阅读说明：本技术 一种具有预防和/或治疗冠状动脉微血管病变功效的药物组合物 (Pharmaceutical composition with effect of preventing and/or treating coronary artery microangiopathy ) 是由 郝盼盼 刘燕萍 于 2018-11-07 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种具有预防和/或治疗冠状动脉微血管病变(CMVD)功效的药物组合物。该组合物包含单体化合物红景天苷和丹参乙酸镁,其可提高CMVD时冠状动脉左前降支血流储备(CFR),以及升高CMVD时左室血管密度、改善心肌微循环,用于预防和/或治疗CMVD。(The invention provides a pharmaceutical composition with the efficacy of preventing and/or treating coronary artery microangiopathy (CMVD). The composition comprises monomer compounds of salidroside and magnesium salvianolate, can improve coronary artery left anterior descending branch blood flow reserve (CFR) in CMVD, and increase left ventricular blood vessel density in CMVD, improve myocardial microcirculation, and can be used for preventing and/or treating CMVD.)

一种具有预防和/或治疗冠状动脉微血管病变功效的药物组 合物

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种具有预防和/或治疗冠状动脉微血管病变功效的药物组合物。

背景技术

冠状动脉微血管病变(Coronary microvascular disease，CMVD)是指在多种致病因素的作用下，冠状前小动脉和小动脉的结构和/或功能异常所致的劳力性心绞痛或心肌缺血实验室证据的临床综合征。CMVD患者症状主要表现为劳力相关的胸痛发作，单纯依赖症状很难将CMVD患者与存在严重冠脉狭窄的患者区分开，但是出现下述的临床特点提示患者CMVD的可能性较大。首先，女性多见，约占CMVD患者的56％～79％，但多数女性CMVD患者初次症状发生在绝经期后，与传统女性冠心病患者无异。其次，症状绝大多数是劳累诱发的，但是合并静息性胸痛者也不少见，单纯表现为静息性胸痛的CMVD患者较少。冠脉扩张受损、交感神经刺激和敏感性增高、运动介导的冠脉收缩可导致冠状动脉微血管功能异常的发展，冠脉血流储备降低。患者长期反复发作心绞痛影响生活质量。合并有冠脉血流储备或心肌灌注储备明显减低的患者，尤其是女性患者，有较高的不良心血管事件发生率。

关于药物治疗目前建议采取传统抗缺血治疗方法，使用β受体阻滞剂、钙离子拮抗剂及硝酸酯类药物。如果症状持续存在可选择其他药物包括血管紧张素转化酶抑制剂、他汀类药物、伊伐布雷定、雷诺嗪及***药物，然而临床尚无特异性的药物治疗方法。

红景天又名大株红景天及粗茎红景天，为景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiola L.)植物，为多年生草本或亚灌木植物，因根、茎、花之浸液均呈红色而得名。主要分布在北半球的喜马拉雅山区、亚洲西北部和北美洲，海拔在1600～4000米的高寒、干燥、缺氧、强紫外线照射、昼夜温差大的地区，具有极强的环境适应能力和生命力。全世界约90多种，而我国红景天种类多，野生资源丰富，有70多种，主产于云南西北部、西藏等地。红景天以根和茎入药，味甘、涩，性寒，民间常用于清肺止咳、止血、跌打损伤、烧烫伤、阳痿及糖尿病等病症。红景天的主要成分包括红景天苷(Salidroside)、酪醇、红景天酚、红景天任、红景天素、多糖、黄酮、氨基酸、微量元素、微量挥发油等化合物。红景天的现代研究始于20世纪50年代，人们发现红景天具有与人参、刺五加类似的作用，而且不会出现人参的过度兴奋作用和刺五加致便秘的作用，因而越来越受到人们的广泛重视。基础和临床研究发现，中药红景天具有抗炎、抗氧化应激、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化等生物学作用，并且广泛应用于临床。其最主要活性成分红景天苷具有抗氧化应激、抗衰老、降血脂、降血糖、调节免疫功能等功效。

