糖溶液，搅拌0.5h后，再加入20mg阿魏酸，继续搅拌1h后，磁铁富集组合物，去除未富集部分，以生理盐水充分散富集的组合物。制备得到的组合物粒径为195.4nm(图1)，Zeta电位为24.2mV(图2)。

实施例2：RT-PCR检测组合物对M1型巨噬细胞分型的调节作用

组合物A制备：于10mL的1％醋酸溶液中加入10μL的25％戊二醛搅拌均匀，加入5mL10mg/mL的分子量50Kda的壳聚糖溶液，搅拌0.5h后，5000转/分钟离心10分钟富集组合物，以生理盐水充分散富集的组合物。

组合物B制备：于10mL的1％醋酸溶液中加入10μL的25％戊二醛搅拌1h后，加入5mL10mg/mL的分子量50Kda的壳聚糖溶液，搅拌0.5h后，再加入20mg阿魏酸，继续搅拌1h后，5000转/分钟离心10分钟富集组合物，以生理盐水充分散富集的组合物。

将RAW264.7细胞以1×10⁶个/孔的密度接种于6孔板，过夜培养后洗去血清，加入脂多糖(LPS)将巨噬细胞由M0型激活为M1型，并分别加入组合物A、组合物B以及实施例1制得的组合物，继续孵育24h。提取细胞RNA，RT-PC测定细胞内IL-10基因表达情况。引物序列如下：

GAPDH-F:TCA ACG GCA CAG TCA AGG

GAPDH-R:ACT CCA CGA CAT ACT CAG

IL-10-F:CAC AAA GCA GCC TTG CAG AA

IL-10-R:AGA GCA GGC AGC ATA GCA GT

实验结果如图3所示。从图3左图中可以看出，当添加量150、250μg/ml时，实施例1所制得的组合物可显著提高巨噬细胞IL-10的基因表达水平，表明巨噬细胞由M1型向M2型转化，而当添加量为50μg/ml时(图中未展示)，IL-10的基因表达水平变化并不显著；从图3右图中可以看出，浓度为150μg/ml的仅含壳聚糖和戊二醛的组合物A或仅含壳聚糖、阿魏酸、戊二醛的组合物B同相同浓度的实施例1组合物相比，其IL-10的RNA相对表达量分别为24.6、32.4和41.3，，表明本发明所公开的组合物与其中部分成份的组合相比具有更高的促巨噬细胞由M1型转化为M2型的作用。

实施例3：巨噬细胞对组合物的摄取情况：

将LPS处理后的RAW264.7细胞分别以2×10⁵个/孔的密度接种于24孔板中，过夜培养后洗去血清，加入接有FITC的实施例1制得的组合物继续孵育。24h后倒置荧光显微镜观察巨噬细胞对纳米粒的摄取情况。结果如图4所示，细胞内可见明显的绿色荧光，表明该组合物可被巨噬细胞摄取。

实施例4：组合物对巨噬细胞表面抗原的影响：

将RAW264.7接种于6孔板，过夜培养后，加入实施例1制得的组合物共孵育24h。消化细胞，加入-20℃预冷的丙酮100μL破膜，加入100μL3％BSA-PBS封闭细胞后，加入FITC-CD206抗体孵育后，流式细胞仪检测细胞表面CD206表达。结果如图5所示，可见明组合物可显著提高巨噬细胞表面M2型标志物表达，表明组合物可将巨噬细胞由M1型转化为M2型。

实施例5：组合物对肝脏缺血再灌注模型小鼠AST与ALT指标的影响

组合物A制备：于10mL的1％醋酸溶液中加入10μL的25％戊二醛搅拌均匀，加入5mL10mg/mL的分子量50Kda的壳聚糖溶液，搅拌0.5h后，5000转/分钟离心10分钟富集组合物，以生理盐水充分散富集的组合物。

组合物B制备：于10mL的1％醋酸溶液中加入10μL的25％戊二醛搅拌1h后，加入5mL10mg/mL的分子量50Kda的壳聚糖溶液，搅拌0.5h后，再加入20mg阿魏酸，继续搅拌1h后，5000转/分钟离心10分钟富集组合物，以生理盐水充分散富集的组合物。

