一种检测高度片段化样本的变性增强数字微滴pcr方法

文档序号：1516814 发布日期：2020-02-11 浏览：12次 >En<

阅读说明：本技术 一种检测高度片段化样本的变性增强数字微滴pcr方法 (Denaturation-enhanced digital droplet PCR method for detecting highly fragmented samples ) 是由陈谦刘弘扬刘泓李新新贾海雪于 2019-12-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种检测高度片段化样本的变性增强数字微滴PCR方法。本发明有助于提高痕量高度片段化游离DNA检测灵敏度和特异性。并提供了几组检测游离DNA的寡核苷酸的序列。(The invention discloses a denaturation-enhanced digital microdroplet PCR method for detecting a highly fragmented sample. The invention is beneficial to improving the sensitivity and specificity of the detection of trace high-fragmentation free DNA. And provides several sets of oligonucleotide sequences for detecting free DNA.)

一种检测高度片段化样本的变性增强数字微滴PCR方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及检测高度片段化样本的变性增强数字微滴PCR方法。

背景技术

在痕量临床样本的检验，如ctDNA的液体活检，因其有作为临床重要生物标志物的潜力而备受关注。现阶段精准医学在以下几个方面，面临着艰巨的挑战：1)样品少：2-3ml孕妇外周血只有1个胎儿细胞；1ml全血只有1-100个循环肿瘤细胞；而孕妇及肿瘤患者的外周血中(游离DNA)cfDNA和ctDNA更是少之又少。2)干扰强：肿瘤的异质性以及肿瘤周围大量的正常组织细胞，导致待测目标核酸片段周围存在着数万倍的其它干扰。3)常规PCR反应体系至少需要10个分子，误差在5％以上，而且也难以在3万个野生分子中检测出1个突变分子。4)常规PCR无法分辨2倍以下基因表达差异(或拷贝数差异)，难以鉴定频率低于1％的等位基因。相比于传统PCR(qPCR)技术，数字PCR技术在诸多方面体现出巨大优势，并有望成为未来核酸定量诊断的金标准技术：1)绝对定量，无需标准曲线；2)超高灵敏度，达1/百万；3)高精确度；4)直达单拷贝级最低检出限；5)高耐受性，抗干扰等。

科研人员进行生物学研究时，需要从各种类型的样本中提取核酸(DNA，或RNA)。其中，体液样本含有高度片段化的DNA，又称为游离DNA，对该样本中的DNA进行生物学检测是重要的检测步骤。例如血浆DNA，是血液中细胞外的DNA，以核小体(DNA-蛋白质复合体)的形式存在。这类碎片化的DNA长度在几十至几百碱基对(主峰为166bp)。这类碎片化DNA通常由少量凋亡细胞释放至血液循环系统中，含量极低，现有PCR方法很难检测到可靠信息。

尽管取得了部分进展，但数字PCR技术仍受到有限的可供分析的DNA拷贝的限制。当仅有纳克级级ctDNA时，获得的信息会受到统计抽样误差的影响，并且可供分析的临床相关靶点的数量会减少。在液体活检中，起始物质缺乏是数字PCR及液体活检的瓶颈，因为无论分析敏感性如何，数字PCR技术的检测限不能超过DNA输入上限。

巢式PCR具有富集微量DNA效果，但是巢式PCR易带来非特异扩增，影响检测准确性。短扩增片段PCR由于扩增子片段大小较小，因此引物设计范围较小，难以保证特异性。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测高度片段化样本的变性增强数字微滴PCR方法，提高高度片段化游离DNA检测灵敏度，易于标准化，批间差小，相比巢式PCR非特异扩增少，相比短片段PCR特异性强。

为解决上述技术问题，本发明的提供一种检测高度片段化样本的变性增强数字微滴PCR方法，其包括如下步骤：

(1)从样本中提取cfDNA,

(2)将提取的cfDNA进行末端修复，末端修复反应条件为：30℃保持10-20分钟；65℃保持10-20分钟；得到末端修复游离DNA；

(3)以得到的末端修复游离DNA为模板，使用Raindrop digital PCR System进行微滴生成，然后进行PCR反应，PCR反应程序为：95℃8-10分钟；

