壳寡糖双胍衍生物在制备治疗肝脏胰岛素抵抗药物中的应用
阅读说明：本技术 壳寡糖双胍衍生物在制备治疗肝脏胰岛素抵抗药物中的应用 (Application of chitosan oligosaccharide biguanide derivative in preparation of medicine for treating liver insulin resistance ) 是由 刘晓非 赵励彦 郑淇方 王园园 邹雅露 刘宇星 于 2019-08-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开壳寡糖双胍衍生物在制备治疗肝脏胰岛素抵抗药物中的应用,将壳寡糖与盐酸在微波装置中搅拌反应,之后加入双氰胺水溶液,使用盐酸调节溶液pH,在微波装置中搅拌反应,得到壳寡糖双胍衍生物。在本发明中,建立2型糖尿病大鼠模型,壳寡糖双胍衍生物以灌胃的方式给药,经过衍生物治疗后,胰岛素水平增加,使得外周组织对胰岛素的敏感性增加；同时,IRS-2色氨酸位点磷酸化激活,进而激活PI3K-Akt胰岛素信号传导通路,一方面提高了下游信号蛋白GLUT-2的表达,增加了肝脏对葡萄糖的摄取；另一方面,抑制了PEPCK和G6Pase的表达,进而抑制肝脏糖异生,最终发挥对肝脏胰岛素抵抗的治疗作用。(The invention discloses an application of a chitosan oligosaccharide biguanide derivative in preparing a medicament for treating liver insulin resistance. In the invention, a type 2diabetes rat model is established, the chitosan oligosaccharide biguanide derivative is administrated in a gastric perfusion mode, and after the treatment of the derivative, the insulin level is increased, so that the sensitivity of peripheral tissues to insulin is increased; meanwhile, IRS-2 tryptophan site phosphorylation is activated, and then a PI3K-Akt insulin signal conduction pathway is activated, so that on one hand, the expression of downstream signal protein GLUT-2 is improved, and the glucose uptake of the liver is increased; on the other hand, the expression of PEPCK and G6Pase is inhibited, and then hepatic gluconeogenesis is inhibited, and finally, the therapeutic effect on hepatic insulin resistance is exerted.)
技术领域
本发明属于药学领域，具体涉及一种壳寡糖双胍衍生物的微波合成制备方法及其在制备治疗肝脏胰岛缺陷药物方面的应用。
背景技术
作为慢性代谢疾病，胰岛素抵抗(IR)和胰腺β-细胞损伤目前被认为是2型糖尿病(T2DM)的发病机理(Kim,E.-A.,Lee,S.-H.,Lee,J.-H.,Kang,N.,et al.,A marine algalpolyphenol,dieckol,attenuates blood glucose levels by Akt pathway in alloxaninduced hyperglycemia zebrafish model[J].RSC Advances,2016,6,78570-78575)。肝脏作为胰岛素作用和体内能量平衡的主要器官，在胰岛素抵抗中起重要作用，因此，干预肝脏胰岛素抵抗可有效预防代谢型疾病的发生。
