一种苯丙酮尿症单基因病突变检测引物组、试剂盒及方法
阅读说明：本技术 一种苯丙酮尿症单基因病突变检测引物组、试剂盒及方法 (Phenylketonuria monogenic disease mutation detection primer group, kit and method ) 是由 张惠丹 戴敬 李阳 赵洪玉 于 2019-12-18 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种苯丙酮尿症单基因病突变检测引物组、试剂盒及方法,采用不同的引物设计软件,并结合agilent earray design探针设计系统,通过不断优化引物序列,最终将20个苯丙酮尿症单基因病突变位点的多重PCR扩增压缩至1个well中进行。本申请技术实验设计灵活,结果准确,检测速度快,无需PCR荧光标记,成本大大降低。适合批量筛查。(The invention provides a primer group, a kit and a method for detecting phenylketonuria monogenic disease mutation, which adopt different primer design software and combine with an agilent early design probe design system to finally compress the multiplex PCR amplification of 20 phenylketonuria monogenic disease mutation sites into 1 well for carrying out by continuously optimizing primer sequences. The application technology has the advantages of flexible experimental design, accurate result, high detection speed, no need of PCR fluorescent labeling and greatly reduced cost. Is suitable for batch screening.)
技术领域
本发明涉及生物基因检测技术领域，具体涉及一种苯丙酮尿症单基因病突变检测引物组、试剂盒及方法。
背景技术
苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)是一种常见的常染色体隐性遗传代谢病，严重危害着人类健康。该病主要是由于苯丙氨酸轻化酶(phenylalaninehydroxylase，PAH)基因突变所致，使得PAH活性下降或者缺乏，导致苯丙氨酸不能正常代谢，血液、组织中的苯丙氨酸及其旁路代谢产物堆积，最终导致中枢神经系统受到不可逆的损害，而出现精神行为异常、癫痫和智力低下等症状。
PKU是一种可通过饮食控制进行治疗的遗传病，早发现早治疗是其治疗的关键，但是昂贵的治疗费用给家庭和社会带来了沉重的经济负担，而且不能从根本上降低PKU患儿的出生率。目前，解决这一系列问题的重要手段是积极地开展基因诊断和产前诊断。
依赖科学技术的发展，目前单基因病的诊断以二代测序为主，但其操作步骤繁复、检测时间长、对技术人员操作及分析能力要求较高，这些容易对检测结果的可靠性产生影响，同时二代测序检测试剂及分析耗材昂贵，较高的成本给其在二代测序疾病分子诊断及人群筛查中的应用带来诸多挑战，影响了应用的普及。
发明内容
针对上述技术问题，本发明基于MassArray技术开发了一种苯丙酮尿症单基因病突变检测引物组、试剂盒及方法，可以在可操作性、灵敏度、节省时间、降低成本方面解决现有技术的不足。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种苯丙酮尿症单基因病突变检测引物组，包括以下成对的PCR扩增引物：
优选地，所述引物组为分别针对20个苯丙酮尿症单基因病突变位点设计的引物，所述突变位点包括rs62508620、rs199475657、rs672601294、rs199475653、rs62507283、rs62508722、rs62508728、rs199475658、rs62642919、rs199475689、rs199475694、rs281865446、rs199475695、rs199475692、rs199475693、rs199475696、rs199475645、rs1025860114、rs199475684、rs62507334。
优选地，所述引物组还包括各引物对相应的单碱基延伸引物/探针：
探针1：CGGTCCAGGTGGTTAC；
探针2：CCACGGTCATAGGGTAA；
探针3：AGGGTCGCAGGTCAGC；
探针4：ACGGCATACGCAGTAC；
探针5：TCCAAGGTCATAAGTTCAT；
探针6：CCCCAGTCAGTAGGCCA；
探针7：AAGTCATCCAAAGGGTCAT；
探针8：CATCATTCGGTAGTCGG；
探针9：CCGGCGCCAGCCATCCC；
探针10：GGGGTGCCAGCACCAT；
探针11：ATCACCGAGTCCCAG；
探针12：GCATCCAACATTCAATC；
探针13：CCGCACGAGCCAGGTC；
探针14：AGCATCACAGTCAGTAAAG；
探针15：AGGACGGGTGTGAGA；
探针16：CACAGTACCAGTCGCGG；
探针17：CAGAAGAAGCAGGTAG；
探针18：ACCAGTACGCAGTAGG；
探针19：GTAGTCATCATCGGGTCA；
探针20：GTCGGGTGGTGGGTC。
本发明还提供了一种包含上述引物组的试剂盒。
本发明又提供了一种苯丙酮尿症单基因病突变检测方法，采用上述引物组，包括以下步骤：
1)在384孔板中进行PCR扩增，每个PCR扩增反应体系总体积为5μl，每个5μl PCR反应体系中包含模板DNA 20-50 ng，Hotstar Taq 0.5U，每条扩增引物0.5pmol，0.1μl的25mMdNTPs；