重复50个循环：94℃20-35秒，56℃1-3分钟；

98℃10-15分钟，最.后10℃终止；

(4)PCR反应完成后使用Raindrop digital PCR System进行读取实验结果，记录携带对应荧光液滴拷贝数。

本发明优选的技术方案中，所述样本选自血浆DNA、尿液DNA、汗液DNA、唾液DNA、***DNA、胸水DNA、腹水DNA、粪便DNA、化石DNA、石蜡包埋DNA。

本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，末端修复反应体系为：游离DNA 10ng，末端修复酶2μL，反应缓冲液5μL，加入Tris-HCl(10mM)定容反应体系到50μL。

本发明优选的技术方案中，步骤(3)中，反应体系为：末端修复游离DNA 2μL，2XddPCR反应缓冲液10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，Taqman probe-10.5μL，Taqman probe-20.5μL，加入水定容反应体系到20μL。

本发明优选的技术方案中，步骤(4)中，检测荧光的种类包括FAM、HEX、VIC。

技术名词：cfDNA是指,循环游离DNA或者细胞游离DNA，释放到血浆中的降解的DNA片段。

本发明的提供一种检测高度片段化样本的变性增强数字微滴PCR方法，其包括如下步骤：

(A)从样本中提取cfDNA,

(B)将提取的游离DNA进行单管变性增强数字PCR：将提取的cfDNA 10ng，20X末端修复酶0.5μL，2X ddPCR反应缓冲液10μL，上下游引物各1μL，Taqman探针-10.5μL，Taqman探针-20.5μL，加入水定容到20μL，

使用Raindrop digital PCR System进行微滴生成，然后进行PCR反应，PCR反应程序为：30℃10-20分钟，65℃10-20分钟，

重复50个循环：95℃10分钟，94℃30秒，56℃1分钟；

98℃10分钟，最.后10℃终止；

(C)PCR反应完成后使用Raindrop digital PCR System进行读取实验结果，记录携带对应荧光液滴拷贝数。

本发明优选的技术方案中，所述样本选自血浆DNA、尿液DNA、汗液DNA、唾液DNA、***DNA、胸水DNA、腹水DNA、粪便DNA、化石DNA、石蜡包埋DNA。

本发明优选的技术方案中，步骤(C)中，检测荧光的种类包括FAM、HEX、VIC。

本发明第三方面提供一组检测游离DNA寡核苷酸，可用于上述检测方法的引物组合物，由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.4所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQID No.1和SEQ ID No.2分别为扩增BRAF基因的上、下游引物，SEQ ID No.3和SEQ ID No.4分别为扩增BRAF基因V600E位点的探针。

BRAF-15-F2	AGACCTCACAGTAAAAATAGGT	SEQ ID No.1
			BRAF-15-R2	ACAACTGTTCAAACTGATGG	SEQ ID No.2
BRAF-WT	6FAM-TCTAGCTACAGTGAAATCTCGA-BHQ1a	SEQ ID No.3
			BRAF-V600E-Mut	HEX-TCTAGCTACAGAGAAATCTCGA-BHQ1	SEQ ID No.4

本发明还提供一组检测游离DNA寡核苷酸，可用于上述检测方法的引物组合物，由序列表SEQ ID No.5至序列表SEQ ID No.7所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6分别为扩增BRAF基因的上、下游引物，SEQ ID No.3和SEQ ID No.7分别为扩增BRAF基因V600K位点的探针。

BRAF1–15-F1	TTTCTTCATGAAGACCTCACA	SEQ ID No.5
			BRAF2-R1	CCACAAAATGGATCCAGACAACTGT	SEQ ID No.6
BRAF-WT	6FAM-TCTAGCTACAGTGAAATCTCGA-BHQ1	SEQ ID No.3
			BRAF-V600K-Mut	HEX-TCTAGCTACAAAGAAATCTCGAT-BHQ1	SEQ ID No.7

本发明还提供一组检测游离DNA寡核苷酸，可用于上述检测方法的引物组合物，由序列表SEQ ID No.8至序列表SEQ ID No.11所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQ IDNo.8和SEQ ID No.9分别为扩增NRAS基因的上、下游引物，SEQ ID No.10和SEQ ID No.11分别为扩增NRAS基因Q61 K位点的探针。