已有研究表明，在肝脏中，胰岛素的作用主要表现在IRS/PI3K/Akt信号通路(Gao,Y.-f.,Zhang,M.-n.,Wang,T.-x.,Wu,T.-c.,et al.,Hypoglycemic effect of D-chiro-inositol in type 2diabetes mellitus rats through the PI3K/Akt signalingpathway[J].Molecular and cellular endocrinology,2016,433,26-34)。胰岛素是信号传导途径的起始因子，其在结合肝胰岛素受体后磷酸化胰岛素底物并激活PI3K/Akt信号传导途径。PI3K是介导胰岛素抵抗的关键蛋白之一，当激活时，它介导Akt活化并影响2型葡萄糖转运蛋白(GLUT-2)和葡萄糖激酶(GCK)的表达(Motoyoshi,S.,Shirotani,T.,Araki,E.,Sakai,K.,et al.,Cellular characterization of pituitary adenoma cell line(AtT20cell)transfected with insulin,glucose transporter type 2(GLUT2)andglucokinase genes:insulin secretion in response to physiologicalconcentrations of glucose[J].Diabetologia,1998,41,1492-1501)。其中，GLUT-2对于葡萄糖进入肝脏并无限制作用，但却是葡萄糖有肝脏输出入血的过程中关键的限速开关(Cohen,M.,Kitsberg,D.,Tsytkin,S.,Shulman,M.,et al.,Live imaging ofGLUT2glucose-dependent trafficking and its inhibition in polarized epithelialcysts[J].Open biology,2014,4,140091)，在被上游分子调节后，细胞外葡萄糖可以通过GLUT-2转运到细胞中进行储存，这可以降低血糖。有证据表明只有GLUT-2和GCK正常表达时才能确保胰岛素的正常分泌；此外，活化的Akt还可以促进肝细胞胞浆内FoxO1的磷酸化，抑制其转核，导致核内FoxO1与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)的启动子相互作用受阻，最终影响糖异生关键酶PEPCK和G6Pase的表达，从而调节肝脏糖异生(Kim,S.J.,Quan,H.Y.,Jeong,K.J.,Kim,D.Y.,et al.,Beneficial effect ofbetulinic acid on hyperglycemia via suppression of hepatic glucose production[J].Journal of agricultural and food chemistry,2013,62,434-442)。以上各个通路共同作用，维持肝脏血糖浓度稳态，因此，对肝脏PI3K-Akt信号通路进行干预对有效治疗2型糖尿病具有极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供壳寡糖双胍衍生物在制备治疗肝脏胰岛素抵抗药物中的应用。
需要说明的是本发明中使用的壳寡糖双胍衍生物采用本课题组在先申请的技术方案“壳寡糖双胍衍生物及其微波合成方法”(申请号2017108673840，申请日2017年9月22日)，使用微波合成方法将经典糖尿病治疗药物二甲双胍的双胍结构引入壳寡糖中，该产物既具有胍基的治疗糖尿病肝损伤的功效，又具有壳寡糖的天然性、安全性和独特的生物活性，且能够缓解双胍药物对胃肠道的刺激副作用，该方法生产效率高，操作工艺简单，反应过程清洁环保，产品性能好。
