Yg1702在制备aldh18a1特异性抑制剂中的应用

文档序号：1777653 发布日期：2019-12-06 浏览：18次 >En<

阅读说明：本技术 Yg1702在制备aldh18a1特异性抑制剂中的应用 (Application of YG1702 in preparation of ALDH18A1 specific inhibitor ) 是由余时沧郭玉峰段江洁于 2018-05-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种YG1702在制备ALDH18A1特异性抑制剂中的应用,YG1702能够与ALDH18A1重组蛋白特异性结合,抑制其酶活性,并且抑制ALDH18A1后能够显著降低MYCN表达和NB细胞的成瘤能力及荷瘤小鼠的生存时间,可以作为治疗MYCN扩增的神经母细胞瘤的药物,为临床神经母细胞瘤的治疗提供了新的药物。(The YG1702 can be specifically combined with ALDH18A1 recombinant protein to inhibit the enzymatic activity of the ALDH18A1, and the inhibiting effect of the ALDH18A1 can obviously reduce the MYCN expression, the nodulation capacity of NB cells and the survival time of tumor-bearing mice, can be used as a medicine for treating MYCN-amplified neuroblastoma, and provides a new medicine for treating clinical neuroblastoma.)

YG1702在制备ALDH18A1特异性抑制剂中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及YG1702在制备ALDH18A1特异性抑制剂中的应用。

背景技术

乙醛脱氢酶18A1(aldehyde dehydrogenase 18A1，ALDH18A1)基因编码吡咯啉-5-羧酸合成酶(pyrroline-5-carboxylate synthase，P5CS)，参与了谷氨酸和脯氨酸代谢，是催化脯氨酸、鸟氨酸和精氨酸合成的关键酶，在脯氨酸、鸟氨酸以及谷氨酸的互变转换以及非必需氨基酸代谢中发挥重要作用。其中，谷氨酸-谷氨酰胺代谢是肿瘤细胞除Warburg效应外又一重要的能量代谢方式，是肿瘤细胞合成代谢不可或缺的物质基础。现有研究报道，ALDH18A1于胶质瘤、***癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、胃、髓母细胞瘤等高表达，并与上述肿瘤的侵袭、转移和预后不良密切相关。因此筛选ALDH18A1特异性抑制剂对多种肿瘤，尤其是MYCN扩增肿瘤(如神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB))的治疗具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种YG1702在制备ALDH18A1特异性抑制剂中的应用；本发明的目的之二在于提供YG1702在制备抑制MYCN mRNA和蛋白表达的试剂中的应用；本发明的目的之三在于提供YG1702在制备MYCN抑制剂中的应用；本发明的目的之四在于提供YG1702在制备抑制MYCN mRNA和蛋白表达的试剂中的应用；本发明的目的之五在于提供YG1702在制备治疗ALDH18A1高表达的肿瘤的药物中的应用；本发明的目的之六在于提供YG1702在制备治疗MYCN扩增的肿瘤的药物中的应用；本发明的目的之七在于提供YG1702在制备治疗ALDH18A1高表达的神经母细胞瘤的药物中的应用；本发明的目的之八在于提供YG1702在制备治疗MYCN扩增的神经母细胞瘤的药物中的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1.YG1702在制备ALDH18A1特异性抑制剂中的应用。

2.YG1702在制备抑制ALDH18A1蛋白功能的试剂中的应用。

3.YG1702在制备MYCN抑制剂中的应用。

4.YG1702在制备抑制MYCN mRNA和蛋白表达的试剂中的应用。

5.YG1702在制备治疗ALDH18A1高表达的肿瘤的药物中的应用。

6.YG1702在制备治疗MYCN扩增的肿瘤的药物中的应用。

7.YG1702在制备治疗ALDH18A1高表达的神经母细胞瘤的药物中的应用。

优选的，YG1702在制备抑制ALDH18A1高表达的神经母细胞瘤增殖、成球能力、自我更新或生长的药物中的应用。

优选的，YG1702在制备延长ALDH18A1高表达的神经母细胞瘤生存时间的药物中的应用。

8.YG1702在制备治疗MYCN扩增的神经母细胞瘤的药物中的应用。

优选的，YG1702在制备抑制MYCN扩增的神经母细胞瘤增殖、成球能力、自我更新或生长的药物中的应用。

优选的，YG1702在制备延长MYCN扩增的神经母细胞瘤生存时间的药物中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明公开了YG1702在制备ALDH18A1特异性抑制剂中的应用，为ALDH18A1的调控提供了新的化合物，同时YG1702还可以抑制MYCN mRNA和蛋白表达，抑制神经母细胞瘤的增殖、成球能力和自我更新，为YG1702治疗MYCN扩增的神经母细胞瘤提供了新的药物。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为GSE16476(图1，A)、GSE13136(图1，B)、GSE12460(图1，C)和E-MEXP-669(图1，D)数据集，MYCN扩增与非扩增患者差异表达基因。

