阅读说明：本技术 脱水亚硝基尼索地平在制备防治脓毒症的药物中的应用 (Application of dehydrated nitrosonisoldipine in preparation of medicine for preventing and treating sepsis ) 是由 高翔 林兆宇 王鼎玉 陈芊月 郑嘉烁 于 2019-12-16 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药领域,涉及脱水亚硝基尼索地平(dehydronitrosonisoldipine,NTS)在制备防治脓毒症的药物中的应用,其中所述的脓毒症既包括内毒素血症,也包括多细菌感染性的脓毒症。具体机制涉及NTS对细胞焦亡(pyroptosis)的抑制。该应用中所述的药物为腹腔注射液,注射液的剂量范围是14.8～44.4mg/kg体重。在脓毒症小鼠模型中,该药物能抑制血浆炎症因子的表达、延长小鼠生存时间、提高小鼠生存率。(The invention belongs to the field of medicines, and relates to application of dehydrated Nitrosonisoldipine (NTS) in preparation of a medicine for preventing and treating sepsis, wherein the sepsis comprises endotoxemia and multiple-bacterium infectious sepsis. A particular mechanism involves the inhibition of cellular apoptosis (pyroptosis) by NTS. The medicine in the application is an intraperitoneal injection, and the dosage range of the injection is 14.8-44.4 mg/kg of body weight. In a sepsis mouse model, the medicament can inhibit the expression of plasma inflammatory factors, prolong the survival time of mice and improve the survival rate of mice.)

脱水亚硝基尼索地平在制备防治脓毒症的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及脱水亚硝基尼索地平(dehydronitrosonisoldipine,NTS)对脓毒症的防治作用；具体机制涉及NTS通过抑制细胞焦亡(pyroptosis)改善机体炎症状态。

背景技术

脓毒症(sepsis)是外科感染的严重并发症，是重症监护病房中致死率最高的病种；平均每四个脓毒症患者中，就会出现一例死亡；全球每年大约有3150万例脓毒症发生，有530万人因脓毒症而丧生。脓毒症的病理过程极为复杂，直到近三十年，人们才对它有大致了解。脓毒症的病理过程可分为两个阶段，早期的炎症风暴阶段和晚期的免疫抑制阶段。早期的炎症风暴始于固有免疫系统对自体受损组织和病原体的过度反应，这种反应超出免疫系统的控制范围，并在级联放大的效应下形成炎症风暴。晚期的免疫抑制体现为免疫系统的瘫痪，对病原体刺激的不敏感；这与早期炎症风暴导致的免疫耗竭和细胞死亡关系密切。

细胞焦亡是近年来新发现的一种细胞程序性死亡方式，它主要发生于专职的吞噬细胞，如巨噬细胞、单核细胞、DC、中性粒细胞等。与细胞凋亡(apoptosis)不同，细胞在发生焦亡时，整个细胞膜会涨破，并释放出大量的促炎因子；在所有坏死性细胞死亡中，细胞焦亡的诱发最迅速、激活的炎症反应也最猛烈。目前已有大量研究表明细胞焦亡在脓毒症的炎症风暴阶段起重要推动作用，敲除焦亡信号通路的相关基因，能改善脓毒症小鼠模型的预后(Kayagaki N,Stowe I B,Lee B L,et al.Caspase-11cleaves gasdermin D fornon-canonical inflammasome signalling[J].Nature,2015,526(7575):666-71；Hagar JA,Powell D A,Aachoui Y, et al.Cytoplasmic LPS activates caspase-11:implications in TLR4-independent endotoxic shock[J].Science,2013, 341(6151):1250-3)。

NTS是二氢吡啶类钙拮抗剂尼索地平(nisoldipine)光解产物的主要成分。

曾有文献对NTS的药物毒性进行过报道(赵敬琴，任雷鸣。尼索地平光解产物的制备及药理作用[J]。河北医科大学学报，1990，(1):8-9)。该研究显示，NTS的毒副作用比尼索地平本身要弱。在小鼠灌胃实验中，尼索地平以300mg/kg体重的剂量，导致10只小鼠全部死亡；而NTS在300～2000mg/kg的剂量下未导致一只小鼠死亡(共10只小鼠)。在腹腔注射实验中，尼索地平以100mg/kg的剂量导致7/10的小鼠死亡，而NTS在同样的剂量下(100mg/kg)仅导致1/10的小鼠死亡。这项研究显示NTS的毒副作用较小，但关尼索地平和NTS在抑制细胞焦亡、防治脓毒症方面的作用目前均尚无报道。

