阅读说明：本技术 用于鲤鱼线粒体dna片段扩增的引物组合及其应用 (Primer combination for amplification of carp mitochondrial DNA fragment and application thereof ) 是由 董传举 姜洲 张猛 王良炎 李学军 孔胜楠 于 2019-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合,包括如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:38所示的19组引物对。本发明还公开了一种方法,包括：1)获得待测鲤鱼样本的总DNA；2)以总DNA为模板,采用引物对分别进行聚合酶链式反应,获得扩增产物；3)测序获得序列信息。本发明还公开了该引物组合于科学研究中的应用。本发明通过提供特定灵敏性和高特异性的引物,避免了非特异性扩增的发生,可方便快捷、准确地对鲤的线粒体DNA进行扩增并扩增出19个片段,最终拼接完成后可得到鲤鱼的完整线粒体DNA,长度达到16580bp左右。本发明可为鲤的遗传物质研究提供极大的便利。(The invention discloses a primer combination for amplification of carp mitochondrial DNA fragments, which comprises 19 primer pairs shown as SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 38. The invention also discloses a method, which comprises the following steps: 1) obtaining the total DNA of a carp sample to be detected; 2) respectively carrying out polymerase chain reaction by using the total DNA as a template and adopting primer pairs to obtain amplification products; 3) sequencing to obtain sequence information. The invention also discloses application of the primer combination in scientific research. The invention provides the specific sensitivity and high specificity primer, avoids the occurrence of nonspecific amplification, can conveniently, quickly and accurately amplify the mitochondrial DNA of the carp to obtain 19 fragments, and finally obtains the complete mitochondrial DNA of the carp after splicing, wherein the length of the complete mitochondrial DNA reaches about 16580 bp. The invention can provide great convenience for the research of the genetic material of the carp.)

用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合及其应用。

背景技术

鲤鱼(Cyprinus carpio L.)目前有100多个国家和地区养殖，年产量400万吨以上，是最重要的水产养殖种之一。我国是最大的鲤养殖国和消费国，年产量302万吨，占世界总产量的80％。鲤鱼作为一种重要模型物种，也广泛应用于环境毒理学、发育生物学、生理学、免疫学以及进化基因组学等领域的研究。因此，在过去十几年间，大量鲤鱼基因组资源被广泛开发，包括遗传标记、遗传图谱、BAC数据库、ESTs以及转录组序列等。

因此用聚合酶链式反应将鲤鱼线粒体DNA序列扩增出来，可以为鲤鱼的遗传和进化研究提供科学依据。现在获取鲤鱼DNA序列的方法主要是引物扩增然后测序，但存在的最大问题就是引物灵敏度和特异性较差，经常出现错配、非特异性扩增或扩增不出条带等现象。因此，这一技术的关键是采用尽可能少的引物组合在适合的条件下扩增，得到完整的线粒体DNA片段。亟需一种简捷方便、灵敏性高、特异性强、结果可靠的扩增方法。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供了一种用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合。本发明通过设计特定灵敏性和高特异性的引物，避免了非特异性扩增的发生。本发明用尽可能少的引物组合扩增出完整的鲤鱼线粒体DNA片段，为鲤鱼的遗传研究提供方便。

为此，本发明提供的技术方案为：

一种用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合，包括19组引物对，该19组引物对的序列依次为：如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的第一组引物对，如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示的第二组引物对，如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的第三组引物对，如SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示的第四组引物对，如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的第五组引物对，如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的第六组引物对，如SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:14所示的第七组引物对，如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的第八组引物对，如SEQID NO:17和SEQ ID NO:18所示的第九组引物对，如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的第十组引物对，如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示的第十一组引物对，如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的第十二组引物对，如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示的第十三组引物对，如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的第十四组引物对，如SEQ ID NO:29和SEQ IDNO:30所示的第十五组引物对，如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示的第十六组引物对，如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示的第十七路组引物对，如SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示的第十八组引物对和如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的第十九组引物对，其中，后一组引物对中的上游引物与线粒体DNA互补的位置位于前一组引物对的下游引物与线粒体DNA互补位置的上游。且如SEQ ID NO:38所示的下游引物与线粒体DNA互补的位置处于如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对与线粒体DNA互补的位置之间。

