阅读说明：本技术 一种倍半萜类化合物的新的应用 (New application of sesquiterpenoids ) 是由 余华 王一涛 令狐克刚 赵冠丁 于 2019-10-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及药物用途领域,具体而言,涉及一种倍半萜类化合物的新的应用。具体地,提供抑制剂在制备抗炎药物中的应用,抑制剂包括式(1)所示化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂化物、其多晶型物和其互变异构体中的至少一种；<Image he="163" wi="245" file="3.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>式(1)。该抑制剂能够有效抑制LPS诱导所致的一氧化氮(NO)和前列腺素(PGE2)的释放,抑制细胞因子IL-6,TNF-α及MCP-1的分泌以及活性氧ROS的产生。同时,其也可以抑制NF-κB信号通路及下游蛋白iNOS和COX 2的表达,并抑制了激活蛋白AP-1(p-c-Jun)的核移位,使得其具有良好的抑制炎症的效果,起到了良好的炎症抑制作用。(The invention relates to the field of medicine application, in particular to a new application of a sesquiterpenoid. Specifically, the application of an inhibitor in preparing an anti-inflammatory drug is provided, wherein the inhibitor comprises at least one of a compound shown as a formula (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, a solvate thereof, a polymorph thereof and a tautomer thereof; the inhibitor can effectively inhibit the release of Nitric Oxide (NO) and prostaglandin (PGE2) caused by LPS induction, inhibit the secretion of cytokines IL-6, TNF- α and MCP-1 and the generation of Reactive Oxygen Species (ROS), simultaneously inhibit the expression of an NF-kB signal pathway and downstream proteins iNOS and COX 2, inhibit the nuclear translocation of an activator protein AP-1(p-c-Jun), have a good inflammation inhibiting effect and play a good inflammation inhibiting role.)

一种倍半萜类化合物的新的应用

技术领域

本发明涉及药物用途领域，具体而言，涉及一种倍半萜类化合物的新的应用。

背景技术

炎症是机体针对致炎因子损伤产生的一种自我防御反应过程。***素(PGs)及白三烯(LTs)是炎症相关过程中由花生四烯酸(AA)代谢产生的最为重要的炎症介质，参与风湿、类风湿类关节、炎结肠炎、疼痛、哮喘、动脉粥样硬化、中风、阿尔茨海默病、癌症等多种适应症的发生与治疗。在AA的代谢网络中，环氧合酶(COX)是***素PG释放的关键酶，其中环氧合酶-1(COX-1)与生理性PGs的合成密切相关，COX-2多诱导表达，与致炎性PGs的生成相关，因此COX-2是非甾体抗炎药(NSAIDs)治疗中的关键靶标。

在此基础上，人们研发出了COX-2选择性抑制药物如塞来昔布、罗非昔布，该类药物针对两种COX结构上的差异，作用于COX-2特有的结构部位，对COX-2的作用具有高度选择性，减少了药物对生理必须PGs合成的抑制，因而在胃肠道损伤方面有了较明显的改善。但是之后的临床研究发现，这类药物可能会提高心血管类疾病的患病几率，譬如服用罗非昔布的患者患心脏疾病的比例提高。因此，要想克服不良反应治疗炎症，寻找一种更有效、更安全的多靶点的抗炎药物仍然十分重要。

中药豨莶草(Sigesbeckiae Herba)是一个治疗风湿类疾病的传统中医药，在临床上有广泛的应用。但是现有技术中并没记录其含有的哪种单一化合物对炎症有良好的治疗效果。

发明内容

本发明提供了一种倍半萜类化合物的新的应用，旨在提供一种单一化合物通过多靶点的结合抑制炎症的应用，且该化合物抑制炎症的副作用小。

本发明是这样实现的：

本发明实施例提供一种抑制剂在制备抗炎药物中的应用，抑制剂包括式(1)所示化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂化物、其多晶型物和其互变异构体中的至少一种；

进一步地，在本发明较佳的实施例中，抗炎药物为非菌性抗炎药物。该化合物通过MTT实验得知其没有显著的细胞毒性，因此该化合物的抗炎作用不是通过细胞毒性而实现的，也表明可以在细胞水平证实该化合物的安全可靠性。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，抗炎药物为抑制NO和/或PGE₂释放或者抑制iNOS和/或COX-2表达或者抑制IL-6，TNF-α及MCP-1中至少一种细胞因子分泌或者抑制ROS产生的抑制剂类药物。具体的，其有显著抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7的NO过量释放的作用，另外，此类药物还能够有效抑制iNOS的表达，从而进一步的抑制NO的过量释放。其还可以抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7中COX-2的表达及PGE2过量释放，抑从而起到抗炎作用。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，抗炎药物为抑制NF-κB信号通路的抗炎药物；

