具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的解释说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

实施例1(这个方法是常规的)

海胆多糖HJ2A的制备方法，具体步骤如下：

(3)多糖的提取

取海胆生殖腺脱脂粉，加入其10倍体积纯水溶解，于90℃水浴中搅拌提取4h，提取完后恢复至室温，离心(4000rpm，15min)后收集提取残渣。将海胆生殖腺热水提取后的残渣加入其10倍体积的0.2mol/L NaOH溶液，于70℃搅拌提取2小时，结束后中和提取液，离心弃去残渣，收集取上清液，浓缩原体积的1/6，加入三倍体积无水乙醇醇沉，于4℃静置24小时。离心后收集沉淀，将沉淀复溶后再次离心，取上清液进行透析(MWCO:3.5kDa)、浓缩、冻干，得到海胆生殖腺粗多糖。

(4)多糖的纯化

采用DEAE Fast Flow(5.0cm×50cm；1.6cm×50cm)强阴离子交换层析柱对多糖进行纯化。多糖0.22μm微孔滤膜过滤后上样，先用去离子水、0.06mol/L NaCl、0.15mol/LNaCl 和2.0mol/L NaCl溶液各洗脱2个柱体积(CV)，流速为3mL/min。使用自动部分收集器对0.06mol/L NaCl洗脱下来的组分进行收集，图1箭头所示为目的多糖组分。

采用Sephadex G75凝胶过滤柱层析对目的组分进一步纯化，采用0.1mol/L碳酸氢铵作为流动相，流速为0.5mL/min，采用硫酸苯酚法检测多糖，收集含糖组分，得到的纯化多糖，即为HJ2A(如图2箭头所示)。

实施例2

海胆多糖的理化性质分析。

(1)总糖含量分析

采用硫酸-苯酚法，精密准确称取标准对照品(葡萄糖)和多糖样品各5.00mg，在50mL容量瓶中定容，得到总糖测定的标准溶液。精确量取25、50、100、200、300、400 和500μL标准溶液，以及500μL样品溶液于洁净玻璃试管中，均补水至500μL。随后精确量取500μL的5％苯酚溶液和2.5mL浓硫酸，依次加入到试管中。加浓硫酸时要沿试管壁匀速加入，以防溶液沸腾溅出。轻轻振荡使各溶液混合均匀，在沸水浴中加热15 min。取出冷却直室温，每管量取相同体积的溶液加入96孔板中，借助酶标仪测定各管溶液的吸光度(波长492nm)。共设置3个平行组，分别计算各组平均吸光度值，根据标准溶液浓度绘制曲线，计算样品溶液的总糖含量。由结果可知，HJ2A的总糖含量范围为 80％～100％。

(2)蛋白质含量分析

采用BCA法对海胆多糖的蛋白质含量进行测定。将BCA试剂与CuSO4溶液根据实际测定样本数量量取合适体积，按照体积比50：1充分混匀，配制成BCA实验溶液。将 5mg/mL的牛血清蛋白(BSA)储备液用PBS稀释成浓度为0.5mg/mL的溶液，并梯度稀释成0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4和0.5mg/mL的标准溶液。精确量取20μL各标准溶液加到96孔板中，随后量取200μL配制好的BCA实验溶液加入至各孔。37℃温浴30min，并在15min内于波长562nm处测定各孔吸光度值，共设置3个平行组，计算各组吸光度的平均值，并根据各标准溶液浓度绘制标准曲线，计算各样品蛋白质浓度。由结果可知，HJ2A的蛋白质含量范围为0％～20％。

(3)单糖组成分析

采用PMP柱前衍生高效液相色谱法对海胆多糖进行单糖种类组成测定。具体方法步骤如下：准备5mL的干净安瓿瓶若干，在其中精确称取5.0mg样品，加500μL水完全溶解，再加入500μL的4.0mol/L三氟乙酸(TFA)，密封后在105℃下降解4h，中和后取200μL降解液，与0.5mol/L PMP甲醇溶液(240μL)和0.3mol/L NaOH溶液(200μL)混合均匀并且密封后，在70℃水浴中反应1h，对降解产物或单糖标准品进行衍生化。衍生物用氯仿萃取3次，弃去氯仿层，水层过0.22μm微孔滤膜后进样。色谱条件：ZORBAX SB-AQ C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；检测器：SPD-20A UV检测器(254nm)；流动相：0.1mol/L PBS(pH＝6.8)：乙腈＝83:17(v/v,％)；流速：0.8ml/mL；柱温：30℃；上样量：20μL。高效液相色谱图如图3所示，可以看出，HJ2A单糖组成为葡萄糖，说明HJ2A 为葡聚糖。

