阅读说明：本技术 肉苁蓉苯乙醇苷在制备治疗心肌肥厚药物中的应用 (Application of cistanche phenylethanoid glycosides in preparation of medicine for treating myocardial hypertrophy ) 是由 由淑萍 樊琼玲 刘涛 赵军 王家威 马龙 于 2019-11-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种肉苁蓉苯乙醇苷类提取物在制备治疗心肌肥厚药物中的应用,利用腹主动脉缩窄术建立大鼠心肌肥厚模型,应用不同剂量的中药肉苁蓉提取物,选取缬沙坦为阳性对照药,经药效学整体动物实验研究,取得了肯定的疗效,并且为心肌肥厚治疗药物的筛选提供了依据。(The invention discloses an application of cistanche phenylethanoid glycosides extracts in preparing a medicament for treating cardiac hypertrophy, wherein a rat cardiac hypertrophy model is established by abdominal aortic coarctation, different doses of traditional Chinese medicine cistanche extracts are applied, valsartan is selected as a positive control medicament, and a positive curative effect is obtained through pharmacodynamic whole animal experiment research, and a basis is provided for screening of the medicament for treating cardiac hypertrophy.)

肉苁蓉苯乙醇苷在制备治疗心肌肥厚药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，更具体地说是涉及肉苁蓉苯乙醇苷在制备治疗心肌肥厚药物中的应用。

背景技术

心肌肥厚为多种心血管疾病的独立危险因素，其在高血压前期被认为是一种代偿机制，它通过增加心室壁的张力以适应压力超负荷和血压的升高；随着心肌肥厚的加重，心肌血液供应需求增加，冠状动脉血流储备减少导致心肌损伤，从而使心血管疾病发病率和死亡率增加。医学上常用利尿剂、钙通道阻滞剂、肾素-血管紧张素系统抑制剂等为治疗高血压和心肌肥厚主要临床用药。但服用这些药物所引起的电解质紊乱、***性低血压、干咳等不良反应不容忽视。因此寻找高效、低毒副作用药物，预防、逆转与治疗高血压心肌肥厚是当前研究的主要问题。

肉苁蓉是一种寄生在沙漠树木梭梭根部的寄生植物，从梭梭寄主中吸取养分及水分。肉苁蓉(Cistance)素有“沙漠人参”之美誉，具有极高的药用价值，是中国传统的名贵中药材。肉苁蓉苯乙醇苷(CPhGs)是肉苁蓉发挥药效的主要物质基础之一，其成分主要为松果菊苷和麦角甾苷。近年来肉苁蓉以其显著的生物活性备受人们的关注，其中肉苁蓉特有的滋养肝肾、调整阳虚和阴虚动物的核酸代谢、促进脱氧核糖核酸合成的功能作用与高血压中医的辨证分型相契合。

研究表明，CPhGs能减轻自由基对心肌线粒体膜和浆网膜造成的损伤，降低MDA含量，减轻心肌超微结构损伤，提高大鼠心肌线粒体抗氧化酶活性，减少心肌梗死面积，提高心肌组织磷酸肌酸激酶活性，对缺血心肌有保护作用，但目前对于CPhGs是否可防治心肌肥厚尚未可知。

因此，如何明确肉苁蓉苯乙醇苷的具体药用机制并将其应用于治疗心肌肥厚的药物中是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明利用腹主动脉缩窄术建立大鼠心肌肥厚模型，应用不同剂量的中药肉苁蓉提取物，选取缬沙坦为阳性对照药，经药效学整体动物实验研究，取得了肯定的疗效，并且为心肌肥厚治疗药物的筛选提供了依据。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

肉苁蓉苯乙醇苷在制备治疗心肌肥厚药物中的应用。

以上技术方案达到的技术效果是：肉苁蓉苯乙醇苷类提取物于肉苁蓉中提取，经研究发现，其可以有效防治、缓解并治疗高血压心肌肥厚，且毒副作用较低，便于进一步对肉苁蓉苯乙醇苷类提取物的功效进行开发并应用，同时为高血压心肌肥厚患者带来了福音。