丹参为唇形科多年生草本植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根，味苦，性微寒，具有活血化瘀、养血安神、凉血消痈和排脓生肌等功效。丹参的有效成分为脂溶性二萜类化合物和水溶性酚酸类化合物，包括丹参多酚、丹参素和丹参酮等多种成分，其中脂溶性的丹参酮可改善血液循环、抗菌及抗炎，而水溶性的丹参多酚具有抗氧化应激、抗栓及细胞保护作用。丹参多酚酸盐含有80％的丹参乙酸镁(Magnesium tanshinoate B)，另外20％是迷迭香酸、紫草酸、丹参素等丹参乙酸镁的同系物。丹参乙酸镁是中药丹参的水溶性提取物中的主要成分，具有抗氧化、抗炎症、保护血管内皮、抑制血管平滑肌细胞增殖与迁移等生物学作用。

发明内容

本发明主要目的是，提供一种用于预防和/或治疗冠状动脉微血管病变(CMVD)的红景天苷和丹参乙酸镁组合物及包载该组合物的双载药壳聚糖纳米颗粒及其制备方法。本发明的药物组合物壳聚糖纳米颗粒可提高CMVD时冠状动脉左前降支血流储备(CFR)，以及升高CMVD时左室血管密度、改善心肌微循环，可用于预防和/或治疗CMVD。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

在本发明的第一方面，本发明提供了一种药物组合物，该组合物包含单体化合物红景天苷和丹参乙酸镁或以单体化合物红景天苷和单体化合物丹参乙酸镁两者作为唯一的活性成分(或有效成分)；该组合物具有预防和/或治疗CMVD的功效；可提高CMVD时CFR，以及升高CMVD时左室血管密度、改善心肌微循环。

红景天和丹参为两种重要的中药材，其成分复杂，比如红景天的主要成分包括酪醇、红景天酚、红景天任、红景天素、红景天苷、多糖、黄酮、氨基酸、微量元素、微量挥发油等化合物，且这些成分的含量往往与红景天的种类、产地相关；而丹参的成分更为复杂，其根主含脂溶性的二萜类成分和水溶性的酚酸成分，还含黄酮类、三萜类、甾醇等其他成分。其中，丹参的脂溶性成分大多为共轭醌、酮类化合物，主要有：外参酮Ⅰ(TanshinoneⅠ)，丹参酮ⅡA、ⅡB、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、隐丹参酮(Cryptotanshinone)、羟基丹参酮(Hydroxytanshinone)、丹参酸甲酯(Methyltanshinonate)、次甲基丹参醌(Methylinitanshingwinoone)、紫丹参甲素(Przewatanshinguinone A)、紫丹参乙素、戊素、丹参新酮(Milti-rone)、1,2-二氢丹参醌(1,2-Di-hydrotanshinguinone)、丹参醇Ⅰ(Tanshinol A)、丹参醇Ⅱ、丹参醇Ⅲ、3α-羟基丹参酮ⅡA、降丹参酮(Mor-tanshinone)、1,2,15,16-四氢丹参醌(1,2,15,16-Tetrahydrotanshin-guinone)、异丹参酮Ⅰ(lsotanshi-none)、异丹参酮Ⅱ、异隐丹参酮(1so-cryptotanshinone)、丹参醌A(Tan-shipuinoneA)、丹参醌B、丹参醌C、丹参酮D、二氢次丹参醌(Dihydrom—iltirone)、二菇萘嵌苯酮(Saloilenone)、丹参螺旋缩酮内酯(1socryptotanshinone)、丹参酚(Shlviol)、丹参醛(Tanshinalde-hyde)。丹参的水溶性成分主要为酚酸类物质有：丹参酸甲(Salvianic acid A)，也称丹参素，D(+)-13,4二羟基苯乳酸、丹参酸乙、丹参酸丙、琥珀酸、丹参酚酸A(Salvianolic acid A)、丹参酚酸B、丹参酚酸C、β-谷甾醇、熊果酸原儿茶醛(Protocatechualdehyde)、咖啡酸、异阿魏酸、迷迭香酸、迷迭香酸甲酯、铁锈醇、替告吉宁、鼠尾草酚、二氢异丹参酮Ⅰ(DihydroisotanshioneⅠ)、△’-丹参新酮(△’-Dehydromihirone)、△’-丹参酮ⅡA(△’-DehydromiltironeⅡA)、鼠尾草列酮(Salvilennone E)、丹参内酯(Tanshinlactone)、丹参二醇A(Tanshindiol A)、丹参二醇B、丹参二醇C、丹参新酮Ⅰ(Miltironel Ⅰ)。