发明内容

本发明的目的是提供NTS在制备药物中的应用。

本发明公开了脱水亚硝基尼索地平在制备防治脓毒症的药物中的应用。

本发明所述脓毒症包括内毒素血症，也包括多细菌感染性的脓毒症。

本发明提供了NTS在制备细胞焦亡抑制剂中的应用。

本发明提供了NTS在制备脓毒症抗炎药物中的应用。

本发明提供了NTS在作为腹腔注射液防治脓毒症时的剂量范围，即14.8～44.4mg/kg体重。

本发明提供了NTS在制备防治脓毒症药物中的应用，具体机制涉及NTS对细胞焦亡(pyroptosis)的抑制。在脓毒症小鼠模型中，该药物能抑制血浆炎症因子的表达、延长小鼠生存时间、提高小鼠生存率。

附图说明

图1是NTS抑制内毒素诱导的人单核细胞系THP-1细胞焦亡。

图2是NTS抑制尼日利亚毒素诱导的小鼠巨噬细胞系iBMDM细胞焦亡。

图3是NTS改善LPS脓毒症小鼠的生存率。

图4是NTS改善LPS脓毒症小鼠的IL-1β。

图5是NTS改善LPS脓毒症小鼠的IL-6。

图6是NTS改善LPS脓毒症小鼠的TNF-α。

图7是NTS延长多细菌感染性脓毒症小鼠的生存时间。

图8是NTS改善多细菌感染性脓毒症小鼠的IL-1β。

图9是NTS不影响多细菌感染性脓毒症小鼠的IL-6。

图10是NTS不影响多细菌感染性脓毒症小鼠的TNF-α。

具体实施方式

实施例一：NTS抑制内毒素诱导的人单核细胞系THP-1细胞焦亡。

实验材料：NTS(MedChemExpress,Cat.No.HY-Z0816)使用二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO) 溶解。内毒素Escherichia coli O111:B4 LPS(Sigma,Cat.No.LPS25)使用无菌水溶解。THP-1细胞系由中国科学院上海细胞生物学研究所提供，使用RMPI 1640培养液培养，培养液中添加有10％的胎牛血清和 1％的青霉素/链霉素。Neon电转仪购买自Invitrogen公司。光学显微镜的型号为Olympus IX71。

实验方法：我们将50μM NTS或等体积的DMSO加入THP-1的细胞培养液中摇匀；30分钟后，根据文献中描述的方法(Zhao Y,Shi J,Shao F.Inflammatory Caspases:Activation and Cleavage of Gasdermin-D In Vitro and During Pyroptosis[J].Methods Mol Biol,2018,1714:131-148)，使用电转仪将50ng/mL的LPS电转入THP-1细胞内，以诱导细胞焦亡。2小时后，我们使用光学显微镜观察并拍摄细胞形态。

实验结果：见附图1，图A示阴性对照(比例尺为20μm)，图B示THP-1细胞系在经受LPS电转处理后，出现大量的细胞焦亡形态(白色箭头示)；图C示同样经受LPS电转、但在50μM NTS保护下的 THP-1细胞系未出现细胞焦亡形态。上述结果说明NTS可以抑制LPS诱导的THP-1细胞焦亡。

实施例二：NTS抑制尼日利亚毒素诱导的小鼠巨噬细胞系iBMDM细胞焦亡。

实验材料：NTS(MedChemExpress,Cat.No.HY-Z0816)、尼日利亚毒素(nigericin)(Sigma,Cat.No. N7143)使用DMSO溶解。永生化的鼠源巨噬细胞系(immortalized bonemarrow derived macrophage, iBMDM)由北京生命科学研究所邵峰院士慷慨提供，使用RMPI 1640培养液培养，培养液中添加有10％的胎牛血清和1％的青霉素/链霉素。光学显微镜的型号为Olympus IX71。

实验方法：我们将50μM NTS或等体积的DMSO加入iBMDM的细胞培养液中摇匀；30分钟后，向培养液中加入10μM尼日利亚毒素，以诱导细胞焦亡。1小时后，我们使用光学显微镜观察并拍摄细胞形态。

实验结果：见附图2，图A示阴性对照(比例尺为20μm)，图B示iBMDM细胞系在经受尼日利亚毒素处理后，出现大量的细胞焦亡形态(白色箭头示)；图C示同样经受尼日利亚毒素处理、但在50μM NTS 保护下的iBMDM细胞系基本不出现细胞焦亡形态。上述结果说明NTS可以抑制尼日利亚毒素诱导的 iBMDM细胞焦亡。