作为本发明优选的技术方案，肉苁蓉苯乙醇苷能降低心脏LVPWT，增加心脏LVEDD、LVEF和LVFS。

作为本发明优选的技术方案，肉苁蓉苯乙醇苷能降低生物体心重指数。

作为本发明优选的技术方案，肉苁蓉苯乙醇苷能降低血浆中BNP和ET-1水平。

作为本发明优选的技术方案，肉苁蓉苯乙醇苷能降低心肌组织中ANP和β-MHC水平。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种肉苁蓉苯乙醇苷在制备治疗心肌肥厚药物中的应用，通过建立大鼠心肌肥厚模型，探讨了肉苁蓉苯乙醇苷对心肌肥厚的具体联系，并得出了其具体作用机制(即通过减小心脏LVPWT，增加心脏LVEDD、LVEF和LVFS；降低生物体心重指数；降低血浆中BNP和ET-1水平；降低心肌组织中ANP和β-MHC水平)。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为实施例6各组小鼠心肌组织的病理图；

图2附图为实施例6各组小鼠心肌面积表征图；

图3附图为实施例7中以qRT-PCR法检测心肌肥厚基因ANP、β-MHC表达量的表征图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中用到的材料、仪器及试剂

实验动物

雄性SPF级大鼠，84只，体质量(200±20)g，由新疆医科大学动物实验中心提供。动物生产许可证号与合格证号分别为：SYXK(新)2016-0003和SCXK(新)2016-0002。

药物与试剂

肉苁蓉苯乙醇苷(CPhGs)，购自和田帝辰医药生物科技有限公司；缬沙坦，购自北京诺华制药有限公司；0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，购自西安正天药用辅料有限公司；戊巴比妥钠，购自德国Meck公司：大鼠血浆内皮素1(ET-1)和脑利钠肽(BNP)酶联免疫吸附试验试剂盒，购自北京博奥森公司；反转录试剂盒，购自美国Thermo Scientific公司；荧光定量试剂盒，购自大连TaKaRa公司。

主要仪器

飞利浦HD11 XE超声诊断仪(德国Philips公司)；移液器(德国Eppendorf公司)；低温离心机(美国Sigma公司)；基因扩增仪(美国Bio-Rad公司)；全波长自动酶联免疫反应检测仪、QuantStudio实时荧光定量PCR仪(美国Thermo Scientific公司)；电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)，日立7150型全自动生化分析仪。

实施例1CPhGs毒副作用试验

雄性SD大鼠24只，随机分为4组，每组6只：空白组，CPhGs低、中、高(125、250、500mg.kg^-1)组，用0.5％CMC-Na将CPhGs配成不同的浓度，CPhGs用药组按每天设定剂量给予受试物，空白组灌胃给予相同体积的0.5％CMC-Na，大鼠灌胃体积为10ml.kg^-1。每2周检测各组大鼠的体重，灌胃6周后眼眶采取大鼠血液，将血液在室温下静置2小时，3000r/min离心15分钟分离血清。0.5ml血清检测大鼠肝肾功能。实验结果表1和表2。

表1 CPhGs喂养大鼠6周对大鼠体重的影响

表2 CPhGs喂养大鼠6周对血液生化指标的影响

分组	样本量	ALT(U·L<sup>-1</sup>)	AST(U·L<sup>-1</sup>)	CR(mmol·L<sup>-1</sup>)	BUN(mmol·L<sup>-1</sup>)
						空白组	6	45.31±6.49	220.47±48.79	39.72±5.85	5.38±0.97
低剂量组	6	44.98±5.72	208.81±39.06	37.89±6.27	5.39±0.86
						中剂量组	6	46.18±7.06	217.63±45.48	40.13±6.08	5.21±0.92
高剂量组	6	45.35±7.94	214.74±42.67	38.75±5.63	4.97±0.88