现有方法往往采用丹参或红景天的提取物或药材粉末用于疾病的治疗，但是，中药提取物和药材粉末均为成分复杂的混合物，其中可测的和已知成分是有限的，多数是未知成分，其治疗功效仰赖于混合物的整体作用。其质量控制主要靠指标成分或有效成分，提取物的组成变化引起药效或疗效发生变化，该过程总有不可控的因素也总是存在安全隐患，不利于中药材在现代可续领域中的进一步发展和应用。

与现有技术相比，本发明的药物组合物中的成分选用的是结构确定的单体化合物，本发明的发明人发现，将红景天苷和丹参乙酸镁组合使用对于预防和/或治疗CMVD有着特别好的疗效。

尤其，当红景天苷与丹参乙酸镁按以下含量搭配使用时，具有效果：所述红景天苷与丹参乙酸镁的质量比为1：99～99：1，优选为1-99：1。

尤其地，当该比例为1-2：1，进一步为1.6：1时能实现更好的效果。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种纳米颗粒，其包含红景天苷和丹参乙酸镁两种单体化合物。

如上所述的纳米颗粒为壳聚糖纳米颗粒，壳聚糖包载红景天苷和丹参乙酸镁两种单体化合物组成的药物组合物。

优选地，所述壳聚糖分子量范围300～2000kDa，优选为1800～2000kDa，脱乙酰度大于92％。

优选地，所述药物组合物中，红景天苷与丹参乙酸镁的质量比为1-2：1，优选为1.6：1。

本发明在研究过程中发现，当红景天苷与丹参乙酸镁的质量比为1.6:1，将其制备为壳聚糖纳米颗粒时能够获得更好的药理学研究结果及更好的生物利用度。

优选地，壳聚糖与药物组合物的质量比为0.5-1.5：1，优选为1-2：1，更优选为1-1.5：1。

在本发明的研究结果中发现，当壳聚糖与药物组合物的质量比1-1.5：1时，更容易获得好的包封率和载药量，更好地实现载药量和包封率之间的平衡。

优选地，所述纳米颗粒的粒径集中在100-600nm，优选为200～450nm。

在本发明的第三方面，本发明还提供了制备上述纳米颗粒的方法，其包括以下步骤：

(1)将壳聚糖溶于冰醋酸溶液中，用饱和氢氧化钠溶液调节pH，得溶液I；

(2)将红景天苷和丹参乙酸镁加入三聚磷酸钠(TPP)水溶液中溶解，得混合溶液II；

(3)在磁力搅拌的同时，将溶液II滴加入溶液I中，通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米颗粒；经离心、洗涤、冷冻干燥即得。