NRAS-3-F2	GTGAAACCTGTTTGTTGGA	SEQ ID No.8
			NRAS-3-R2	GTCCTCATGTATTGGTCTCT	SEQ ID No.9
NRAS-WT	6FAM-ACAGCTGGACAAGAAGAGTACA-BHQ1	SEQ ID No.10
			NRAS-Q61K-Mut	HEX-ACAGCTGGAAAAGAAGAGTACA-BHQ1	SEQ ID No.11

本发明还提供一组检测游离DNA寡核苷酸，可用于上述检测方法的引物组合物，由序列表SEQ ID No.12至序列表SEQ ID No.15所示碱基序列的寡核苷酸组成；SEQ ID No.12和SEQ ID No.13分别为扩增EGFR基因的上、下游引物，SEQ ID No.14和SEQ ID No.15分别为扩增EGFR基因的L858R位点的探针。

EGFR p.L858R Forward primer	GCAGCATGTCAAGATCACAGATT	SEQ ID No.12
			EGFR p.L858R Reverse primer	CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT	SEQ ID No.13
EGFR p.L858R WT probe	VIC-AGTTTGGCCAGCCCAA-MGB-NFQ	SEQ ID No.14
			EGFR p.L858R MT probe	6FAM-AGTTTGGCCCGCCCAA-MGB-NFQ	SEQ ID No.15

本发明通过模板DNA变性为单链、修复以提高起始模板量，以达到提高痕量游离DNA检测灵敏度、特异性的方法。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1A为实施例1中普通ddPCR检测结果，图1B为实施例1增强ddPCR检测结果；显示增强数字PCR检测突变DNA拷贝能力较普通ddPCR强。

图2为BRAFV600E不同种类样本及实验方法检测到拷贝数比较的统计图，增强数字PCR检测突变DNA拷贝能力较普通ddPCR强。

图3为EGFRL858R不同种类样本及实验方法检测到拷贝数比较的统计图，增强数字PCR检测突变DNA拷贝能力较普通ddPCR强。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。以下结合附图描述本发明具体实施方式。

样本

经验证携带BRAFV600E及L858R突变的患者外周血样本

试剂与仪器

QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen)，基因组DNA提取试剂盒AllPrep DNA/RNAMini Kit(Qiagen)，dNTP Mix(2.5mM)(Takara,4030)，琼脂糖(天根生化，RT101)，

二.实施例

实施例1单管变性增强数字PCR(dddPCR)与常规数字PCR(ddPCR)检测5％BRAFV600E突变检测：

1、样本收集及cfDNA提取

初次靶向用药后60天内收集组织活检样本，将收集的样本进行石蜡包埋，通过苏木素伊红染色后预估肿瘤细胞含量，包含肿瘤组织的样本可用于后续分析,使用商业化试剂盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen)提取基因组DNA。

对血液样本进行采样，采集病人当天空腹静脉外周血。用streck公司EDTA抗凝的真空采血管采集血液样本，采血后30min内分离血浆(1800g，10min，18℃-23℃)，将分离的血浆低于-70℃保存。分离的血细胞用商业化试剂盒AllPrep DNA/RNA Mini Kit(Qiagen)提取基因组DNA，血浆采用QIAamp游离核酸提取试剂盒(Qiagen)按照操作说明提取1.5-4.0ml血浆中的ctDNA用于后续分析。

2.单管变性增强数字PCR反应

将前述步骤1提取的cfDNA进行单管变性增强数字PCR,反应体系如表1所示，PCR反应条件如表2所示：

表1单管变性增强数字PCR反应体系

表2单管变性增强数字PCR反应条件

表3单管变性增强数字PCR反应所用引物及探针

探针名称	序列(5’-3’)	序列号
			BRAF1–15-F1	TTTCTTCATGAAGACCTCACA	SEQ ID No.5
BRAF2-R1	CCACAAAATGGATCCAGACAACTGT	SEQ ID No.6
			BRAF-WT	6FAM-TCTAGCTACAGTGAAATCTCGA-BHQ1	SEQ ID No.3
BRAF-V600K-Mut	HEX-TCTAGCTACAAAGAAATCTCGAT-BHQ1	SEQ ID No.7