图2为GSE45547数据集，MYCN扩增与非扩增患者差异表达基因。

图3为E-MTAB-161(图3，A)、E-MTAB-179(图3，B)、E-MTAB-1781(图3，C)、癌细胞百科全书数据集(图3，D)，MYCN扩增与非扩增患者差异表达基因。

图4为ALDH18A1的表达与MYCN靶基因、MYCN扩增正性相关的基因、MYCN处于共扩增状态的基因显著富集(图4，A)，ALDH18A1在MYCN扩增的细胞系中高表达(图4，B)，ALDH18A1在NB扩增的患者中高表达(图4，C和D)。

图5为干预ALDH18A1后对MYCN扩增和非扩增NB细胞增殖(图5，A)、成球(图5，B)、对称***(图5，C和D)、自我更新基因(图5，E)、成瘤能力的影响(图5，F)

图6为ALDH18A1特异性抑制剂YG1702的筛选(图6，A和B)、鉴定(图6，C)、结构式(图6，D)、结合模式(图6，E和F)、特异性结合(图6，G)鉴定结果。

图7为ALDH18A1特异性抑制剂YG1702对MYCN扩增NB细胞MYCN的表达(图7，A-D)、成球能力(图7，E)、细胞活力(图7，F)、增殖(图7，G)、体重(图7，H)、成瘤能力(图7，I和J)和荷瘤小鼠生存时间(图7，K)的影响。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1、ALDH18A1与NB患者MYCN基因扩增关系

为研究ALDH18A1与NB患者MYCN基因扩增之间的关系，分别在GSE16476、GSE13136、GSE12460、E-MEXP-669和GSE45547(分别含有88、30、47、18和649例NB患者)，以及E-MTAB-161、E-MTAB-179和E-MTAB-1781大样本数据库中ALDH18A1mRNA表达水平和MYCN基因扩增情况，结果如图1，A～D；图2和图3，A～C所示。结果显示，ALDH18A1mRNA表达水平与MYCN基因扩增和MYCN过表达之间，均存在正性相关关系。同时，利用癌细胞系百科全书中的17中NB细胞系进行分析，也获得了相同的结果(图3，D)。进一步，对GSE16476数据库进行基因集合富集分析(GSEA)提示，高表达ALDH18A1的NB患者中，MYCN靶基因(NMYC_01,HALLMARK_MYC_TARGETS_V1,HALLMARK_MYC_TARGETS_V2)、与MYCN扩增正性相关的基因(KIM_MYCN_AMPLIFICATION_TARGETS_UP)以及与MYCN处于共扩增状态的基因(LASTOWSKA_COAMPLIFIED_WITH_MYCN)，显著富集(图4，A)。此外，对MYCN扩增型NB细胞系IMR32和SK-N-BE(2)以及无MYCN扩增型NB细胞系SK-N-SH进行Western Blot检测，发现ALDH18A1蛋白水平在MYCN扩增型NB细胞系中存在显著的高表达(图4，B)。更为重要的是，通过荧光原位杂交明确49例NB患者MYCN扩增状态后，进行免疫组化(IHC)染色，结果提示ALDH18A1蛋白水平与MYCN基因扩增显著相关(图4，C和D)。

综上所述，ALDH18A1高表达与NB患者的MYCN基因扩增密切相关，提示ALDH18A1可能在MYCN扩增型NB中扮演着重要角色。

实施例2、ALDH18A1促进NB细胞的增殖、自我更新和肿瘤起始能力

下调ALDH18A1表达方法：将表1中的shRNA序列，连接于pLVshRNA-EGFP载体BamHI与EcoRI酶切位点，并与psPAX2和PMD2.G包装质粒一同转入293T细胞，48小时之后收集慢病毒上清并浓缩、纯化。将此慢病毒感染神经母细胞瘤细胞系IMR32、SK-N-BE(2)，扩增后流式细胞术筛选GFP阳性细胞，并进一步挑选单克隆，下调ALDH18A1表达。

表1、ALDH18A1的ShRNA序列

上调ALDH18A1表达方法：将ALDH18A1ORF序列(SEQ ID NO.6)，连接于pLV-EGFP-C载体EcoRI与BamHI酶切位点，并与psPAX2和PMD2.G包装质粒一同转入293T细胞，48小时之后收集慢病毒上清并浓缩、纯化。将此慢病毒感染神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH、SH-SY5Y，扩增后流式筛选GFP阳性细胞，并进一步挑选单克隆，上调ALDH18A1表达。