壳寡糖双胍衍生物，以壳寡糖和双氰胺为原料制备，以壳寡糖侧基NH2和双氰胺在盐酸和微波条件下进行反应并形成与壳寡糖键接的双胍基团，如下化学式所示：
壳寡糖是自然界中唯一带有正电荷的碱性氨基寡糖，它的分子量小，溶解性很好，容易被生物体吸收利用，重均分子量为3000以下，优选1500～3000Da，脱乙酰度在97％以上，优选97～99％。
壳寡糖双胍衍生物中，双胍取代度为40～60％，优选45～55％。
上述化学式中m和n分别为壳寡糖中乙酰化单元和脱乙酰化单位的聚合度。
壳寡糖双胍衍生物的制备方法，按照下述步骤进行：将壳寡糖分散在盐酸中并在微波160W～560W条件下搅拌，进行第一步微波反应；之后加入双氰胺水溶液并使用盐酸调整反应体系pH值为1～2，继续在微波160W～560W条件下搅拌，进行第二步微波反应，以使壳寡糖和双氰胺反应制备壳寡糖双胍衍生物，具体如下式所示：
其中在第一步微波反应中，微波功率为300～400w，反应时间为3～7min，优选5～7min，搅拌速度为每分钟100～200rpm。
在第二步微波反应中，微波功率为300～400w，反应时间为10～20min，优选15～20min，搅拌速度为每分钟100～200rpm。
反应结束后，将反应液冷却至室温，对混合溶液进行醇沉，烘干，研磨，得到壳寡糖双胍衍生物粉末。
双氰胺与壳寡糖中氨基的摩尔比为(0.5～3):1，优选(1～3):1，更加优选1:1。
盐酸为0.2～0.8mol/L的HCl水溶液，使用盐酸调整反应体系pH值为1。
本发明生产效率高，操作工艺简单，反应过程清洁环保，产品性能好。经动物实验证实，本发明中的壳寡糖双胍衍生物在建立2型糖尿病大鼠模型后，灌胃给药，经过衍生物治疗后，胰岛素水平增加，使得外周组织对胰岛素的敏感性增加；同时，IRS-2色氨酸473号位点磷酸化激活，进而激活PI3K-Akt胰岛素信号传导通路，一方面提高了下游信号蛋白GLUT-2和GCK的表达，增加了肝脏对葡萄糖的摄取；另一方面，抑制了PEPCK和G6Pase的表达，进而抑制肝脏糖异生。最终发挥对肝脏胰岛素抵抗的治疗作用，且与单独使用传统糖尿病治疗药物二甲双胍相比，壳寡糖双胍衍生物治疗效果更佳，即本发明的壳寡糖双胍衍生物在制备治疗肝脏胰岛素抵抗药物中的应用。
附图说明
图1为本发明中原料壳寡糖(COS)与壳寡糖双胍盐酸盐(COSG)的红外光谱的对照谱线图。
图2为本发明中原料壳寡糖(COS)与壳寡糖双胍盐酸盐(COSG)的核磁碳谱的对照谱线图。
图3为本发明中COSG对STZ诱导的糖尿病大鼠的体重、空腹血糖和尿糖的影响数据图，其中(a)为体重，(b)为空腹血糖，(c)为尿糖，数据是均值±标准差，n＝6，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001和空白对照组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和模型组相比。
图4为本发明中COSG对STZ诱导糖尿病大鼠胰岛素(a)和HOMA-IR(b)的影响数据图，其中数据是均值±标准差，n＝6，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001和空白对照组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和模型组相比。
图5为本发明中STZ诱导的糖尿病大鼠中IRS-2(a)，Akt和p-Akt(ser473)(b)的蛋白印迹分析；STZ诱导的糖尿病大鼠中IRS-2(c)，Akt(d)，p-Akt(ser473)(e)和p-Akt(ser473)/Akt(f)的蛋白表达定量分析的数据柱状图，其中数据是均值±标准差，n＝6，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001和空白对照组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和模型组相比。