优选的是，所述的用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合中，所述19组引物对分别应用于聚合酶链式反应中。

优选的是，所述的用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合中，聚合酶链式反应中，鲤鱼样本的模板为鲤鱼总DNA。

优选的是，所述的用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合中，所述鲤鱼样本的品种为福瑞鲤、黄河鲤、锦鲤或荷包红鲤。

一种利用所述的引物组合获取到鲤鱼线粒体DNA序列信息的方法，包括如下步骤：

1)获得待测鲤鱼样本的总DNA；

2)以步骤1)提取的总DNA为模板，分别采用所述引物组合中的引物对进行聚合酶链式反应，获得扩增产物；

3)对扩增产物进行测序，之后据所述扩增结果获得序列信息。

优选的是，所述的方法，其特征在于，步骤2)中，进行聚合酶链式反应时，50mL反应体系中包含：DNA聚合酶2个单位，10×聚合酶缓冲液5μL，25mmol/L的MgCl₂ 5μL，10mmol/L的dNTP 1μL，10μmol/L的引物对各2μL，模板DNA100～1 000μg。

优选的是，所述的方法中，步骤2)中，聚合酶链式反应结束后，将所述扩增产物在666.61-1333.22Pa以下范围的接近真空状态和72℃条件下处理10～20min，然后再至于0～4℃进行保存。

优选的是，所述的方法中，步骤1)中，获得待测鲤鱼样本的总DNA的具体方法包括如下步骤：

步骤一、剪取鲤鱼的鳍条，保存于无水乙醇中；

步骤二、用STE缓冲液将鳍条泡洗5h以上，去除无水乙醇，然后取约0.2g鳍条、剪碎，加入0.5mL STE缓冲液、10mg/mL的蛋白酶K15和质量体积比10％的SDS 40μL于50℃水浴4～6h，最后去除蛋白得到所述总DNA。

所述的用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合于科学研究尤其是鲤鱼的遗传物质研究中的应用。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明通过设计出特定灵敏性和高特异性的引物，避免了非特异性扩增的发生。可方便快捷、结果准确地对鲤鱼的DNA进行扩增并扩增出19种片段，最终长度拼接完成后长度16580左右bp。本发明可为鲤鱼的遗传物质研究提供极大的便利。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述的用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合的流程示意图；

图2为本发明其中一个实施例中19对引物的扩增结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

如图1所示，本发明提供一种用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合，包括19组引物对，该19组引物对的序列依次为：如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的第一组引物对，如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的第二组引物对，如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的第三组引物对，如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的第四组引物对，如SEQ ID NO:9和SEQID NO:10所示的第五组引物对，如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的第六组引物对，如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的第七组引物对，如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的第八组引物对，如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的第九组引物对，如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的第十组引物对，如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示的第十一组引物对，如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的第十二组引物对，如SEQ ID NO:25和SEQ IDNO:26所示的第十三组引物对，如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的第十四组引物对，如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示的第十五组引物对，如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示的第十六组引物对，如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示的第十七路组引物对，如SEQID NO:35和SEQ ID NO:36所示的第十八组引物对和如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的第十九组引物对，其中，后一组引物对中的上游引物与线粒体DNA互补的位置位于前一组引物对的下游引物与线粒体DNA互补位置的上游。且如SEQ ID NO:38所示的下游引物与线粒体DNA互补的位置处于如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对与线粒体DNA互补的位置之间。

扩增片段用到引物组合

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述19组引物对分别应用于聚合酶链式反应中。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，聚合酶链式反应中，鲤鱼样本的模板为鲤鱼总DNA。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述鲤鱼样本的品种为福瑞鲤、黄河鲤、锦鲤或荷包红鲤。