优选地，抑制NF-κB信号通路是通过抑制IκBα的降解及NF-κBp65 的核移位进行抑制；

优选地，所述抗炎药物为抑制激活蛋白AP-1的核移位的抗炎药物。

具体的，其能够显著的抑制IκBα的降解及NF-κBp65的核移位，从而能够抑制NF-κB炎症信号通路，进而下调iNOS和COX-2的表达及其他炎症细胞因子如IL-6水平，发挥抗炎作用。因此，该化合物可以用于制备抑制NF-κB信号通路达到治疗炎症效果的抗炎药物。

其还能够显著的抑制AP-1(c-Jun)的核移位，发挥抗炎作用。因此，该化合物可以用于抑制AP-1信号通路达到治疗炎症效果的抗炎药物。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，抗炎药物为治疗急性炎症的药物。例如，急性炎症包括扭伤引起的局部炎症。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，抗炎药物为治疗慢性炎症的药物；

优选地，所述慢性炎症包括类风湿关节炎、结肠炎和动脉粥样硬化中的至少一种。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，式(1)所示化合物是从豨莶草中提取得到的倍半萜类化合物；

优选地，提取得到式(1)所示化合物的方法包括：利用乙醇提取，而后冷冻干燥。

本发明实施例还提供一种抑制剂在用于以下(a)-(f)中至少一种情况的抑制药物中的应用：(a)抑制iNOS和/或COX-2表达；(b)抑制TNF- α及MCP-1中至少一种细胞因子分泌；(c)抑制ROS产生；(d)抑制NO和 /或PGE₂释放；(e)抑制NF-κB信号通路的抗炎药物；(f)抑制激活蛋白 AP-1的核移位；

所述抑制剂包括式(1)所示化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂化物、其多晶型物和其互变异构体中的至少一种；

本发明的有益效果是：本发明提供的抑制剂能够有效抑制LPS诱导所致的一氧化氮(NO)和***素(PGE2)的释放，抑制细胞因子IL-6，TNF- α及MCP-1的分泌以及活性氧ROS的产生。同时，其也可以抑制NF-κB信号通路及下游蛋白iNOS和COX 2的表达，并抑制了激活蛋白AP-1(p-c-Jun) 的核移位，使得其具有良好的抑制炎症的效果，起到了良好的炎症抑制作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明实验例1提供的检测结果图；

图2是本发明实验例2提供的检测结果图；

图3是本发明实验例3提供的检测结果图；

图4是本发明实验例4提供的检测结果图；

图5是本发明实验例5提供的检测结果图；

图6是本发明实验例6提供的检测结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例提供一种倍半萜类化合物的新的应用具体说明。

本实施例提供一种式(1)所示化合物，

其为一种倍半萜类化合物，主要是从中药—豨莶草中提取得到。

具体地，提取方法包括：利用乙醇提取，而后冷冻干燥。

以下结合具体实施例对本发明提供的一种倍半萜类化合物的新的应用进行具体说明。

实施例1

本实施例提供一种式(1)所示化合物，编号为LB,即下文LB均表示式 (1)所示化合物

其制备方法如下：

(1)称取700g豨莶草药材粉末，加入50％浓度的乙醇7L，加热至微沸，回流提取1h，冷却后过滤，收集滤液，滤渣按上述方法再用50％浓度的乙醇回流提取2次。合并3次提取液，减压浓缩至700mL；

(2)称取活化的D101大孔树脂700g，加入到上述浓缩液中，静置吸附24h后，装入分离柱。用纯水洗脱至洗脱液接近无色，再依次用适量50％、95％的乙醇洗脱至洗脱液接近无色，合并洗脱液，减压浓缩至适量体积去除乙醇；

(3)取浓缩液10mL，用10mL乙酸乙酯萃取3次，静置分层后收集乙酸乙酯萃取液，合并合并萃取液，氮气吹干。残渣用甲醇溶解后，用制备液相分离。

(4)收集相应的色谱峰，减压浓缩取出有机溶剂，冷冻干燥，得到纯度为的98％以上的LB单体化合物。

实验例1

检测LB对RAW264.7细胞的毒性

具体检测方法：分别在不加入脂多糖(LPS)和加入LPS(1μg/mL)的情况下，分别用LB(0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM 和40μM)处理RAW264.7细胞24小时，然后通过MTT测定检测细胞活力。检测结果参见图1中的A和B，图1中的A为不加入LPS时，不同浓度LB的MTT检测结果；图1中的B为LPS为1μg/mL时，不同浓度LB的MTT 检测结；数据是最小三次独立实验的平均值±SD。

