阅读说明：本技术 早期诊断心房颤动用的gan基因 (GAN gene for early diagnosis of atrial fibrillation ) 是由 曹月娟 崔丽 李阳春 张建艳 郭兆增 妥少勇 赵金艳 于 2019-11-05 设计创作，主要内容包括：本发明涉及早期诊断心房颤动用的GAN基因。本发明还涉及用于诊断心房颤动的试剂和方法,所述试剂包括测量GAN基因mRNA和蛋白水平的试剂,所述试剂可用于确定心房颤动的发病或发病的可能性。通过提供用于诊断心房颤动的标志物,可进行心房颤动发病的可能性的早期诊断。(The present invention relates to a GAN gene for early diagnosis of atrial fibrillation. The invention also relates to reagents and methods for diagnosing atrial fibrillation, including reagents that measure GAN gene mRNA and protein levels, which can be used to determine the onset or likelihood of onset of atrial fibrillation. By providing a marker for diagnosing atrial fibrillation, early diagnosis of the possibility of the onset of atrial fibrillation can be performed.)

早期诊断心房颤动用的GAN基因

技术领域

本发明涉及生物医学领域，更具体地，本发明涉及早期诊断心房颤动用的GAN基因。

背景技术

心房颤动简称房颤，是临床上最常见的一种持续性心律失常。房颤时，心房失去了正常有效的收缩功能，处于快速紊乱的颤动状态，频率可以快到300-600次/分钟，心室跳动快速而不规律，可达到100-200次/分钟。房颤是一种常见的心律失常，房颤的发病率随着年龄增加而增高。大约1％的患者年龄<60岁，而75-84岁年龄组的发病率高达12％。房颤的实际发病率可能更高，因为部分患者症状不明显未接受诊治。如果没有得到适当的治疗，房颤可导致严重并发症，给家庭和社会带来沉重负担，房颤已成为日益严重的公众健康问题。

根据房颤的发作时间可将房颤分为以下几种：

阵发性房颤:房颤发作持续在7天内，多数为48小时之内，可自行转复为窦性心律。

持续性房颤:房颤发作持续7天以上,需要药物或电击才能转复为窦性心律。

永久性房颤:不能自行终止或终止后又复发的。

房颤本身并不可怕，但房颤引起的脑卒中、心功能恶化却是病人致死、致残的重要原因。房颤造成患者心悸、胸闷、头晕，甚至晕倒等，导致体力、生活质量明显下降。房颤会诱发或加重并存心脏疾病，导致心衰、肺水肿、心绞痛、休克、猝死等。房颤最严重的问题是会导致血栓栓塞。房颤患者脑卒中发生率是健康人5倍2。房颤时心房丧失收缩功能，血液容易在心房内瘀滞而形成血栓。这些血栓随时可能掉下来随着血液循环到全身各处，一旦“卡”在某处就会引起血管堵塞，造成肢体动脉、肠系膜动脉，甚至脑动脉栓塞，轻者致残，重者导致死亡。需要频繁就医，开支显著增加。

一般而言，房颤最简单、最容易识别的体征就是无规律的脉搏。其症状则大致包括心悸、气短、头晕、昏厥、胸痛或不适等，也有许多房颤患者没有症状或无明显的、特异性的症状，通常在中风后才会诊断出房颤。因此，每年都有患者因潜在房颤引发中风，数百万人过早死亡或终生瘫痪。而这本可以通过预防避免。

本申请在基因层面上筛选与房颤有关的生物标志物，在房颤早期即可实现诊断目的，降低患者中风的概率。

本发明的目的之一在于提供一种GAN基因或其表达产物在制备心房颤动诊断产品中的应用。

本发明的目的之二在于提供一种诊断心房颤动的试剂盒。

本发明的目的之三在于提供一种治疗心房颤动的药物。

本发明的目的之四在于提供一种诊断心房颤动的方法。

为了实现上述目的，本发明首先提供了检测GAN基因或其表达产物在制备心房颤动诊断产品中的用途。

优选地，GAN基因或其表达产物在心房颤动患者中表达下调。

进一步，所述诊断产品包括基因水平的诊断试剂或蛋白水平的诊断试剂。

更进一步，基因水平的诊断试剂包括通过实时荧光定量PCR方法或基因芯片方法检测基因表达水平使用的试剂；蛋白水平的诊断试剂包括通过免疫学方法检测基因表达产物的表达水平的试剂。

优选地，所述实时荧光定量PCR方法包括SYBRGreen法和TaqMan探针法。

优选地，所述基因芯片包括固相载体以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性捕获GAN基因的部分或全部核苷酸序列。