3.检测结果如图1所示,显示dddPCR相比于常规ddPCR可以提高阳性液滴数量

表4dddPCR与常规ddPCR对比

实施例2

1、样本收集及cfDNA提取

获取经临床验证携带BRAF V600E血液样本及石蜡包埋组织样本，血液样本经血浆分离提取游离DNA，石蜡包埋组织提取基因组DNA(gDNA)。方法步骤同实施例1步骤1

2.单管变性增强数字PCR反应

将前述步骤1提取的cfDNA进行单管变性增强数字PCR,反应体系如表1所示，PCR反应条件如表5所示，PCR反应条件如表6所示：

表5单管变性增强数字PCR反应体系

试剂名称	体积(μl)
		游离DNA	3ng
20X End Prep Enzyme Mix	0.5μL
		2X ddPCR Supermix for probes	10μl
BRAF-15-F2	1μL
		BRAF-15-R2	1μl
Taqman probe 1	0.5μL
		Taqman probe 2	0.5μL
H<sub>2</sub>O	Up to 20μl

表6单管变性增强数字PCR反应条件

表7 PCR反应所用引物及探针

探针名称	序列(5’-3’)	序列号
			BRAF-15-F2	AGACCTCACAGTAAAAATAGGT	SEQ ID No.1
BRAF-15-R2	ACAACTGTTCAAACTGATGG	SEQ ID No.2
			BRAF-WT	6FAM-TCTAGCTACAGTGAAATCTCGA-BHQ1<sub>a</sub>	SEQ ID No.3
BRAF-V600E-M<sub>u</sub>t	HEX-TCTAGCTACAGAGAAATCTCGA-BHQ1	SEQ ID No.4

结果如图2所示：表8 dddPCR与常规ddPCR对比

dddPCR可使经末端修复cfDNA样本获得与gDNA相同的起始模板量增加倍数，优于未经末端修复cfDNA增加倍数，dddPCR有助于痕量样本检测时增加起始模板量。

实施例3

1、样本收集及cfDNA提取

获取经临床验证携带EGFR L858R血液样本及石蜡包埋组织样本，血液样本经血浆分离提取游离DNA，石蜡包埋组织提取基因组DNA(gDNA)。方法步骤同实施例1步骤12.单管变性增强数字PCR反应

将前述步骤1提取的cfDNA进行单管变性增强数字PCR,反应体系如表1所示，PCR反应条件如表5所示，PCR反应条件如表6所示：

表9单管变性增强数字PCR反应体系

试剂名称	体积(μl)
		游离DNA	3ng
20X End Prep Enzyme Mix	0.5μL
		2X ddPCR Supermix for probes	10μl
EGFR p.L858R Upstream primers	1μL
		EGFR p.L858R Downstream primers	1μl
EGFR p.L858R WT probe	0.5μL
		EGFR p.L858R MT probe	0.5μL
H<sub>2</sub>O	Up to 20μl

表10单管变性增强数字PCR反应条件

表11单管变性增强数字PCR反应所用引物及探针

探针名称	序列(5’-3’)	序列号
			EGFR p.L858R Forward primer	GCAGCATGTCAAGATCACAGATT	SEQ ID No.12
EGFR p.L858R Reverse primer	CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT	SEQ ID No.13
			EGFR p.L858R WT probe	VIC-AGTTTGGCCAGCCCAA-MGB-NFQ	SEQ ID No.14
EGFR p.L858R MT probe	6FAM-AGTTTGGCCCGCCCAA-MGB-NFQ	SEQ ID No.15

结果如图3所示：

dddPCR可使经末端修复cfDNA样本获得与gDNA相同的起始模板量增加倍数，优于未经末端修复cfDNA增加倍数，dddPCR有助于痕量样本检测时增加起始模板量。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实例的限制，上述实例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

序列表

<110> 苏州索真生物技术有限公司

<120> 一种检测高度片段化样本的变性增强数字微滴PCR方法

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 16

<211> 22

<212> DNA