尿液样本rna稳定液及制备方法
阅读说明：本技术 尿液样本rna稳定液及制备方法 (Urine sample RNA stabilizing solution and preparation method thereof ) 是由 朱友杰 孔繁平 于 2019-11-12 设计创作，主要内容包括：本发明本发明公开了一种尿液样本RNA稳定液及制备方法,包括：0.01M-2M的二硫苏糖醇、2M-6M的异硫氰酸胍、1-200mM的乙二胺四乙酸、0.05-0.5mM的焦碳酸二乙酯和超纯水。本发明的制备步骤包括：在超纯水中加入一定量的上述化学试剂,用盐酸调节PH至4-4.2后定容,密封保存。本发明提供的尿液样本RNA稳定液,可以有效保持尿液样品中RNA的稳定性,可实现大体积尿液的保存和运输,并且适合后续RNA提取和荧光RT-PCR。(The invention discloses a urine sample RNA stabilizing solution and a preparation method thereof, wherein the urine sample RNA stabilizing solution comprises the following steps: 0.01M-2M dithiothreitol, 2M-6M guanidinium isothiocyanate, 1-200mM ethylenediaminetetraacetic acid, 0.05-0.5mM diethyl pyrocarbonate, and ultrapure water. The preparation method comprises the following steps: adding a certain amount of the chemical reagent into ultrapure water, adjusting the pH to 4-4.2 with hydrochloric acid, metering the volume, sealing and storing. The urine sample RNA stabilizing solution provided by the invention can effectively maintain the stability of RNA in a urine sample, can realize the storage and transportation of large-volume urine, and is suitable for subsequent RNA extraction and fluorescence RT-PCR.)
技术领域
本发明涉及RNA类样本稳定液，尤其涉及一种尿液样本RNA稳定液及制备方法。
背景技术
液体活检，就是利用人体体液(血液、尿液等体液)作为标本来源检测获取肿瘤相关信息的技术，它是一种简单且非侵入性的组织活检替代方法。具有患者依从性好，特异性好，异质性低，可反复取材等优势。因此，通过液体活检技术来进行癌症的早期筛查具有非常良好的发展前景。
尿液由肾脏产生，经由输尿管到膀胱储存，然后经过尿道排除体外。由于尿液的生理特质，尿液样本对于***肿瘤是十分优秀的液态活检样本来源，因此***肿瘤，如膀胱癌，***癌等都致力于在尿液样本中寻求合适的分子标志物。尤其时***癌，由于***在身体内部，体积小，发生癌变时很难通过其他手段早期发现，然而***直接和尿道相通，***成分可以从尿液中检测到，因此，尿液中的核酸分子可以作为***癌的生物标志物。
然而尿液体积大，核酸浓度低，其中***来源的成分更少，尤其是***特异的RNA分子，本身含量就不高，再加上RNA容易降解，非常容易检测不到，目前尿液RNA检测对于尿液样本要求很高，通常需要在冷藏条件下保存，并须当天送检并完成检测，限制了尿液RNA检测的应用，因此开发一种能够稳定尿液中RNA分子的稳定液对于拓展尿液样本液体活检具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有尿液样本RNA稳定液无法长时间保存的尿液RNA的问题，提供尿液样本RNA稳定液，能有效保持尿液样品中RNA的稳定性，可实现大体积尿液的保存和运输，并且适合后续RNA提取和荧光RT-PCR。
实现本发明目的的技术方案是尿液样本RNA稳定液，包括：0.01M-2M的二硫苏糖醇、2M-6M的异硫氰酸胍、1-200mM的乙二胺四乙酸和超纯水。
所述尿液样本RNA稳定液还包括0.05-0.5mM的焦碳酸二乙酯。
所述尿液样本RNA稳定液的pH值为3-5。
所述尿液样本RNA稳定液优选为由0.1M的二硫苏糖醇、2M的异硫氰酸胍、0.2mM的焦碳酸二乙酯、100mM的乙二胺四乙酸和超纯水组成。
所述的尿液样本RNA稳定液的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：配置AmL超纯水；
步骤二：称取二硫苏糖醇、异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸,加入步骤一的超纯水中搅拌溶解；
步骤三：称取焦碳酸二乙酯，加入步骤二的溶液中混匀；
步骤四：用盐酸调节PH至4-4.2；
步骤四：定容至2AmL密封保存；
其中，确保稳定液满足：0.01M-2M的二硫苏糖醇、2M-6M的异硫氰酸胍、1-200mM的乙二胺四乙酸、0.05-0.5mM的焦碳酸二乙酯。
采用了上述技术方案，本发明具有如下技术效果:
1、本发明提供的尿液样本RNA稳定液能有效保持尿液样品中RNA的稳定性，可实现大体积尿液的保存和运输，并且适合后续RNA提取和荧光RT-PCR。
2、本发明采用二硫苏糖醇作为还原剂，可还原蛋白质二硫键，从而改变尿液中RNA酶的构象，使其失活，保证RNA的长时间保存。