实施例三：NTS改善LPS脓毒症小鼠的生存率并抑制炎症因子表达

实验材料：NTS(MedChemExpress,Cat.No.HY-Z0816)使用DMSO溶解。内毒素Escherichia coli O111:B4 LPS(Sigma,Cat.No.LPS25)使用无菌水溶解。小鼠为C57/BL6品系，雄性，年龄6-8周，体重约25g，由南京大学模式动物研究所(Model Animal ResearchCenter,MARC)提供。小鼠饲养在由国际实验动物评估和认可委员会认证的无特定病原体(specific pathogen free,SPF)的环境中，所有的实验均经过 MARC动物护理和使用委员会批准。白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平用ELISA试剂盒检测(Cat.No.MLB00C,Cat.No.M6000B,andCat.No.MTA00B, R&D Systems)。

实验方法：NTS用DMSO配成100mM的浓度，通过腹腔注射的方式给予小鼠药物。给药时根据剂量将小鼠分为高、中、低三组。高剂量组给予44.4mg/kg体重，中剂量组给予14.8mg/kg体重，低剂量组给予4.44mg/kg体重。相当于给予体重为25g的小鼠30μL、10μL、或3μL药物。为平衡给药的总体积，我们将总量统一设置为30μL，不足的体积用DMSO补齐。我们采用一次性腹腔注射LPS的方式建立LPS 脓毒症小鼠模型，注射剂量为20mg/kg体重。给予NTS药物的时间点为造模前(腹腔注射LPS前)的24 小时和0.5小时。在观察生存率的实验中，我们将小鼠分为4组，每组10只。4组小鼠每次给药的剂量分别为高、中、低和无(阳性对照组)。腹腔注射LPS后，观察小鼠的72小时生存率。在测定血清炎症因子浓度的实验中，我们将小鼠分为4组，每组6只；其中包括1组阴性对照组(注射LPS时用等体积的灭菌水代替，给予NTS时用等体积的DMSO代替)，另外3组小鼠每次给药的剂量分别为高、中和无(没有低剂量组)，给药的方式和时间点与生存率实验一致。腹腔注射LPS 12小时后，将所有小鼠颈椎脱臼处死，并从心脏抽取血液，静置1小时后得到血清，置于-80℃冰箱直到用于炎症因子的检测。

数据分析：本研究的数据以生存曲线的形式(生存率)或平均值±标准差的形式(炎症因子水平)呈现。统计学分析与绘图使用软件GraphPad Prism 7完成。我们用Mantel-Cox来比较实验组与阳性对照组之间的生存率差异。用two-tailed Student’s t test来比较实验组与阳性对照组血清促炎因子水平的差异。当P< 0.05时考虑两组之间具有统计学差异。*表示P<0.05，**表示P<0.01。

实验结果：图3示72小时生存率结果，最终中剂量NTS组和高剂量NTS组的生存率分别为30％和 20％。中剂量组与阳性对照组相比有统计学差异，P＝0.0423。图4、5、6示炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，两个NTS处理组较阳性对照组均显著下降(P<0.05)。上述结果说明NTS能改善LPS脓毒症小鼠生存率，并抑制炎症因子表达。

实施例四：NTS延长多细菌感染性脓毒症小鼠的生存时间并抑制IL-1β表达

实验材料：同实验三。

实验方法：NTS的给药方式、给药时间同实验三。我们采用一次性腹腔注射盲肠内容物(cecal slurry, CS)的方式建立多细菌感染性脓毒症小鼠模型。我们从健康小鼠的盲肠中提取出内容物(小鼠已颈椎脱臼处死)，用灭菌水溶解、混匀。按照1.5g盲肠内容物/kg体重的剂量给实验小鼠腹腔注射，以建立CS脓毒症小鼠模型。生存率实验除未设NTS低剂量组外，其余同实验三。炎症因子检测实验同实验三。

数据分析：同实验三。

实验结果：图7示72小时生存率结果，最终所有小鼠均死亡，但NTS处理组的小鼠死亡时间较阳性对照组延后。高剂量NTS组与阳性对照组相比有统计学差异，P＝0.0296。中剂量组与阳性对照组相比有统计学差异，P＝0.0423。图8、9、10示炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，两个NTS处理组较阳性对照组IL-1β水平均显著下降(P<0.05)，但IL-6和TNF-α水平无显著差异。上述结果说明NTS能延长多细菌感染性脓毒症小鼠的生存时间，并抑制IL-1β表达。