优选地，步骤(1)中调节pH值至5.0～6.0；优选地，调节pH值至5.5；

优选地，步骤(1)中，所述壳聚糖与冰醋酸的质量体积比为(12-18)mg：8mL；

优选地，步骤(1)中，所述冰醋酸浓度为10％。

优选地，步骤(2)中，红景天苷与丹参乙酸镁的质量比为1-2：1，优选为1.6：1。

优选地，步骤(2)中，三聚磷酸钠的浓度为0.25mg/mL。

优选地，步骤(2)中，红景天苷、丹参乙酸镁的用量与三聚磷酸钠的质量体积比为13mg：4mL。

优选地，步骤(3)中，所述溶液II的滴加速度为1滴/5秒。

优选地，步骤(3)中，所述离心条件为4℃下15000转/分钟高速离心30分钟。

优选地，壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比为12-18：1。

优选地，壳聚糖与三聚磷酸钠的浓度比(mg/mL)6-9：1。

壳聚糖是带有阳离子的大分子聚合物，其分子量在300～2000kDa尤其在1500-2000kDa，脱乙酰度大于92％，其与带有长链阴离子的三聚磷酸钠通过阴阳离子间的静电作用自发形成纳米颗粒，本发明通过实验发现，当壳聚糖与三聚磷酸钠的浓度比6-9：1或质量比为12-18：1时，能够形成较为良好的纳米颗粒，其粒径在200～450nm之间，Zeta电位的绝对值在30mV左右，低于该浓度则溶液清亮无法形成纳米颗粒，而高于高浓度则容易形成大颗粒的聚集物。

在一个较为优选的实施方式中，上述纳米颗粒通过如下所述的方法制备：

(1)将12～18mg分子量为300～2000kDa的壳聚糖溶于8mL 10％的冰醋酸溶液中，用饱和氢氧化钠溶液调节pH至5.0～6.0，得溶液I；

(2)取8mg红景天苷、5mg丹参乙酸镁加入0.25mg/mL三聚磷酸钠(TPP)水溶液4mL混合搅拌(1200转/分钟)均匀，得溶液II；

(3)将上述混合溶液II以1滴/5秒的速度滴加入溶液I中，通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米颗粒，得到混悬液；将混悬液于4℃下15000转/分钟高速离心30分钟，收集沉淀物，用三蒸水洗涤3次，每次5分钟，冷冻干燥即得。

本发明制备得到的纳米颗粒中红景天苷的包封率可达87.6％，丹参乙酸镁的包封率可达79.1％；纳米粒形态为类球体，粒径集中在100～600nm间。在本发明的药理实验结果可以发现，本发明的纳米颗粒不仅有效地提高CMVD猪模型的CFR，还能提高左室血管密度，表明本发明药物组合物通过促进血管生成改善心肌微循环，进而提高CMVD时的冠脉血流储备并改善心肌缺血缺氧。

在本发明的第四方面，本发明还提供了上述药物组合物或上述纳米颗粒在制备预防和/或治疗CMVD的药物中的应用。

以及，上述药物组合物或上述纳米颗粒在制备改善心肌微循环和/或提高哺乳动物左室血管密度和/或提高哺乳动物左前降支血流储备的药物中的应用。

优选地，所述药物优选为口服制剂，所述哺乳动物优选为人、猪等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

现有的红景天苷或丹参乙酸镁的口服用药往往仅以红景天苷或丹参乙酸镁为有效成分标示，其实际在使用时仍然是包含众多成分的药物提取物或药材粉末的混杂作用结果，这样的结果往往使质量控制困难、药效不稳定、生物利用度低，且未知成分容易带来安全隐患。目前并未有以红景天苷和丹参乙酸镁单体化合物为主要成分的药物组合物，本发明首次发现红景天苷和丹参乙酸镁药物组合物通过改善心肌微循环应用于CMVD治疗/或预防。