小鼠肝缺血再灌注模型的建立：选用30g左右的雄性昆明小鼠，采用腹腔内注射水合氯醛进行麻醉固定，中上腹备皮、消毒，腹白线正中切口，充分暴露术野，仔细剥离肝下缘组织，将覆盖在门静脉的胃肠道移出腹腔，使门静脉暴露，用无创动脉夹夹闭肝总动脉与门静脉，造成血管堵塞，待缺血区肝叶颜色由鲜红色变为暗红色，表明肝脏缺血模型成功，持续夹闭15min。取下无创动脉夹，恢复肝脏供血后，以温生理盐水使小鼠腹腔复温，分层缝合关腹。

小鼠给药：于造模前连续4天尾静脉分别注射组合物A、组合物B、实施例1制得的组合物，每天注射一次(80mg/kg)。于给药最后一天造模，造模6h后摘眼球取静脉血，检测血液中AST与ALT指标。如图6所示，术前连续4天静脉注射给药后，空白组、模型组、组合物A组、组合物B组和实施例1组的小鼠血清ALT含量分别为44、1960、1516、1192和396U/L，其AST含量分别为72、2152、1876、1604和744U/L，表明本发明公开的含有铁氧化物、壳聚糖、阿魏酸、戊二醛的组合物较其中某几种的组合对肝缺血再灌注损伤具有更好的保护作用。

本发明发现壳聚糖可显著降低肝缺血再损伤模型鼠血液中AST与ALT的水平，而铁氧化物和阿魏酸又进一步增强了壳聚糖对肝缺血再灌注损伤的保护作用，使治疗效果显著提升。这可能是因为壳聚糖作用于肝脏Kupffer细胞，诱导该细胞由促进炎症的M1型分化为抵抗炎症的M2型，从而减轻缺血再灌注所导致的肝损伤，铁氧化物和阿魏酸可分别增强壳聚糖对Kupffer细胞分型的调节作用(详见实施例2)，进而增强壳聚糖对肝损伤的保护。同时阿魏酸作用于肝实质细胞，可通过可上调该细胞Bal-2蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)等的表达，减少膜间隙细胞色素-c(cyt-c)的损失和线粒体损伤，而减少肝细胞凋亡，可进一步增强组合物对缺氧再灌注导致的肝损伤的保护。因此，本发明公开的含有铁氧化物、壳聚糖、阿魏酸、戊二醛的组合物较其中某几种的组合对肝缺血再灌注损伤具有更好的保护作用。

实施例6：

本发明采用以下方法制备混合物：将50mg的Fe₃O₄(50nm)于10mL的1％醋酸溶液中室温搅拌1h使其均匀分散，加入10μL的25％多聚甲醛搅拌1h后，加入5mL10mg/mL分子量为2KDa壳寡糖溶液，搅拌0.5h后，再加入20mg阿魏酸，继续搅拌1h后，磁铁富集组合物，去除未富集部分，以生理盐水充分散富集的组合物。制备得到的组合物粒径为238.1nm(图7)，Zeta电位为18.1mV(图8)。

实施例7：

本发明采用以下方法制备混合物：将50mg的Fe₃O₄(80nm)于10mL的1％醋酸溶液中室温搅拌1h使其均匀分散，加入50μL的25％戊二醛搅拌1h后，加入5mL10mg/mL的壳聚糖溶液，搅拌0.5h后，再加入50mg阿魏酸，继续搅拌1h后，以磁铁富集组合物，发现无法富集组合物，以5000转/分钟离心10分钟富集组合物，以生理盐水充分散富集的组合物，组合物发生明显絮凝，絮凝后组合物粒径为1353nm，达不到静脉给药要求(图9)，但可用于口服，对于症状轻微的肝脏缺血再灌注损伤进行治疗、预防。

目前存在口服壳聚糖进行四氯化碳导致的肝脏损伤的治疗，但四氯化碳导致的肝损伤是化学性肝损伤，而本发明所涉及的缺氧再灌注肝损伤，是缺氧、缺血以及在再灌注过程中由物理、生化等综合因素所导致的肝损伤。缺氧再灌注肝损伤与化学性肝损伤的发病机制以及治疗方法均不相同。而虽然已有报道阿魏酸对于治疗缺氧再灌注肝损伤有一定效果，但其主要作用于肝实质细胞，无法解决缺氧再灌注肝损伤中巨噬细胞M1极化问题。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。