2)对PCR产物进行碱性磷酸酶处理；
3)在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl，对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系包含SAP处理后PCR产物7μl及EXTEND Mix液2μl(其中各延伸反应引物混合物0.94μl)。
4)将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP芯片上；
5)将点样后的SpectroCHIP芯片进行质谱分析，检测结果分型并输出。
优选地，步骤1)中的PCR扩增反应条件为：94℃4分钟；94℃20秒，56℃30秒，72℃1分钟，45个循环；72℃3分钟；4℃保持。
优选地，步骤2)中，将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：37℃40分钟；85℃5分钟；4℃维持，启动PCR仪进行碱性磷酸酶处理。
优选地，步骤3)中，单碱基延伸反应条件为：
I
94℃
30s
II
94℃
5s
III
52℃
5s
IV
80℃
5s
V
GOTO III
4more times
VI
GOTO II
39more times
VII
72℃
3min
VIII
4℃
forever
。
本发明的有益效果如下：
技术实验设计灵活，结果准确，检测速度快，无需PCR荧光标记，成本大大降低。适合批量筛查。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明做进一步说明，应当理解的是，以下实施例并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
申请人依据OMIM、clinvar等专业遗传数据库，并查阅知网等中文数据库收集了中国人常见的突变，共收集苯丙酮尿症单基因病突变位点20个：
rs62508620、rs199475657、rs672601294、rs199475653、rs62507283、rs62508722、rs62508728、rs199475658、rs62642919、rs199475689、rs199475694、rs281865446、rs199475695、rs199475692、rs199475693、rs199475696、rs199475645、rs1025860114、rs199475684、rs62507334。
通过MassArray技术，如果将20个基因突变位点放在1个反应well中，就需要考虑实验条件不断优化引物。我们采用不同的引物设计软件，如Primr premier、Oligo、VectorNTI Suit、Dnasis、Omiga、Dnastar等，并结合agilent earray design探针设计系统，通过不断优化引物序列，最终将这20个位点的多重PCR扩增压缩至1个well中进行。
表1.不同检测位点的引物及探针序列
编号
检测位点
正链引物
负链引物
探针
1
rs62508620
AGTCATCCATCATGTGTGT
GACCAGGTTCCAGTCATT
CGGTCCAGGTGGTTAC
2
rs199475657
AAGAAGCCAGTCATTCA
GCATTTTAGCAAGAAG
CCACGGTCATAGGGTAA
3
rs672601294
TCGAGGCCGAGACACG
AGCGGGCAGGAGGTAC
AGGGTCGCAGGTCAGC
4
rs199475653
CAACACAGTACGGCCATA
GGCCACACGAGGGCAC
ACGGCATACGCAGTAC
5
rs62507283
CAGGGATCATTACGCA
GTCATAGTTCAGGTCATCC
TCCAAGGTCATAAGTTCAT
6
rs62508722
AGGCAGAGCCCAGTC
GGTCCCCAGTCCCCAGTT
CCCCAGTCAGTAGGCCA
7
rs62508728
CCCAGCCGCAGTAGCAT
GGGAGAAAGGTCCCC
AAGTCATCCAAAGGGTCAT
8
rs199475658
ACCCCAGGTAGCCCCCAT
GAGTACCCCAGTGTC
CATCATTCGGTAGTCGG
9
rs62642919
GGGTCAGCATCACCAT
TCATCAGCCCGCGGGTG
CCGGCGCCAGCCATCCC
10
rs199475689
CAAGGGCAAAGGTGTA
GGACCAGTAGCAGCAA
GGGGTGCCAGCACCAT
11
rs199475694
GCCAGCAAGGTCATTAT
CAGTTTCGAGCAGTCAC
ATCACCGAGTCCCAG
12
rs281865446
GGTAGGGTTCATCACCA
AGGACACAATGTTACAT
GCATCCAACATTCAATC
13
rs199475695
CGGAGACCAGGTACCAT
CCATATCAGCCATTCCG
CCGCACGAGCCAGGTC
14
rs199475692
AGCCAGTAGGACACCATCC
GGGATTCAGGTACATTC
AGCATCACAGTCAGTAAAG
15
rs199475693
GGGACATCGAAGCAGGT
AGGCACCAGCAGAGG
AGGACGGGTGTGAGA
16
rs199475696
GTACGAGCGCATCGC
CATTCCAGTACGGCGTA
CACAGTACCAGTCGCGG
17
rs199475645
AGGCGCGAGTAGAAGC
AAGAGCACACGCCATTT
CAGAAGAAGCAGGTAG
18
rs1025860114
ACACAGATCCGGCAGTA
CCGGGTAACAGGTCAGT
ACCAGTACGCAGTAGG
19
rs199475684
GATCCAGAGTAGCGG
CAGCAAGTACACATCATT
GTAGTCATCATCGGGTCA
20
rs62507334
GTCATCAGTGTCGGAC
GACGCAGCCATACCAG
GTCGGGTGGTGGGTC