本发明将红景天苷和丹参乙酸镁组合物制备成壳聚糖纳米颗粒，壳聚糖可以附着到黏膜的表面，并能打开上皮细胞的紧密联结，因此，壳聚糖可作为大分子药物的促进剂以提高其生物利用度并能达到缓释、长效的目的，壳聚糖与三聚磷酸钠通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米颗粒，实现红景天苷与丹参乙酸镁的包载。其中，对红景天苷的包封率可达87.6％，丹参乙酸镁的包封率可达79.1％；纳米粒形态为类球体，粒径集中在100～600nm间。在本发明的药理实验结果可以发现，本发明的纳米颗粒不仅有效地提高CMVD猪模型的CFR，还能提高左室血管密度，表明本发明药物组合物通过促进血管生成改善心肌微循环，进而提高CMVD时的冠脉血流储备并改善心肌缺血缺氧。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明的壳聚糖纳米颗粒透射电镜示意图(×10⁵)。

图2为本发明的壳聚糖纳米颗粒粒度分布图。

图3为冠状动脉左前降支血流储备(CFR)测量示意图。

图4为本发明的壳聚糖纳米颗粒对CMVD小型猪模型CFR的影响；其中，**P<0.01vs.假手术对照组；^#P<0.05vs.模型组。

图5为本发明的壳聚糖纳米颗粒对CMVD小型猪模型左室血管密度的影响(CD34免疫组化染色在20倍目镜下观察并拍照)；其中，A：CD34免疫组化标记血管内皮(20倍目镜)；B：血管密度定量分析。*P<0.05vs.假手术对照组；^##P<0.01vs.模型组。。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1包载红景天苷和丹参乙酸镁的壳聚糖纳米颗粒的制备

(1)将18mg分子量为1800kDa的壳聚糖溶于8mL 10％的冰醋酸溶液中，用饱和氢氧化钠溶液调节pH至5.5，得溶液I；

(2)取8mg红景天苷(南京景竹医药科技有限公司生产；CAS号:10338-51-9；分子式:C₁₄H₂₀O₇；分子量:300.3)、5mg丹参乙酸镁(上海绿谷制药有限公司提供；PubChem CID：6918234；分子式:C₃₆H₂₈MgO₁₆；分子量:740.9)加入0.25mg/mL三聚磷酸钠(TPP)水溶液4mL混合搅拌(1200转/分钟)均匀，得溶液II；

(3)将上述混合溶液II以1滴/5秒的速度滴加入溶液I中，通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米颗粒，得到混悬液；将混悬液于4℃下高速离心30分钟(15000转/分钟)，收集沉淀物，用三蒸水洗涤3次，每次5分钟，冷冻干燥即得。

实施例2包载红景天苷和丹参乙酸镁的壳聚糖纳米颗粒的制备

(1)将12mg分子量为300kDa的壳聚糖溶于8mL 10％的冰醋酸溶液中，用饱和氢氧化钠溶液调节pH至5.5，得溶液I；

(2)取8mg红景天苷(来源同实施例1)、5mg丹参乙酸镁(来源同实施例1)加入0.25mg/mL三聚磷酸钠(TPP)水溶液4mL混合搅拌(1200转/分钟)均匀，得溶液II；

(3)将上述混合溶液II以1滴/5秒的速度滴加入溶液I中，通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米颗粒，得到混悬液；将混悬液于4℃下高速离心30分钟(15000转/分钟)，收集沉淀物，用三蒸水洗涤3次，每次5分钟，冷冻干燥即得。

实施例3包载红景天苷和丹参乙酸镁的壳聚糖纳米颗粒的制备

(1)将15mg分子量为2000kDa的壳聚糖溶于8mL 10％的冰醋酸溶液中，用饱和氢氧化钠溶液调节pH至5.5，得溶液I；

(2)取8mg红景天苷(来源同实施例1)、5mg丹参乙酸镁(来源同实施例1)加入0.25mg/mL三聚磷酸钠(TPP)水溶液4mL混合搅拌(1200转/分钟)均匀，得溶液II；

(3)将上述混合溶液II以1滴/5秒的速度滴加入溶液I中，通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米颗粒，得到混悬液；将混悬液于4℃下高速离心30分钟(15000转/分钟)，收集沉淀物，用三蒸水洗涤3次，每次5分钟，冷冻干燥即得。