图6为本发明中STZ诱导的糖尿病大鼠中GLUT-2的蛋白印迹分析(a)，GLUT-2蛋白表达定量分析(b)以及GCK表达定量分析(c)数据图，其中数据是均值±标准差，n＝6，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001和空白对照组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和模型组相比。
图7是本发明中COSG对STZ诱导的糖尿病大鼠的PEPCK(a)，G6Pase(b)和肝糖原(c)的影响数据柱状图，其中数据是均值±标准差，n＝6，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001和空白对照组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和模型组相比。
具体实施方式
下面是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。在制备得到壳寡糖双胍衍生物之后，本课题组陆续针对壳寡糖双胍衍生物的药用价值进行测试和评价，如在先中国专利申请“壳寡糖双胍衍生物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用”(申请号2017108663660，申请日2017年9月22日)、“壳寡糖双胍衍生物在制备治疗脂代谢紊乱药物中的应用”(申请号2017108917900，申请日2017年9月27日)、“壳寡糖双胍衍生物在制备治疗胰岛缺陷药物中的应用”(申请号2018111171793，申请日2018年9月25日)、“壳寡糖双胍衍生物在制备抑制细胞凋亡药物中的应用”(申请号2018111202043，申请日2018年9月25日)、“壳寡糖双胍衍生物在制备治疗骨骼肌胰岛素抵抗药物中的应用”(申请号2018111927902，申请日2018年10月13日)。在本发明中，本课题组延续这一针对壳寡糖双胍衍生物的药用价值测试，首先制备壳寡糖双胍衍生物并进行表征，在针对胰岛素抵抗进行研究。
实施例1 1500Da壳寡糖双胍衍生物的制备
按照原料配比为1：1称取1.44g双氰胺置于锥形瓶中，加入15mL蒸馏水，在50℃恒温震荡培养箱中振荡溶解双氰胺。待壳寡糖(1500Da)和双氰胺均完全溶解后，将双氰胺水溶液倒入盛有壳寡糖盐酸溶液的四口瓶中，使用1mol/L的盐酸调节溶液pH＝1。在微波功率为400W，微波时间为15min条件的下进行反应。反应结束后，对混合溶液醇沉，抽滤，烘干，研磨，得到取代度为55％的壳寡糖双胍衍生物粉末COSG。
实施例2 3000Da壳寡糖双胍衍生物的制备
按照原料配比为1：1称取2.88g双氰胺置于锥形瓶中，加入15mL蒸馏水，在50℃恒温震荡培养箱中振荡溶解双氰胺。待壳寡糖(3000Da)和双氰胺均完全溶解后，将双氰胺水溶液倒入盛有壳寡糖盐酸溶液的四口瓶中，使用1mol/L的盐酸调节溶液pH＝1。在微波功率为400W，微波时间为15min条件的下进行反应。反应结束后，对混合溶液醇沉，抽滤，烘干，研磨，得到取代度为55％的壳寡糖双胍衍生物粉末COSG。
本发明实施例1获得的壳寡糖双胍衍生物和原料壳寡糖经红外光谱，核磁共振谱等鉴定，如附图1和2所示。
COS的红外光谱图中，3414cm-1附近处的强吸收峰为缔合氢键的O－H和N－H伸缩振动吸收峰部分重叠而增宽的多重吸收峰。由于COS分子中存在大量的分子间、分子内氢键，且氢键的长短、强弱也不尽相同，因此其伸缩振动峰出现在较宽的频率范围内。2918cm-1左右为C－H的伸缩振动吸收峰。1626cm-1附近处为仲胺的N-H伸缩振动峰。此外，指纹区的1060cm-1附近处为仲胺的N－H面内弯曲振动吸收峰，因为COS脱乙酰化并不完全，分子中含有少量的－NH－CO－结构，故在该处有吸收峰；602cm-1附近处对应着N－H的面外摇摆振动吸收带。与COS相比，COSG在1626cm-1处、1060cm-1附近处吸收峰明显增强，这两个峰都是仲胺基团的特征峰，说明分子内仲胺类基团增多，表明COS氨基上发生了胍基化反应。此外，3414cm-1附近处吸收峰为缔合氢键的O－H和N－H伸缩振动吸收峰部分重叠而增宽的多重吸收峰，由于COS分子中存在大量的分子间、分子内氢键，且氢键的长短、强弱也不尽相同，因此其伸缩振动峰出现在较宽的频率范围内，而COSG相对于COS，该峰明显增强，同样说明分子内N－H含量增多，表明了COS氨基上发生了胍基化反应。