3、本发明采用焦碳酸二乙酯作为RNA酶灭活剂，能有效与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环特异性结合，从而使RNA酶变性失活，确保RNA的保存。
4、本发明采用乙二胺四乙酸作为二价阳离子螯合剂，可竞争性结合RNA酶必需的二甲阳离子，使RNA酶活性降低，减缓RNA的分解。
5、本发明采用异硫氰酸胍作为强变性剂，使用高浓度的异硫氰酸胍可破坏细胞膜，使RNA与蛋白分离，大大提高后续RNA提取的效率及检测。
6、本发明采用超纯水提供稳定剂的液态环境，便于后期生产应用。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1为添加了尿液RNA稳定剂的尿液进行荧光RT-PCR后PSA mRNA的扩增曲线；
图2为不添加尿液RNA稳定剂的尿液进行荧光RT-PCR后PSA mRNA的扩增曲线。
具体实施方式
(实施例1)
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。
本发明提供了尿液样本RNA稳定液，用于解决现有尿液样本RNA稳定液无法长时间保存的尿液RNA和无法实现大体积尿液的保存和运输的问题，为了解决上述问题，本发明的总体思路如下：
步骤一：配置AmL超纯水；
步骤二：称取二硫苏糖醇、异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸,加入步骤一的超纯水中搅拌溶解；
步骤三：称取焦碳酸二乙酯，加入步骤二的溶液中混匀；
步骤四：用盐酸调节PH至4-4.2；
步骤四：定容至2AmL密封保存；
其中，确保稳定液满足：0.01M-2M的二硫苏糖醇、2M-6M的异硫氰酸胍、1-200mM的乙二胺四乙酸、0.05-0.5mM的焦碳酸二乙酯。
下面通过附图以及具体实施例对本发明技术方案做详细的说明，应当理解本申请实施例以及实施例中的具体特征是对本申请技术方案的详细的说明，而不是对本申请技术方案的限定，在不冲突的情况下，本申请实施例以及实施例中的技术特征可以相互组合。
(实施例1)
制备尿液样本RNA稳定液，控制其各成分含量为：二硫苏糖醇0.1M、异硫氰酸胍2M、焦碳酸二乙酯0.2mM、乙二胺四乙酸100mM；按上述步骤配置稳定液。在同一份尿液样本中，分别各取90mL尿液，实验组加入10mLRNA稳定液，对照组加入10mL超纯水，两组都混匀后分成5份，分别在室温下保存0、1、3、5、7天后，使用TRIZOL法提取尿液总RNA，使用NanoDrop(分光光度计)测量RNA的含量，结果如表1所示：
表1
由表1可见，对照组和实验组都在室温下保存0天，1天，3天，5天，7天用同样方法用等体积尿液提取总RNA，测定RNA含量，其中对照组在常温下保存一天后RNA提取量出现明显下降，三天后几乎检出不到RNA，而实验组在常温下保存7天内RNA提取量没有出现明显差异。
(实施例2)
制备尿液样本RNA稳定液，控制其各成分含量为：二硫苏糖醇0.01M、异硫氰酸胍2M、焦碳酸二乙酯0.05mM、乙二胺四乙酸200mM；按上述步骤配置稳定液。在同一份尿液样本中，分别各取90mL尿液，实验组加入10mLRNA稳定液，对照组加入10mL超纯水，两组都混匀后分成5份，分别在室温下保存0、1、3、5、7天后，使用TRIZOL法提取尿液总RNA，使用NanoDrop测量RNA的含量，结果如表2所示：
表2
(实施例3)
制备尿液样本RNA稳定液，控制其各成分含量为：二硫苏糖醇2M、异硫氰酸胍6M、焦碳酸二乙酯0.5mM、乙二胺四乙酸100mM。按上述步骤配置稳定液。在同一份尿液样本中，分别各取90mL尿液，实验组加入10mLRNA稳定液，对照组加入10mL超纯水，两组都混匀后分成5份，分别在室温下保存0、1、3、5、7天后，使用TRIZOL法提取尿液总RNA，使用NanoDrop测量RNA的含量，结果如表3所示：
表3
(实施例4)
制备尿液样本RNA稳定液，控制其各成分含量为：二硫苏糖醇2M、异硫氰酸胍6M、焦碳酸二乙酯0.05mM、乙二胺四乙酸1mM。按上述步骤配置稳定液。在同一份尿液样本中，分别各取90mL尿液，实验组加入10mLRNA稳定液，对照组加入10mL超纯水，两组都混匀后分成5份，分别在室温下保存0、1、3、5、7天后，使用TRIZOL法提取尿液总RNA，使用NanoDrop测量RNA的含量，结果如表4所示：
表4
(实施例5)
制备尿液样本RNA稳定液，控制其各成分含量为：二硫苏糖醇1M、异硫氰酸胍4M、焦碳酸二乙酯0.3mM、乙二胺四乙酸100mM。按上述步骤配置稳定液。在同一份尿液样本中，分别各取90mL尿液，实验组加入10mLRNA稳定液，对照组加入10mL超纯水，两组都混匀后分成5份，分别在室温下保存0、1、3、5、7天后，使用TRIZOL法提取尿液总RNA，使用NanoDrop测量RNA的含量，结果如表5所示：
表5
制备尿液样本RNA稳定液，控制其各成分含量为：二硫苏糖醇0.1M、异硫氰酸胍2M、焦碳酸二乙酯0.2mM、乙二胺四乙酸100mM；按上述步骤配置稳定液。在同一份尿液样本中，分别各取90mL尿液，实验组加入10mLRNA稳定液，对照组加入10mL超纯水，两组都混匀后分成5份，分别在室温下保存0、1、3、5、7天后，提取核酸，然后用一步法荧光RT-PCR检测其中***特异抗原(PSA)基因mRNA。
如图1为对照组的扩增曲线，在保存1天后，Ct值明显下降，在3天后已经检测不出；如图2为实验组的扩增曲线，实验组的扩增曲线呈明显指数扩增S型曲线，Ct值十分相近，表明样品中的PSA RNA一直稳定，由此可见本发明可保护尿液样本中***来源RNA的稳定性至少7天。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。