(4)相对分子量分析

采用高效凝胶渗透色谱-多角激光光散射法(HPGPC-MALLS)海胆多糖进行相对分子质量测定。色谱柱：Shodex OHpak SB-806HQ色谱柱(8mm×300mm,13μm)；流动相：0.1mol/L Na₂SO₄溶液；流速：0.5mL/min；柱温：35℃；检测器：G1362A示差检测器和HelEos-11十八角度激光检测器；进样量：20μL。由结果可知，HJ2A的重均分子量范围为100～500 kDa。(图4)。

实施例3

HJ2A的结构表征。

(1)红外光谱分析(FT-IR)

称取2mg左右多糖样品于1mL离心管中，敞口放到内有五氧化二磷的真空干燥箱内，50℃减压干燥1～2天。用样品勺将样品拨置于红外光谱仪样品孔中，进行红外光谱扫描，波数为400～4000cm^-1。HJ2A的FT-IR光谱分别如图5所示。O-H(3297cm^-1)、C-H (2923cm^-1)和C-O-C(1002cm^-1)的伸缩振动是多糖的特征吸收，在1002cm^-1、1075cm^-1和1143cm^-1处的3个窄强峰，表明糖环为吡喃型，且出现在840cm^-1左右的峰(-C-H的振动)确定HJ2A是由α-D-吡喃葡萄糖组成。

(2)甲基化分析

采用改进的Hakomari法对各多糖样品进行甲基化反应。称取多糖样品2mg于反应瓶中，置于真空干燥箱(内有P₂O₅)中干燥48h，干燥后的样品加入1mL无水DMSO，氮气保护，室温下磁力搅拌1h，使多糖充分溶解。加入20mg干燥的NaH粉末，于50℃下搅拌反应1h，反应后溶液呈墨绿色。将反应瓶置于冰浴上，待反应瓶中的溶液完全凝固后，逐滴加入0.5mL碘甲烷，避光室温反应，直至溶液变为亮黄色。

反应完毕，加入1mL去离子水终止反应，将反应液移至试管中。使用CHCl₃将反应液萃取两遍，合并CHCl₃层。再用去离子水洗涤CHCl₃层3～6次，收集CHCl₃层，减压干燥。为保证样品能完全甲基化，需重复上述操作。取样品进行红外光谱检测，若原样品的3300cm^-1处强而宽的O-H振动吸收峰几乎消失，同时2900cm^-1的甲基振动吸收峰和 1000～1400cm^-1间的C-O振动吸收峰显著增强，表明该多糖样品己经甲基化完全。

将全甲基化样品转移至5mL安瓿瓶中，加入0.5mL水和0.5mL的4mol/L TFA充分溶解，使用酒精喷灯加热封口，放到烘箱中110℃水解4h。使用旋蒸蒸发仪将水解溶液蒸干，并反复加甲醇直至TFA挥发完全。将除酸后的水解产物中加入0.5mL NaOH溶液 (0.05mol/L)，震荡使样品溶解。加入5mg NaBD₄，室温反应4h。反应结束后逐滴加入冰醋酸，直至溶液成弱酸性且无气体生成。反应液加甲醇反复蒸干，直至硼酸和冰醋酸挥发完全。期间可以用pH试纸进行检测，当pH值接近中性时，说明酸已除干净。将产物置于真空干燥箱中干燥48h。

取400μL无水吡啶加入装有还原样品的反应瓶中，于100℃油浴中密封反应0.5h。反应结束后冷却至室温，反应液会凝固成白色半透明状，紧接着加入400μL无水乙酸酐，100℃下密封反应1h。反应结束后加入1mL去离子水终止反应。加甲醇反复蒸干以除尽吡啶和醋酸。反应物加入2mL CH₂Cl₂溶出，用去离子水洗涤3～6次，收集CH₂Cl₂层，减压浓缩至干，后于真空干燥箱中干燥，进行气质(GC-MS)分析。