壳聚糖环上各个C的化学位移为：C1：97.03，C4：76.03，C5：75.01，C3：71.49，C6：60.23，C2：56.23。壳寡糖是壳聚糖降解后得到的，因此，其糖环上各个C化学环境，化学位移也应与壳聚糖一致。用13CNMR分析技术进一步确定壳寡糖改性后的结构变化，壳寡糖胍盐的化学位移分别为：C7：165.21，C8：155.13，C1：98.91，C4：78.17，C5：77.03，C3：69.13，C6：60.17，C2：56.43。其中C7：165.21和C8：155.13处新出现的碳的化学位移确定了胍基团的存在。
在确定壳寡糖和双氰胺反应生成胍基团后，本发明使用NaOH标准溶液滴定产物，测得产物的胍取代度DS并以此为判断标准。NaOH和壳寡糖胍中的＝NH2 +Cl-反应，滴定等当点时，pH发生突变，NaOH摩尔数等于产物中的＝NH2 +Cl-摩尔数。壳寡糖胍的DS可用下列式计算：
式中：
n1——被胍基取代的结构单元摩尔数；
n2——未被胍基取代的结构单元摩尔数；
Δv——到达突越点(pH＝9.1)消耗NaOH的体积/ml；
cNaOH——NaOH标准溶液的浓度/mol·L-1；
G——产品质量/g；
318——被胍基取代的结构单元的相对摩尔质量/g·mol-1；
161——未被胍基取代的结构单元的相对摩尔质量/g·mol-1；
DS——(双)胍取代度/％。
实施例3选取实施例1，2中制备的壳寡糖双胍衍生物粉末COSG进行动物药效学实验。
通过以下动物实验对本发明应用效果作进一步说明。
实验动物选用SD成年雄性大鼠70只，每组10只，总共7组，清洁级，体重在500克左右，由天津市动物实验中心提供。动物分笼饲养，动物每笼4～5只。动物饲养实验室符合国标清洁级，空间30m2，室内照明控制在12h/12h光暗周期节律。室内平均气温23℃，相对湿度50％～60％。
70只大鼠分为以下7组：对照组(标记为C，空白组)，模型组(标记为M，诱发糖尿病并灌水)，二甲双胍组(标记为Met，诱发糖尿病并给药二甲双胍)，壳寡糖1组(标记为COS1，诱发糖尿病并给药壳寡糖，1500Da)，壳寡糖2组(标记为COS2，诱发糖尿病并给药壳寡糖，3000Da)，壳寡糖胍1组(标记为COSG1，诱发糖尿病并给药实施例1中制备的壳寡糖双胍衍生物COSG)，壳寡糖胍2组(标记为COSG2，诱发糖尿病并给药实施例2中制备的壳寡糖双胍衍生物COSG)。对照组喂食正常饮食，其他组饲喂高脂肪和高糖饮食8周，然后禁食12小时，然后以25mg/kg的剂量注射STZ至尾静脉，构建2型糖尿病大鼠模型。随机血糖>16.7mmol/L时，认为造模成功。在接下来的8周，正常对照组继续喂养基础饲料，药物干预组在高脂高糖饲料基础上加入相应药物，按照500mg/kg的剂量灌胃给药(溶剂：蒸馏水，pH＝7)，空白组用相应剂量的蒸馏水灌胃，各组大鼠每日下午同一时间灌胃一次。
2、标本采集
针对动物实验需检测的指标，对实验大鼠血清和组织作如下处理，用于下面各项检测。
1)血液样品的采集：在实验期结束时，大鼠禁食12小时，然后在乙醚麻醉下通过股动脉穿刺放血处死，收集血样。静置1h后，对其进行离心处理，转速2500r/min，时间20min，取上清液制备血清。将血清样品储存在-20℃冰箱中用于进一步分析。
2)体重：每周选定同一时间测定大鼠的体重，单位：g。
3)肝脏标本：实验结束后每组大鼠放血处死，立即取肝脏以做进一步分析。
3、研究情况
1)对糖尿病大鼠一般状况的影响：
糖尿病大鼠出现典型的体重下降症状。所有的糖尿病大鼠，与正常大鼠相比均有明显的体重减轻(P<0.001)。和糖尿病大鼠相比，其他所有组的小鼠的体重在实验过程中逐渐趋于正常，如图3a所示。糖尿病大鼠在8周内发生高血糖，实验结束时空腹血糖水平显著升高。从图3b可以看出，与C组相比，M组空腹血糖水平显着升高，二甲双胍，COS和COSG治疗后降低(P<0.01)。其中，具有3000Da的COSG2组在降低空腹血糖方面表现更好。二甲双胍，COS和COSG对尿糖水平的影响显示在图3c中。M组尿液葡萄糖含量约为C组的1.25倍(P<0.001)，与M组比较，药物组呈现出显著降低的糖尿病大鼠尿糖水平(P<0.01)。此外，COSG1组效果最好。