分别在不加入脂多糖(LPS)和加入LPS(1μg/mL)的情况下，分别用 LB(5μM、10μM和20μM)处理RAW264.7细胞24小时，然后通过LDH 测定试剂盒测定培养液中的乳酸脱氢酶(LDH)的含量。检测结果参见图1 中的C，数据是最小三次独立实验的平均值±SD。

与对照相比，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001；与LPS相比， ##p<0.01和###p<0.001；没有显著性差异(NS)，说明LB不具有细胞毒性。

实验例2

检测LB对RAW264.7细胞中NO，PGE₂和促炎蛋白的作用

具体检测方法：RAW264.7细胞分别用LB(5μM,10μM,20μM)预处理 1小时，然后均用LPS(1μg/mL)刺激12小时，收集上清液，采用Griess 试剂检测NO，ELISA试剂盒检测IL-6，MCP-1，TNF-α及PGE₂。检测结果依次参见图2中的(A)-(E)，其中图2中的A为No的检测结果，图2中的 B为IL-6的检测结果，图2中的C为MCP-1的检测结果，图2中的D为TNF- α的检测结果，图2中的E为PGE₂的检测结果。数据是最小三次独立实验的平均值±SD。

根据图2可知，与对照相比，***p<0.001；与LPS相比，##p<0.01 和###p<0.001。说明LB减少了LPS刺激的RAW264.7细胞中NO，PGE₂和促炎蛋白的产生。

实验例3

检测LB对RAW264.7细胞中ROS的作用

具体检测方法：分别用LB(5μM,10μM和20μM)预处理细胞1小时，然后均用LPS(1μg/mL)刺激12小时。在室温下将细胞与DCFH-DA(10 μM，在DMEM中)孵育30分钟后，通过流式细胞仪对阳性细胞用于计数，并用免疫荧光显微镜呈像。流式细胞仪的检测结果参见图3中的A和B，免疫荧光显微镜呈像的检测结果参见图3中的C和D。数据是最小三次独立实验的平均值±SD。

根据图3可知，与对照相比，***p<0.001；与LPS相比，#p<0.05， ##p<0.01和###p<0.001；没有意义(NS)。说明LB抑制LPS刺激的RAW264.7 细胞中的ROS产生。

实验例4

检测LB对iNOS和COX-2的作用

具体检测方法：分别用LB(5μM、10μM和20μM)预处理细胞1小时，然后均用LPS(1μg/mL)刺激12小时。通过蛋白质印迹分析COX-2 和iNOS的表达。检测结果参见图4。数据是最小三次独立实验的平均值± SD。

根据图4可知，与对照相比，***p<0.001；与LPS相比，#p<0.05 和###p<0.001。说明LB抑制iNOS和COX-2的表达。

实验例5

检测LB对RAW264.7细胞中NF-κB的作用

具体检测方法：分别用LB(5μM、10μM和20μM)预处理细胞1小时，然后均用LPS(1μg/mL)刺激1小时，而后进行蛋白质印迹分析以及免疫荧光染色分析。检测结果参见图5，其中，图5中的A为IKKα/β的磷酸化的检测结果，图5中的B为IκBα的磷酸化的检测结果，图5中的 C为核中p65的表达的检测结果，图5中的D为p65向细胞核的易位的检测结果。数据是最小三次独立实验的平均值±SD。

根据图5可知，与对照相比，***p<0.001；###p<0.001与LPS相比。说明LB阻断LPS刺激的RAW264.7细胞中NF-κB的活化。

实验例6

检测LB对RAW264.7细胞中AP-1的作用

具体检测方法：分别LB(5μM、10μM和20μM)预处理细胞1小时，然后用LPS(1μg/mL)刺激1小时。而后通过蛋白质印迹及免疫荧光染色分析p-c-Jun在细胞核中的表达。检测结果参见图6，其中，图6中的A为蛋白质印迹分析结果，图6中的B为免疫荧光染色分析结果，数据是最小三次独立实验的平均值±SD。

根据图6可知，与对照相比，***p<0.001；###p<0.001与LPS相比。说明LB抑制了LPS刺激的RAW264.7细胞中AP-1的激活。

综上所述，本发明提供的化合物能够有效抑制LPS诱导所致的一氧化氮(NO)和***素(PGE2)的释放，抑制细胞因子IL-6，TNF-α及MCP-1 的分泌以及活性氧ROS的产生。同时，其也可以抑制NF-κB信号通路及下游蛋白iNOS和COX 2的表达，并抑制了激活蛋白AP-1(p-c-Jun)的核移位，使得其具有良好的抑制炎症的效果，起到了良好的炎症抑制作用。

以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。