一种利用所述的引物组合获取到鲤鱼线粒体DNA序列信息的方法，包括如下步骤：

1)获得待测鲤鱼样本的总DNA；

2)以步骤1)提取的总DNA为模板，分别采用所述引物组合中的引物对进行聚合酶链式反应，获得扩增产物；

3)对扩增产物进行测序，之后据所述扩增结果获得序列信息。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤2)中，进行聚合酶链式反应时，50mL反应体系中包含：DNA聚合酶2个单位，10×聚合酶缓冲液5μL，25mmol/L的MgCl₂5μL，10mmol/L的dNTP 1μL，10μmol/L的引物对各2μL，模板DNA 100～1 000μg。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤2)中，聚合酶链式反应结束后，将所述扩增产物在666.61-1333.22Pa以下范围的接近真空状态和72℃条件下处理10～20min，然后再至于0～4℃进行保存。PCR反应后的真空处理能够有效进一步增加其延长时间和效率，以获得更多扩增后的DNA。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤1)中，获得待测鲤鱼样本的总DNA的具体方法包括如下步骤：

步骤一、剪取鲤鱼的鳍条，保存于无水乙醇中；

步骤二、用STE缓冲液将鳍条泡洗5h以上，去除无水乙醇，然后取约0.2g鳍条、剪碎，加入0.5mL STE缓冲液、10mg/mL的蛋白酶K15和质量体积比10％的SDS 40μL于50℃水浴4～6h，最后去除蛋白得到所述总DNA。

所述的用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合于科学研究中的应用。

本发明在鲤DNA上设计了19对上下游引物，可在其DNA上扩增出19种片段，最终长度拼接完成后长度16580bp左右。

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：

1、取样：剪取鲤的鳍条，保存于无水乙醇中；

2、提取总DNA

用STE缓冲液将组织泡洗5h以上，以去酒精。取约0.2g组织、剪碎，放入1.5mL离心管，每管加0.5mL STE缓冲液、蛋白酶K15μL(10mg/mL)和SDS 40μL(10％)于50℃水浴4～6h。按标准酚氯仿的方法去除蛋白。

STE缓冲液配方0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)

3、引物及PCR扩增

用19对引物扩增DNA不同的区域，所用引物和基本参数如下：

扩增片段用到引物组合

聚合酶链式反应采用TaKaRa公司(大连)的LA Taq DNA聚合酶，反应体系为：LATaq DNA聚合酶2个单位；10×LA Buffer(Mg²⁺free)5μL；MgCl₂(25mmol/L)5μL；10mmol/LdNTP 1μL；10μmol/L引物对各2μL；模板DNA 100～1 000μg；加无菌去离子水至50μL。PCR反应共设30个循环，每一循环包括95℃30s，退火温度如上表所示50s，72℃3min。开始循环前在96℃预先变性1min，循环结束后72℃再延伸15min。为了增强聚合酶链式反应扩增的特异性，反应液在冰上配制，等PCR仪温度升到80℃后，再将离心管放入聚合酶链式反应仪进行反应；

4、电泳聚合酶链式反应结束后，取2μL反应液用0.8％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)的电泳，紫外灯下观察扩增的效果，如图2所示；

5、产物测序将聚合酶链式反应产物送至上海生工生物工程股份有限公司测序；

6、序列拼接拿到19种片段序列后，使用DNAstar软件对19种片段进行拼接，最终长度拼接完成后长度16580bp左右。

本发明的方法分别以福瑞鲤、黄河鲤、锦鲤或荷包红鲤为样品，均扩增得到了其线粒体基因组。

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明。对本发明的用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

如上所述，本发明通过提供特定灵敏性和高特异性的引物，避免了非特异性扩增的发生。可方便快捷、结果准确地对鲤鱼的线粒体DNA进行扩增并得出19个片段，最终长度拼接完成后，为鲤鱼线粒体基因组的全长，长度达到16580bp左右。本发明可为鲤鱼的遗传物质研究提供极大的便利。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南师范大学

<120> 用于鲤鱼线粒体DNA片段扩增的引物组合及其应用

<130> 2018

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcatcaggca caaacatta 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

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<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

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<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

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<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

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<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

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<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

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gttcaggtgc tgtggag 17

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggggactcac agggatc 17

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

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<210> 15

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 25

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

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<210> 26

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

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<210> 27

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 29

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 18

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<213> 人工序列

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<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

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<210> 35

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 36

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

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<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

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