甲基化HJ2A的FT-IR光谱如图6所示，3230cm^-1左右的强振动吸收峰消失，2920cm-1处的C-H振动吸收峰增强，说明HJ2A已被完全甲基化。经酸水解、还原和乙酰化后，衍生物经GC-MS分析，总离子流气相色谱图如图7所示。各峰的质谱与CCRC光谱数据库部分甲基化的糖醇乙酰酯衍生物(PMAA)进行比对，找出3种匹配的连接方式，如图8 所示。GC-MS的分析结果表明，HJ2A具有典型糖原结构，含有Glc-(1→，→4)-Glc-(1→，和→4,6)-Glc-(1→，其摩尔比为2.19:3.18:1.00。HJ2A的重复结构单元包含6个Glc残基，其中含有1个分支点残基。

(3)核磁共振波谱(NMR)分析

称取30mg左右的固体多糖，置于50mL旋蒸瓶中，加入1mL重水(D₂O)溶解，旋转蒸干，再次加入D₂O溶解，反复蒸干3次，最后加入500μL D₂O溶解，离心后转移到核磁管中。通过核磁光谱仪记录谱图，如图9所示，包括¹D波谱(1H NMR、¹³C NMR 和DEPT 135°)和2D相关谱(¹H-¹H COSY、¹H-¹³C HMQC、¹H-¹³C HMBC和¹H-¹H TOCSY)。

¹H NMR谱中，在化学位移5.25(A)和4.86(B)ppm处能清楚地看到2组异头质子信号，其峰面积积分比为3.70:1.00，根据其化学位移推测MSGA的构型为α型，这与甲基化分析的结果一致。糖环的其它质子(H2-H6)信号位于3.30～3.90ppm之间。¹³C NMR谱中，在99.90ppm、99.77ppm和98.48ppm处出现3个异头碳信号，而C2-C6的化学位移在60和77ppm之间。根据苷化位移效应，由于形成糖苷键，C4(77.36ppm)和C6(67.45 ppm)的化学位移向低场移动，未取代C6的信号出现在60.54ppm处。

从¹H-¹H COSY和¹H-¹H TOCSY中可以很容易地识别自旋系统中H1-H3的信号，但由于H2-H6的信号在3.30～3.90ppm之间分布密集而很难被识别(图4、图9C)。¹H-¹³C HSQC 图谱(图4、图9C,D)显示直接相关的C、H信号，例如，残基A和B的异头质子均分别与化学位移在99.90和99.77ppm处的异头碳存在相关关系，糖残基C的异头质子与 98.48ppm处的碳原子直接相关。C6的两个质子的信号在3.60～3.80ppm之间，A和B 残基的H4/C4相关信号为3.53/77.36ppm。

实施例4

SPR检测海胆多糖与SARS-CoV-2Spike蛋白的相互作用。

将海胆多糖通过表面等离子体共振(SPR)测定与SARS-CoV-2的结合亲和力。将CM5芯片置于Biacore T200仪器的芯片舱内；将SARS-CoV-2Spike蛋白溶解于HBS-EP+缓冲液配制成400μg/mL的母液，用pH＝5.5的醋酸钠溶液稀释至20μg/mL，通过氨基偶联方式进行蛋白偶联，时间为420s，流速为10μL/min。芯片经1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化后，将Spike蛋白偶联到通道2，采用乙醇胺封闭未结合位点。通道2用不含Spike蛋白的缓冲液进行相同处理，作为空白对照。多糖样品分别稀释，采用PBSP缓冲液进行结合试验，以30μL/min的流速注入芯片。在样品注入结束时，相同的缓冲液流过芯片表面，以促进解离。解离60s后，注入甘氨酸-盐酸缓冲液(10mmol/L，pH＝1.5)，使传感器表面再生30s。采用1:1的结合模式，用软件对数据进行拟合分析。

多糖与S-蛋白结合的实时动态传感图如图10所示。可以看到，随着多糖浓度的增加，其与Spike蛋白的结合量也随之增加，并且随着时间的延长达到饱和状态。根据全局拟合曲线和1:1结合模型，绘制各多糖与S-蛋白的动力学亲和曲线(图11)。解离常数是测定配体与受体相互作用的重要参数，其值越小表示结合能力越强。HJ2A的KD为 7.133×10^-7。SPR数据显示海胆多糖对S-蛋白有较强的亲和力，并且以剂量依赖方式相互作用。