试验例1双载药壳聚糖纳米粒制备工艺优化

将实施例1-3制备得到的包载红景天苷和丹参乙酸镁的壳聚糖纳米颗粒混悬液滴到铜网上，2％磷钨酸钠染色，采用透射电镜观察。所得纳米粒电镜下形态为类球体，如图1所示。利用光散射测定仪测定纳米颗粒制剂的粒径范围，结果显示，双载药壳聚糖纳米颗粒的粒径集中于100～600nm之间。如图2所示。

采用高速冷冻离心法测定纳米颗粒的包载率：离心力作用下，纳米粒沉淀，去离子水重溶后，冷冻干燥，测定纳米粒中药物的含量。离心条件为：4℃下高速离心20分钟(15000转/分钟)，计算公式如下：

包载率＝W₁/W₂×100％

其中，W₁为包封的药物的质量、W₂为体系中药物的总质量。

载药量测量：称取冻干后纳米粒样品m₁溶于10ml容量瓶中，加入二甲亚砜破坏，按照药物检测方法检测药物含量m₂，根据以下公式计算载药率，经计算载药量在28～40％左右。

载药量＝m₂/m₁×100％

表1为实施例1-3包载红景天苷和丹参乙酸镁的壳聚糖纳米颗粒的物理性质以及载药性能。

表1

试验例2双载药壳聚糖纳米颗粒对CMVD的功效研究

(一)实验方法

冠状动脉微血栓形成或血栓栓塞是CMVD的重要原因，建立理想的冠状动脉微血栓形成或血栓栓塞动物模型，是探讨CMVD发生、发展和药效、药理的有价值研究平台。复制CMVD实验动物模型目前多选用猪、犬和大鼠等，其中猪的心血管系统与人类相似，是心血管疾病理想的实验动物模型。在造模方法上，目前常用的主要有机械性栓塞和化学性损伤栓塞两种，前者主要包括冠状动脉内注射微栓塞球法、自体微血栓法，后者主要指冠状动脉内注射月桂酸钠。机械性栓塞主要缺点是该模型为非原位血栓形成，不以血管内皮损伤为起始病因，无临床冠状动脉血管内皮损伤表现，与临床病理生理不符，对药物治疗的研究应用价值较小。因此，我们采用实验用巴马小型猪冠状动脉内注射月桂酸钠方法建立CMVD动物模型。

选用12月龄(体重约30kg)巴马小型猪18只，分为3组，每组6只，分别干预4周。

1.分组干预：

(1)假手术组：主动脉根部注入生理盐水，饲料中添入与干预组同等重量的壳聚糖和三聚磷酸钠；

(2)模型组：主动脉根部注入月桂酸钠(1.0mg/kg)方法建立CMVD动物模型，饲料中添入与干预组同等重量的壳聚糖和三聚磷酸钠；

(3)干预组：主动脉根部注入月桂酸钠，饲料中添入包载药物组合物的壳聚糖纳米颗粒。

将包载实施例1药物组合物的壳聚糖纳米颗粒添加入饲料中，剂量7.5mg/kg/day，分3次给药。造模前3天开始给药干预。假手术组和模型组小型猪给予与干预组同等重量的壳聚糖和三聚磷酸钠。

2.检测指标：

(1)如图3所示，测定冠状动脉左前降支血流储备(CFR)。具体步骤如下：

1)常规超声心动图检查，选取冠脉血流清晰的图像；

2)利用脉冲波多普勒测量静息状态下测量冠状动脉血流速度，当图像完整可测量到最大血流速度后，进行声学造影检查，再次记录冠脉血流速度。

3)然后给予潘生丁0.56mg/kg持续静脉微量泵注射5min，注射结束同时行声学造影检查。记录冠状动脉血流速度。

4)CFR指冠状动脉在充血时舒张期血流峰值速度与冠状动脉在静息状态下血流速度的比值。

其中，经胸冠状动脉多普勒超声检查具体步骤如下：

经胸多普勒超声(TTDE)可以用来测量心外膜冠脉血流速度(CFV)，CFV与冠脉的容积流量正相关。CFV测量时选取左前降支(LAD)远端，因为LAD靠近胸壁且较其他分支易观察。同时应用静脉内用造影剂，其可靠性接近100％。