优选地，所述免疫学方法为ELISA检测方法。

优选地，所述ELISA法为使用ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括：包被GAN单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，产物标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。所述抗体可采用市售的单克隆抗体，也可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。

本发明还提供了一种检测心房颤动的试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增GAN基因的引物。

优选地，引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物。

优选地，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、Taq酶、和dNTPs。

优选地，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。

本发明还提供了一种治疗心房颤动的药物组合物。所述药物组合物包含GAN基因或其表达产物的激活剂。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型，包括但不限于，片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。

本发明的药物组合物还可与其他治疗心房颤动的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。

优选地，所述激活剂能促进GAN基因的表达或增强其活性。优选地，所述激活剂通过构建过表达载体的方法促进GAN基因表达。

本发明的激活剂一方面可以用于补充内源性的GAN基因产物的缺失或不足，通过提高内源性产物的表达，从而治疗因内源性产物缺乏导致的心房颤动。另一方面可以用于增强内源性产物的活性，从而治疗心房颤动。

优选地，所述载体是本领域己知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体，病毒等。

本发明提供了一种诊断心房颤动的方法，所述方法包括检测受试者样品中GAN基因表达水平。

本发明还提供了一种治疗心房颤动的方法，所述方法包括促进GAN基因表达。

本发明还提供了GAN基因或其表达产物在制备治疗心房颤动的药物中的应用。

定义

术语“检测”在本文中以最广义使用,包括靶分子的定性和定量测量二者。检测包括仅仅鉴定样品中靶分子的存在以及测定该靶分子是否以可检测水平存在于该样品中。

如本文中使用的术语“生物标志物”指能在样品中检测的指示物,例如预测性,诊断性,和/或预后性的。生物标志物可充当由某些分子,病理学,组织学,和/或临床特征表征的特定亚型的疾病或病症(例如癌症)的指示物。在一些实施方案中,生物标志物是基因。生物标志物包括但不限于多核苷酸(例如DNA和/或RNA),多核苷酸拷贝数目改变(例如DNA拷贝数),多肽,多肽和多核苷酸修饰(例如翻译后修饰),碳水化合物,和/或基于糖脂的分子标志物。

术语“表达水平”指生物学样品中生物标志物的量。“表达”一般指信息(例如基因编码的和/或表观遗传的)转化成细胞中存在并运行的结构的过程。因此,如本文中使用的,“表达”可以指转录成多核苷酸,翻译成多肽,或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)。转录的多核苷酸,翻译的多肽,或多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)的片段也应视为表达的,无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或降解的转录物,或者是源自多肽的翻译后加工,例如通过蛋白水解。

如本文中使用的“扩增”一般指生成想要的序列的多个拷贝的过程。“多个拷贝”指至少两个拷贝。“拷贝”并不必然意味着与模板序列的完全序列互补性或同一性。例如,拷贝可以包括核苷酸类似物诸如脱氧肌苷,有意的序列改变(诸如经由包含与模板可杂交但不互补的序列的引物引入的序列改变),和/或扩增期间发生的序列错误。

如本文中可互换使用的,“多核苷酸”或“核酸”指任何长度的核苷酸聚合物,而且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸,核糖核苷酸,经过修饰的核苷酸或碱基,和/或它们的类似物,或可以由DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸,诸如甲基化核苷酸和它们的类似物。如果存在的话,对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸的序列可以由非核苷酸构件中断。多核苷酸可以在合成之后进一步修饰,诸如通过与标记物缀合。其它类型的修饰包括例如“帽”,将一个或多个天然发生核苷酸用类似物替代,核苷酸间修饰诸如例如那些具有不带电荷的连接(例如甲基膦酸酯,磷酸三酯,磷酰胺酯(phosphoamidate),氨基甲酸酯,等)和具有带电荷的连接(例如硫代磷酸酯,二硫代磷酸酯,等)的,那些含有悬垂模块(pendantmoiety)诸如例如蛋白质(例如核酸酶,毒素,抗体,信号肽,聚L-赖氨酸,等)的,那些具有嵌入剂(例如吖啶,补骨脂素,等)的,那些含有螯合剂(例如金属,放射性金属,硼,氧化性金属,等)的,那些含有烷化剂的,那些具有经过修饰的连接(例如α端基异构核酸(anomericnucleic acid),等)的,以及未修饰形式的多核苷酸。而且,通常存在于糖中的任何羟基基团可以用例如膦酸(phosphonate)基团,磷酸(phosphate)基团替换,用标准保护基团保护,或活化以制备与另外的核苷酸的另外的连接,或者可缀合至固体或半固体支持物。可磷酸化或用胺或1至20个碳原子的有机加帽基团模块取代5’和3’末端OH。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸也可含有本领域普遍知道的糖核糖或脱氧核糖的类似物形式,包括例如2’-O-甲基-,2’-O-烯丙基-,2’-氟-或2’-叠氮-核糖,碳环糖类似物,α-端基异构糖,差向异构糖诸如***糖,木糖或来苏糖,糖吡喃糖,糖呋喃糖,景天庚酮糖,无环类似物和无碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可以用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于如下的实施方案，其中磷酸酯用P(O)S(“硫代酸酯”(thioate)),P(S)S(“二硫代酸酯”(dithioate)),(O)NR₂(“酰胺酯”(amidate)),P(O)R,P(O)OR’,CO或CH₂(“甲缩醛”(formacetal))替换,其中每一个R或R’独立是H或取代或未取代的烃基(1-20个C),任选含有醚(-O-)连接,芳基,烯基,环烷基,环烯基或芳烃基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是同一的。前面的描述适用于本文中提到的所有多核苷酸,包括RNA和DNA。