根据实际需要，以上引物及探针可以制成试剂盒来使用。
实施例10名疑似苯丙酮尿症的基因检测
1.DNA提取
使用Wizard Genomic DNA purification Kit(Promega)或NucleoSpin Tissue(MN)等试剂盒或类似产品，提取10例血样(已与样本提供者签署知情同意书)中的DNA。用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，基因组DNA电泳条带通常不小于20kb。质检合格的DNA将浓度调整到50ng/μl，转移至384孔板，-20℃储存备用。
2.PCR扩增
PCR扩增采用多重PCR技术，在384孔板中进行，每个反应体系总体积为5μl。
2.1在一个新的1.5ml EP管中配制PCR master mix溶液。
表2.PCR master mix溶液配方表
PCR master Mix
对每个反应，μL
10×PCR Buffer
0.5
MgCl<sub>2</sub>(25mM)
0.4
dNTP mix(25mM)
0.1
HotStar Taq(5U/μL)
0.1
Water
1.9
PCR primermix
1
Total Volume
4
2.2使用24通道加样器，调节加样体积为4μL，在384孔板的每个加样孔中加入PCRmaster mix液。该384孔板即为PCR反应板。
2.3取出已经制备好的DNA样品384孔板，使用24通道加样器，调节加样体积为1μL，每个5μl PCR反应体系中包含模板DNA 20-50 ng，Hotstar Taq 0.5 U，每条扩增引物0.5pmol，0.1μl的25mM dNTPs。
2.4在兼容384孔板的PCR仪上设定PCR反应条件为：94℃4分钟；94℃20秒，56℃30秒，72℃1分钟，45个循环；72℃3分钟；4℃保持。将384孔PCR反应板放置于PCR仪上，启动PCR反应。
3.PCR产物碱性磷酸酶处理
3.1在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimpalkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs。
3.2配制碱性磷酸酶处理反应液，SAPMix。
表3.SAPMix溶液配方表
SAP Mix
对每个反应，μL
Water
1.53
SAP Buffer(10x)
0.17
SAP Enzyme(1.7U/ul)
0.3
Total Volume
2
3.3使用24通道加样器，调节加样体积为2μL，将SAP Mix加入384孔PCR反应板。对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，反应体系总体积为7μl，其中PCR产物5μl，SAP混合液2μl。
3.4将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：37℃40分钟；85℃5分钟；4℃维持，启动PCR仪进行碱性磷酸酶处理。
4.单碱基延伸
4.1在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl。
4.2配制单碱基延伸反应液，EXTEND Mix。
表4.EXTEND Mix溶液配方表
EXTEND Mix
对每个反应，μL
Water
0.619
Extend primer Mix
0.94
iPLEX Bufferplus
0.2
iPLEX terminator
0.2
iPLEX enzyme
0.041
Total Volume
2
4.3使用24通道加样器，调节加样体积为2μL，将EXTEND Mix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系包含SAP处理后PCR产物7μl及EXTEND Mix液2μl。
4.4将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：
表5.PCR反应条件
I
94℃
30s
II
94℃
5s
III
52℃
5s
IV
80℃
5s
V
GOTO III
4more times
VI
GOTO II
39more times
VII
72℃
3min
VIII
4℃
forever
启动PCR仪进行单碱基延伸反应。
5.树脂纯化
5.1将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中；
5.2加16μl水到延伸产物的对应孔内；
5.3将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟，使树脂与反应物充分接触；
5.4离心使树脂沉入孔底部。
6.芯片点样
启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。
7.质谱检测
将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assisted laserdesorption/ionization–time offligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果使用TYPER4.0软件(sequenom)分型并输出结果。
8.查看结果
我们检测了10例样品，其中7例样品中检测到了苯丙酮尿症相关的致病性突变。其他3例样品未得到阳性结果，可能是其他突变。
表6.10例样品的致病性突变检测结果
样品编号
检测结果
突变位点
1
阳性
rs199475653
2
阳性
rs62508722
3
阳性
rs199475684
4
阳性
rs199475692
5
阳性
rs199475696
6
阴性
-
7
阳性
rs672601294
8
阳性
rs62508620
9
阴性
-
10
阴性
-
9.结果验证
我们采用WES方法对7例阳性样品和3例阴性样品进行试验。结果与上面的结果保持基本一致(90％)。
表7.本申请与现有WES法检测结果一致性验证
虽然本方法存在一定的漏检，但是用于初筛可以节约时间和经济成本。