实施例5

海胆多糖对假病毒感染HEK293细胞的影响

将海胆多糖和阳性对照品在4℃中融化，使用Opti-MEM培养基将其稀释成实验设计需要的浓度(0.06、0.024、0.098、0.391、1.563、6.250、25.000和100.00μg/mL)，加入到96孔板中，同时设置阴性对照和空白对照。将假病毒从液氮中取出，并迅速置于 37℃水浴锅中轻摇解冻，同样使用Opti-MEM培养基稀释，取25μL加入到样品组和对照组各孔中，空白组加入相同体积的Opti-MEM培养基。轻轻震摇使溶液混合均匀，室温孵育60min。在此期间，将Opti-HEK293/ACE2细胞复苏，离心后加入DMEM完全培养基将细胞稀释为6×10⁵个/mL。将细胞充分混匀后加入到96孔板中，每孔50μL，置于二氧化碳培养箱中孵育48h，其间培养24h后添加一次完全培养基，每孔50μL。96 孔板封底，并小心吸去培养基，迅速加入50μL荧光素酶显色液，室温静置5min，借助酶标仪测定荧光强度。

海胆多糖HJ2A对Spike蛋白与ACE2结合的影响如图12所示，同时选取了目前报道的具有抑制新冠病毒活性的多糖(硫酸半乳岩藻聚糖和肝素)作为对照。研究人员在第三代慢病毒(pLV)载体上模拟SARS-CoV-2S-蛋白，并测试了各种硫酸多糖对哺乳动物细胞转导效率的影响。结果发现硫酸半乳岩藻聚糖和肝素对pLV-S信号转导有明显的浓度依赖性抑制作用，说明其具有抑制病毒与细胞结合的能力。岩藻搬入聚糖对S没有作用。以S-蛋白与ACE2结合感染细胞后的荧光信号强度的对数作为阴性对照，从图中可以看出，HJ2A能显著地降低荧光信号强度，相同浓度下，对病毒的抑制活性要高于硫酸半乳岩藻聚糖和肝素。说明这些海胆多糖能在一定程度上竞争性抑制S-蛋白和ACE2结合，抑制SARS-CoV-2病毒进入细胞。

实施例6

海胆多糖体外给药对TGF-β1诱导的人肺癌细胞A549纤维化的治疗作用。

取生长对数期的A549细胞，吹打制成单细胞悬液，经细胞计数后，将细胞按照5×10⁵个/mL细胞密度接于6孔板中培养，待细胞生长至50％左右时，用100μL不含FBS培养基代替旧培养基，饥饿处理12h。实验分为阴性对照组、阳性对照组(TGF-β1)和药物处理组(TGF-β1+HJ2A)。给药继续培养24h。治疗后采用奥林帕斯倒置显微镜和扫描电子显微镜观察细胞，进行形态学分析。扫描电镜分析用PBS洗涤细胞，酒精梯度脱水，制样，电镜观察(Hitachi-S-3400N)。

倒置显微镜观察结果如图13所示，阴性对照组HELF细胞呈鹅卵石状，而经TGF-β1刺激后，细胞变为梭型，发生纤维化。低浓度的HJ2A(1.25nmol/L)对HELF细胞的纤维化具有一定的抑制作用，相比TGF-β1单独处理组的细胞，低浓度的HJ2A给药组，细胞由 TGF-β1诱导导致的像长梭型的转变受到一定的遏制；将HJ2A的浓度提高到5nmol/L由 TGF-β1诱导的肺成纤维细胞的上皮到间叶的转移就被显著抑制了，大部分细胞呈鹅卵石状，而非TGF-β1诱导的长梭型。电镜下观察到的细胞形态更为清晰，如图14所示，阴性对照组细胞呈不规则椭圆球形，经TGF-β1刺激后细胞明显发生纤维化，呈长条状。低浓度的HJ2A(1.25nmol/L)对HELF细胞的纤维化治疗作用显示出一定的作用，高浓度的 HJ2A(5nmol/L)能显著TGF-β1刺激引起的纤维化和细胞形态改变，细胞恢复椭圆圆球形。

实验说明了高浓度的HJ2A一定程度上能抑制肺纤维化的发生，对因感染新冠肺炎导致的肺纤维化进程具有预防和治疗作用。