如本文中使用的,“寡核苷酸”一般指短的,单链的多核苷酸,它们在长度上小于约250个核苷酸,但这不是必须的。寡核苷酸可以是合成的。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述同等且完全可适用于寡核苷酸。

术语“引物”指能够与核酸杂交并容许互补核酸聚合(一般通过提供游离的3’-OH基团)的单链多核苷酸。

术语“诊断”在本文中用于指对分子或病理学状态,疾病或状况的鉴定或归类。

如本文中使用的,术语“样品”指自感兴趣的受试者和/或个体获得或衍生的组合物,其含有要例如基于物理,生化,化学和/或生理特征表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如,短语“疾病样品”或其变型指自感兴趣的受试者获得的任何样品,其预期会或已知含有要表征的细胞和/或分子实体。样品包括但不限于原代或培养的细胞或细胞系,细胞上清液,细胞裂解物,血小板,血清,血浆,玻璃体液,淋巴液,滑液,滤泡液,***,羊水,乳,全血,血液衍生的细胞,尿液,脑脊髓液,唾液,痰,泪液,汗液,粘液,和组织培养液,组织提取物诸如匀浆化组织,细胞提取物和其组合。

“组织样品”或“细胞样品”意味着自受试者或个体的组织获得的相似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织如来自新鲜的,冷冻的和/或保存的器官,组织样品,活检,和/或抽吸物；血液或任何血液组分诸如血浆；体液诸如脑脊髓液,羊水,腹膜液,或间质液；来自受试者的妊娠或发育中的任何时间的细胞。组织样品还可以是原代或培养的细胞或细胞系。任选地,组织或细胞样品是自疾病组织/器官获得的。组织样品可含有在自然界中并不天然与组织混杂的化合物,诸如防腐剂,抗凝血剂,缓冲剂,固定剂,营养物,抗生素,等等。

如本文中使用的,“治疗”指试图改变所治疗的个体的自然进程的临床干预,而且可以在临床病理学的进程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发,缓解症状,削弱疾病的任何直接或间接病理学后果,预防转移,减缓疾病进展的速率,改善或减轻疾病状态,和免除或改善预后。

附图说明

图1显示利用QPCR检测GAN基因在心房颤动患者与正常人中的表达情况；

图2显示评估GAN基因判别能力的ROC曲线。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例GAN基因在房颤患者中差异表达

1、研究对象

病例组样本来源：选取医院行房颤射频消融术患者35例。

对照组样本来源：来自体检中心体检健康志愿者35例。

2、纳入标准

病例组纳入标准：

(1)经过体表心电图或动态心电图检查后确诊为房颤；

(2)发病为非家族性分布；

病例组排除标准：

年龄>80岁，甲状腺功能亢进，糖尿病，血压控制不良(>140和/或>90mmHg，左室功能减低(EF<50％)，严重冠状动脉疾病，肝、肾功能障碍(根据血肌酐水平计算GFR<90m1/min.1.73m²，急、慢性感染疾病，心肌结构性病变。

对照组纳入标准：行体表心电图或动态心电图检查未发现房颤。

3、标本收集

35例房颤患者各于术前取外周血2m1，35例正常对照取外周血2m1分别置于EDTA抗凝管中。

4、Trizol法提取血标本RNA

试剂：白细胞分离液(Cat#:WBC-NH4CL2009，天津灏洋)；细胞洗涤液(Cat#:2010X1118，天津灏洋)；红细胞裂解液(Cat#:WBC-1077，天津灏洋)；TRIzol Reagent(Invitrogen)。