下调ALDH18A1表达后进行MTS检测。结果发现下调ALDH18A1表达后，MYCN扩增型NB细胞增殖速率显著下降；而过表达ALDH18A1可明显促进无MYCN扩增型NB细胞增殖，证明ALDH18A1对于MYCN扩增型NB细胞增殖具有不可或缺的作用(图5，A)。同时，敲低ALDH18A1后MYCN扩增型NB细胞的成球能力明显下降；外源性表达ALDH18A1可显著增加无MYCN扩增型NB细胞的成球能力(图5，B)。此外，由于细胞对称***(SCD)和不对称***(ACD)可作为NB细胞自我更新、分化和肿瘤生成的重要调控因素，进一步研究ALDH18A1表达是否影响NB细胞***和自我更新能力。通过免疫荧光标记对细胞对称***具有重要意义的Numb和神经干细胞的特征性标志物Nestin(图5，C)，发现过表达ALDH18A1后，MYCN非扩增型NB细胞SCD比例明显增加；敲低ALDH18A1表达后，MYCN扩增型NB细胞SCD比例明显减少(图5，D)。综上，ALDH18A1敲低和过表达可诱发MYCN扩增型/无MYCN扩增型NB出现相反的细胞表型，提示ALDH18A1可调控NB细胞的自我更新能力。

为了明确ALDH18A1对NB细胞自我更新的影响是否涉及自我更新基因的差异性表达，比较了Erinn L.Soucie et al报道的自我更新基因集在ALDH18A1^KD SK-N-BE(2)和野生型SK-N-BE(2)细胞系中的表达情况，发现包括AKT1、BMI1、Cirh1a、LIN28B、SOX2、SSEA1和MYCN等7种自我更新基因在敲低ALDH18A1后，其表达水平显著下调(图5，E)。而大量研究数据证实，MYCN正是对NB肿瘤生成具有重要驱动和调控作用的癌基因。

最后，由于前文发现ALDH18A1与NB患者预后不良显著相关，进一步探索ALDH18A1对NB细胞体内成瘤能力的影响，结果显示敲低ALDH18A1后，SK-N-BE(2)细胞无法在免疫缺陷动物体内形成肿瘤，而对照组均可见较为明显的肿瘤生长(图5，F)，再一次证实ALDH18A1可作为一种癌基因，对NB肿瘤形成和生长具有决定性的作用。

实施例3、ALDH18A1特异性抑制剂YG1702的筛选

为研究ALDH18A1与NB肿瘤形成的影响，通过筛选ALDH18A1特异性抑制剂进行验证。利用分子对接、高通量筛选以及体外实验验证，筛选得到YG1702化合物，可作为潜在的特异性靶向ALDH18A1酶解活性的小分子药物(图6，A-F)。同时，通过等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry，iTC)实验证实了YG1702与ALDH18A1重组蛋白存在特异性结合(图6，G)，表明YG1702和ALDH18A1之间存在高亲和力物理结合，并可能抑制其酶活性。该化合物对正常人神经干细胞、脑胶质细胞和肠上皮细胞的毒性较小(图7，F)。

实施例4、YG1702抑制MYCN的表达、NB细胞的成瘤能力和荷瘤小鼠的生存时间

为了评估YG1702是否会通过抑制ALDH18A1而发挥对MYCN表达的调控作用，并且影响NB细胞的生物学行为，以YG1702处理MYCN扩增的NB细胞。

结果显示，YG1702处理组的MYCN mRNA和蛋白水平较对照组显著下调(图7，A-D)。此外，MYCN扩增的NB细胞增殖(图7，G)、成球能力(图7，E)等在YG1702处理之后显著降低。

为了研究YG1702的治疗学意义，将MYCN扩增的NB细胞移植至NOD/SCID免疫缺陷小鼠皮下，给予YG1702(45mg/kg)腹腔注射共3次，结果显示，小鼠体重无明显变化(图7，H)，YG1702可明显抑制移植瘤的生长(图7，I和J)。与对照组(PBS处理)相比，YG1702治疗组荷瘤小鼠的生存时间显著延长(图7，K)。

以上结果表明，YG1702与ALDH18A1结合后可引起MYCN表达水平下降，并且抑制MYCN扩增的NB细胞增殖、自我更新和体内成瘤能力，并显著减慢移植瘤的生长，延长荷瘤动物的生存时间，与ALDH18A1敲低所诱发的表型一致。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 余时沧

<120> YG1702在制备ALDH18A1特异性抑制剂中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 58

<212> DNA