由表1和表2可知，各剂量组动物体重与空白组比较，差异无显著性(P>0.05)；血液生化化学检查发现所测各组动物的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(CR)、尿素氮(BUN)与空白组比较，均无显著差异(P>0.05)。以上实验结果初步表明，CPhGs相对安全且无明显毒副作用。

实施例2创建模型

采用腹主动脉缩窄术制备大鼠压力超负荷心肌肥厚模型。雄性SD大鼠70只，随机分为7组：空白组、假手术组、模型组、缬沙坦阳性药对照组、CPhGs低、中、高(125、250、500mg·kg^-1)组。手术过程参考文献(朱林强,周永焯,谢晓明，等.大鼠腹主动脉缩窄术致大鼠慢性心衰的建模与体会[J].现代医院,2015,(10):21-24.)。空白组不进行手术，假手术组分离腹主动脉不予结扎，其余五组予腹主动脉结扎以建立压力超负荷心肌肥厚模型。术后第3天，用0.5％CMC-Na将CPhGs配成不同的浓度，CPhGs用药组及阳性对照组(10mg·kg^-1)按每天设定剂量给予受试物，其余三组均灌胃给予相同体积(10mg/kg)的0.5％CMC-Na，连续42天，每日1次。

实施例3心脏超声指标检测

在2.5％戊巴比妥钠麻醉下，对实施例2各组处理后的大鼠剃毛，然后使用超声诊断仪检测各组大鼠的心功能指标：左心室舒张末期后壁厚度(LVPWT)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室短轴收缩率(LVFS)、左心室射血分数(LVEF)。每只大鼠重复三次测量，取平均值。结果见表3；

表3 CPhGs对腹主动脉缩窄术后心肌肥厚大鼠心脏超声指标的影响

由表3可知，与空白组和假手术组相比，模型组LVEDD、LVPWT显著增加，LVEF、LVFS显著减小，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，阳性对照组和低中高剂量组大鼠的LVPWT降低，LVEDD、LVEF、LVFS增加，随着CPhGs剂量的增加呈现改变逐渐明显的趋势，阳性对照组及中剂量、高剂量组作用显著，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与阳性对照组相比，中剂量、高剂量组各指标没有统计学差异。表明中、高剂量的CPhGs对压力超负荷心肌肥厚大鼠有保护作用，其作用与阳性药物相当。

实施例4大鼠心重指数计算

大鼠结束心脏超声检测后，打开大鼠腹腔，腹主动脉取血至大鼠死亡后，立即开胸，取出大鼠心脏，用预冷的生理盐水冲洗心腔三次，用滤纸吸干水分，称心重。心重指数＝心重/体重；结果见表4；

表4 CPhGs对腹主动脉缩窄术后心肌肥厚大鼠的心重指数的影响

由表4可知，各组大鼠的体重没有明显差异；与空白组和假手术组相比，模型组大鼠的体重和心重显著相加(P<0.01)；与模型组相比，阳性对照组体重和心重显著减小(P<0.01)，CPhGs低、中、高剂量组(P<0.05或0.01)体重和心重有不同程度的减小，且随着剂量的增加呈现逐渐减小的趋势；与阳性对照组相比，CPhGs高剂量组与其接近，差异无统计学意义。表明中、高剂量组可以减小腹主动脉缩窄术后心肌肥厚大鼠的肥厚程度，保护心肌，与缬沙坦组作用相当。

实施例5酶联免疫吸附试验检测大鼠血浆ET-1和BNP水平

将实施例4采集到的血浆储存于EDTA抗凝采血管，混匀后3000r/min离心15min，收集上清，-20℃条件下冻存。按大鼠血浆内皮素1(ET-1)和脑利钠肽(BNP)酶联免疫吸附试验试剂盒说明书操作；结果见表5；