步骤：

(1)提取白细胞：将上述血标本于2小时内加8m1红细胞裂解液混匀，4℃放置10分钟，其间振荡数次，2000g离心5分钟，倒掉液体，重复1-2次后收集沉淀的白细胞。

(2)加入2m1 Trizol使沉淀溶解，室温放置5min。加入0.4mL氯仿，充分振荡15s后室温放置2-3min。12000g离心20min。

(3)小心吸出上层水相，加入1mL异丙醇，室温放置l0min,12000g离心10min。

(4)弃上清，加入2mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀，混合后7500g离心5min。

(5)弃上清，风干10min，以DEPC处理的无酶水溶解RNA，-80℃保存。

(6)紫外分光光度计测定RNA的浓度：将紫外分光光度计调至RNA界面，先用100μlDEPC处理的无酶水调零，再加2μl待测RNA，98μl DEPC处理的无酶水，稀释倍数为1:49，检测，记下浓度值、A260，A280，A320，A260/A280，选用A260/A280:1.8-2.0样本纯度好者。若<1.8提示有蛋白质污染，若>2.0提示有DNA污染，需重新提取样本。

5、逆转录和实时定量PCR

(1)试剂：逆转录试剂盒PrimeScript^TM RT master mix(Takara,RR036Q)；荧光定量PCR试剂盒SYBR green^TMpremix Ex Taq(Takara,RR420Q)。

(2)方法：

扩增使用TRIzol提取样品总RNA：mRNA用随机引物反转录成cDNA；miRNA的3’末端多聚A尾Poly(A)，再使用Anchored oligo(dT)-universal tag通过逆转录引物进行逆转录反应，最终生成miRNA对应的cDNA第一链；根据基因序列设计特异性引物，通过实时荧光定量PCR，采用SYBR GREEN染料法，以GAPDH为内参基因，做目标基因的相对定量检测。GAN基因上游引物序列为：5’-ATATCGGTAATGGTTATGAGAG-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物序列为：5’-CTGCCTGAACAACATCTT-3’(SEQ ID NO.2)；GAPDH基因上游引物序列为：5’-TAAGGAGACAAGCGAACC-3’(SEQ ID NO.3)，下游引物序列为：5’-TGAGGAAATGTACCACCC-3’(SEQ ID NO.4)。

PCR反应体系的配制(总体积20μl)：SYBR green ^TMpremix Ex Taq 10μl，上游引物(10μM)0.4μl，下游引物(10μM)0.4μl，模板cDNA2μl，加ddH₂O至20μl。PCR反应条件：采取在95℃温度下预变性10分钟，继续95℃温度下变性10秒钟后，在60℃温度下退火10s，最后在72℃温度下延伸20秒钟。扩增共完成45个循环的反应程序，在每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应机器为Roche480荧光定量PCR仪，瑞士Roche Roche480每个样本设置3个复孔，保证复孔之间CT值差小于0.5。

(3)实验数据处理

为了便于对所检测样本进行比较,在实时定量PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的阈值,一般这个阈值是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。如果检测到荧光信号超过阈值被认为是真正的信号,它可用来定义样本的阈值循环数(threshold cycles,Ct)。每个模板的Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数存在线性反比关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。每个标本重复3次，Ct值取平均值，ΔCt值＝目标基因Ct值-内参基因Ct值，以GAPDH为对照；ΔΔCt值＝房颤患者目标基因的ΔCt值-正常对照目标基因的ΔCt值，以正常人为对照。以正常对照的目标基因表达量为1,2^-ΔΔCt值即为房颤患者相对正常对照目标基因表达的倍数。

(4)统计分析方法

所有实验数据使用EpiData 3.0软件建立数据库。运用SPSS 16.0软件进行统计分析,房颤患者与正常对照目标基因表达水平的差异分析采用Wilcoxon符号秩和检验,P<0.05为差异有统计学意义。

6、结果

结果显示，与正常对照相比，房颤患者血液中GAN基因表达水平显著下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。利用ROC工作曲线评估GAN基因的判别能力时发现，GAN基因AUC值为0.845，提示GAN基因有较好的临床价值，将有助于心房颤动的诊断。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 天津市人民医院

<120> 早期诊断心房颤动用的GAN基因

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atatcggtaa tggttatgag ag 22

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgcctgaac aacatctt 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taaggagaca agcgaacc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgaggaaatg taccaccc 18