冠脉声学造影检查具体步骤如下：

1)选择冠脉清晰的图像，激活超声设备实时超声造影检查模式。将聚焦点置于感兴趣区域，调节增益使图像有轻的噪音背景，调节扇区大小和深度，保持图像帧频＞25Hz。

2)造影剂SonoVue(1瓶加入8.5ml无菌生理盐水)团注或采用特殊微量输入泵输入造影剂SonoVue 0.8～0.9ml/min，可手工振荡输入泵保以持微泡均匀分布，随后用5ml生理盐水于20秒以上右肱静脉缓慢推入。

3)输入造影剂后至少需要30秒左心室才开始显像，动态记录冠脉血流信号。采集动态图像包括：2个心动周期、随后触发的高机械指数“闪烁”图像(通常为3～7帧，MI 0.9)。连续动态图像采集应包括冠脉血流信号。PWD测量冠脉血流速度。

(2)分组干预4周后异氟烷吸入麻醉小型猪并将其安乐死，取出心脏。利用CD34免疫组化染色方法标记血管内皮，以评价包载药物组合物的壳聚糖纳米颗粒对血管密度的影响。

免疫组化染色具体步骤如下：

1)应用4％多聚甲醛PBS溶液灌注，取出心脏置于预冷的PBS中。在心室中央平面横切为两半，基底部分固定于4％多聚甲醛PBS溶液中，4℃过夜；PBS冲洗，梯度酒精脱水；石蜡包埋组织并切成4μm厚的组织切片。

2)将4μm厚的石蜡切片常规脱蜡至水：切片64℃烘烤30min后二甲苯脱蜡20min×2次，100％、95％、90％、80％、70％酒精依次浸润5min、4min、3min、2min、2min，自来水洗2min。

3)石蜡切片经常规脱蜡至水、抗原修复、3％H₂O₂孵育、山羊血清封闭后，滴加兔抗猪CD34多克隆抗体稀释溶液(ab150060，购自英国Abcam公司；按1：500稀释)，4℃孵育过夜；PBS洗涤后，加山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718，购自英国Abcam公司；按1：1000稀释)，37℃下孵育1hr；PBS洗涤后，DAB显色；细胞核用苏木素复染4min。利用ImagePro Plus 6.0软件分析结果。

3.统计学分析：

对比各实验组上述指标的测量结果，进行统计学分析。统计学分析具体方法如下：

采用SPSS v19软件进行数据分析。检测结果用平均值±标准误或中位数[四分位数间距]表示，如果服从正态分布，采用方差分析进行组间比较，如果组间差异有统计学意义，进一步采用Bonferroni法进行两两比较。如果不服从正态分布，组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验，如果组间差异有统计学意义，进一步采用Dwass-Steel-Critchlow-Fligner法进行多重比较。双侧P＜0.05时认为差异有统计学意义。

(二)实验结果

如图4所示，CMVD实验用小型猪模型的CFR较假手术组显著下降，而包载药物组合物的壳聚糖纳米颗粒干预可提高CMVD猪的CFR。

如图5所示，CMVD实验用小型猪模型的左室血管密度较假手术组显著降低，而包载药物组合物的壳聚糖纳米颗粒干预可升高CMVD猪的左室血管密度，表明本发明药物组合物及包载该药物组合物的壳聚糖纳米颗粒可通过促进血管生成改善CMVD的心肌微循环，具有预防和/或治疗CMVD的功效。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。