表5 CPhGs对腹主动脉缩窄术后心肌肥厚大鼠血浆BNP和ET-1水平的影响

由表5可知，与空白组和假手术组相比，模型组大鼠的血浆BNP和ET-1水平显著上升(P<0.01)；与模型组相比，阳性对照组大鼠的血浆BNP和ET-1水平显著下降(P<0.01)，CPhGs低中高剂量组组血浆BNP和ET-1水平有不同程度下降，并且随着剂量的增加呈现逐渐减小的趋势，其中剂量组BNP显著下降(P<0.01)、高剂量组BNP和ET-1均显著下降(P<0.01)；与阳性对照组相比，高剂量组BNP和ET-1水平降低，没有统计学差异。表明中、高剂量的CPhGs可以降低腹主动脉缩窄术后心肌肥厚大鼠的血浆BNP和ET-1水平，高剂量组作用强度与阳性对照组相当。

实施例6显微镜观察大鼠心肌组织HE染色结果

从解剖得到的大鼠心脏中分离大鼠心肌组织，并以4％多聚甲醛固定、石蜡包埋后(多聚甲醛和石蜡的用量根据本领域技术人员具体操作而定)，经伊红苏木素染色后以中性树胶封片，电子显微镜下观察心肌组织和细胞形态并拍图。用Image J测量细胞表面积，每组选取四张标本，每张随机选取3个视野，每视野测量10～15个心肌细胞横截面积，计算平均值；结果见图1和图2；

由图1和图2可知，与空白组和假手术组相比，模型组组心肌细胞排列紊乱，组织中可见炎性细胞浸润，单位视野内细胞的数量减少，心肌细胞横截面积显著增大(P<0.01)；与模型组组相比，阳性对照组单位视野内的细胞数量增加，心肌细胞横截面积显著减小(P<0.01)，CPhGs低中高剂量组的心肌细胞横截面积也有不同程度减小，并且随着剂量的增加呈现逐渐减小的趋势，其中中剂量组和高剂量组有明显差异(P<0.05或0.01)；与阳性对照组相比，高剂量组心肌细胞横截面积与其接近，差异无统计学意义。表明中、高剂量CPhGs在一定程度有减小压力超负荷型心肌肥厚大鼠心肌细胞横截面积的作用，当剂量达500mg.kg^-1作用与阳性对照组接近。

实施例7qRT-PCR检测心肌肥厚基因ANP、β-MHC的表达

取50mg心肌样品，Trizol法提取心肌组织总RNA，纯化后紫外分光光度计检测纯度，吸光值(A值)＝A₂₆₀/A₂₈₀>1.8。定量后将RNA反转录为cDNA，取产物2ul在实时荧光定量PCR仪中进行扩增。总反应体系为20ul，扩增条件：95℃30s；95℃3s，60℃30s，40个循环；95℃15s，60℃60s。结束后设基线值、阈值，取循环阈值(Ct)，目的基因相对表达量以采用2^－△△Ct法分析。引物由生工生物工程股份有限公司设计合成，目的基因ANP、BNP和内参β-actin引物序列见表6；结果如图3所示，图中，**P<0.01与空白组和假手术组比较；##P<0.01与模型组比较；P<0.05，P<0.01与阳性对照组比较。由图3可知，与空白组和假手术组比，模型组大鼠的ANP、β-MHC mRNA相对表达水平均显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组大鼠相比，阳性对照组和低、中剂量组的ANP、β-MHC基因相对表达水平均显著下降(P<0.01)；与阳性对照组相比，低、中剂量组表达水平明显较高(P<0.01)，而高剂量组没有明显差异。

ANP-F引物序列如SEQ ID NO.1所示；ANP-R引物序列如SEQ ID NO.2所示；β-MHC-F引物序列如SEQ ID NO.3所示；β-MHC-R引物序列如SEQ ID NO.4所示；β-actin-F引物序列如SEQ ID NO.5所示；β-actin-R引物序列如SEQ ID NO.6所示；

表6 qRT-PCR实验引物序列

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 新疆医科大学

<120> 肉苁蓉苯乙醇苷在制备治疗心肌肥厚药物中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagagcggac taggctgcaa 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcagtggcaa gcgaccaa 18

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgccaatga cgaacctgaa ggag 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctggttgatg aggctggtgt tctg 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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