为了进一步研究壳聚糖及其衍生物对胰岛素抵抗的影响，在实验结束后测量胰岛素和HOMA-IR水平。图4显示M组的胰岛素含量显着低于C组(p<0.01)。Met组大鼠的平均胰岛素水平比M组高26.25％(p<0.01)。此外，COSG2组的胰岛素水平比M组高30.04％(p<0.01)。与C组相比，M组大鼠的HOMA-IR明显增加。然而，药物治疗8周后，HOMA-IR不同程度地降低，3000Da的COSG具有最佳治疗效果。
2)对糖尿病大鼠肝脏IRS-2表达与Akt磷酸化的影响
IRS-2是肝脏胰岛素抵抗的关键信号蛋白，图5a和图5c显示C组，M组和药物治疗组中的IRS-2蛋白表达水平。M组IRS-2蛋白表达较C组减少56.26％(p<0.001)，但治疗后IRS-2蛋白表达水平升高。IRS-2磷酸化可进一步激活PI3K/Akt信号转导途径。图5b和图5d表明各组之间的Akt表达水平几乎没有差异。图5b和图5f显示p-Akt(Ser473)蛋白表达水平显着低于C组(P<0.01)。经过Met，COS和COSG治疗后，Akt磷酸化程度不同程度增加；在治疗中，3000Da COSG治疗效果最好。
3)对糖尿病大鼠肝脏GLUT-2，GCK表达量的影响
由于胰岛素抵抗的特征在于葡萄糖摄取受损，并且由于GLUT-2和GCK在维持肝脏葡萄糖稳态中起主要作用，因此我们接下来检查了COSG对肝脏GLUT-2和GCK表达水平的影响。如图6a和图6b所示，与C组相比，M组GLUT-2的表达显着降低(p<0.01)。经过二甲双胍，COS，COSG治疗后，各组中GLUT-2的表达上调。两种分子量的COSG均能增加T2DM大鼠GLUT-2蛋白的表达，但1500Da COSG的效果略好于3000Da，也优于Met。
如图6c所示，M组大鼠肝脏中GCK的表达呈现一定程度上的下降(p<0.01)。经过二甲双胍，COS，COSG治疗后，各组GCK表达降低的趋势受到抑制，COSG的干预效果优于其他治疗方法。1500Da和3000Da COSG的治疗效果相似。
4)对糖尿病大鼠肝脏PEPCK，G6Pase表达量以及肝糖原含量的影响
已知胰岛素还可以通过抑制糖异生来维持葡萄糖体内平衡，肝脏是糖异生主要的靶器官。糖异生是非己糖前体葡萄糖形成的合成代谢途径，是葡萄糖生成的重要原因，也是维持循环血糖水平的重要机制。PEPCK和G6Pase是重要的糖异生酶，它们的过表达可能导致已知糖原合成受损会影响全身胰岛素反应性。
如图7a所示，与C组相比，M组的G6Pase水平增加(p<0.001)。与M组相比，药物治疗组G6Pase水平显着降低；在治疗中，COSG2疗效最好，略优于二甲双胍(p<0.05)。如图7b所示，与C组相比，M组PEPCK水平增加了57.67％(p<0.01)。与M组相比，PEPCK在药物治疗组中的过度表达受到抑制。对于肝糖原含量(图7c)，与C组相比，M组的肝糖原含量降低了33.64％(p<0.01)。然而，与M组相比，二甲双胍，COS和COSG治疗组的肝糖原含量显著增加。总之，COSG显着降低PEPCK和G6Pase水平和提高肝糖原含量。这些结果表明COSG具有减少肝脏糖异生的能力，这可进一步有助于改善肝脏胰岛素抵抗。
通过上述实验和分析可知，本专利发明的壳寡糖双胍衍生物能控制体重减轻并降低空腹血糖和尿糖水平。此外，它还可以增加空腹胰岛素水平以改善胰岛素抵抗并增加外周组织对胰岛素的敏感性。该研究还表明，COSG可促进IRS-2色氨酸473号位点磷酸化激活，进而激活PI3K-Akt胰岛素信号传导通路，一方面提高下游信号蛋白GLUT-2的表达，增加了肝脏对葡萄糖的摄取；另一方面，抑制PEPCK和G6Pase的表达，进而抑制肝脏糖异生。最终发挥对肝脏胰岛素抵抗的治疗作用，且与单独使用传统糖尿病治疗药物二甲双胍相比，壳寡糖双胍衍生物治疗效果更佳。即本发明壳寡糖双胍衍生物在制备治疗肝脏胰岛素抵抗药物中的应用。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。