阅读说明：本技术 Kctd10基因在治疗肝脏疾病中的应用 (Application of Kctd10 gene in treatment of liver diseases ) 是由 任凯群 樊安方 马涛 肖轶卉 张健 向双林 于 2019-12-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及基因的应用领域及试验用的医药配制品,具体涉及肝干细胞调控基因Kctd10在小鼠肝脏中特异性敲除模型的建立、鉴定方法、并应用于治疗肝脏疾病药物筛选以及治疗肝脏疾病。利用FLP/Frt,Cre/Loxp重组酶系统首先构建了Kctd10<Sup>flox/flox</Sup>的小鼠模型,再将该小鼠模型与Alb-cre+转基因小鼠品系杂交,获得了Kctd10肝脏特异性基因敲除品系,并予以证实。本发明为人类肝干细胞疾病研究提供在体动物模型,为深入了解肝病发生提供有效的研究途径和方法,为特异性治疗肝脏疾病提供了药物筛选方法,也为治疗肝脏疾病奠定基础。(The invention relates to the field of gene application and a pharmaceutical preparation for experiments, in particular to a method for establishing and identifying a specific knockout model of a hepatic stem cell regulatory gene Kctd10 in mouse liver, and application of the method in screening drugs for treating liver diseases and treating liver diseases. Kctd10 was first constructed using the FLP/Frt, Cre/Loxp recombinase system flox/flox The mouse model is then crossed with an Alb-cre + transgenic mouse strain to obtain a Kctd10 liver-specific gene knockout strain, and the results are confirmed. The invention provides an in-vivo animal model for the research of human liver stem cell diseases, provides an effective research approach and method for deeply knowing the occurrence of liver diseases, provides a drug screening method for specific treatment of liver diseases, and lays a foundation for the treatment of liver diseases.)

Kctd10基因在治疗肝脏疾病中的应用

技术领域

本发明涉及基因的应用领域，涉及体内试验使用的医药配制品。具体涉及肝干细胞调控基因Kctd10在小鼠肝脏中特异性敲除模型的建立、鉴定方法、应用于治疗肝脏疾病药物筛选以及治疗肝脏疾病。

背景技术

肝干细胞的功能和特性与肝脏疾病发生和发展密切相关：在肝受损情况下，肝干细胞发生增殖、分化，维持肝脏的正常功能，肝干细胞实际是肝细胞在特定环境下的一种功能状态。肝干细胞具有自我复制和双向分化潜能，有望成为严重肝疾患细胞替代疗法以及构成生物人工肝的供体细胞，从而成为当前的研究热点之一。研究肝干细胞的分子发育机制并建立相关动物模型对于临床肝病治疗、药物研究等具有非常重要的意义。小鼠模型是研究肝干细胞形成与分化的理想模型。国际同行在小鼠体内敲除关键基因导致肝干细胞过分增殖、干细胞标记基因表达变化而诱导小鼠肝癌的产生。

KCTD10(potassium channel tetramerisation domain-containing 10)是一个钾离子四聚体通道蛋白，属于PDIP1(polymerase delta-interacting protein 1)基因家族。这个基因家族在蛋白结构上高度相似，N端具有共同的BTB/POZ和K-tetra结构域，而在C端则有非常保守的PCNA结合位点。Kctd10基因在进化上高度保守，并在人、牛、小鼠、鸡、非洲蟾蜍及斑马鱼等中编码高度保守的蛋白质。目前，Cre/loxp重组酶系统是用于条件性基因敲除中的基因定位重组系统。发明人惊奇地发现，通过条件性基因敲除小鼠，首先把两个loxP位点放到目的基因的一个或几个重要外显子的两侧构建成嵌合小鼠，再与特定组织中表达Cre酶的小鼠进行杂交，可将两个方向相同的LoxP之间的序列剔除，而不表达Cre酶的组织或细胞不会发生这种剔除现象，从而实现在特定组织或细胞中敲除基因，同时该基因在其他组织或细胞中的表达不受影响的目的。这样可避免胚胎致死性基因对小鼠生长发育的影响，从而能更好地研究基因及其在特定组织或细胞中的生理病理功能的关联性，进而得到本发明创造。

发明人首先建立了Kctd10 Flox(简称Kctd10^flox/+)敲除小鼠模型，该小鼠与EIIa-Cre交配获得的纯合Kctd10敲除小鼠在胚胎期死亡，并证明该蛋白调控Notch信号通路。为了进一步研究KCTD10在肝脏中的生物学功能，探明KCTD10对肝脏干细胞影响机制，本研究利用FLP/Frt，Cre/Loxp重组酶系统首先构建了Kctd10^flox/flox的小鼠模型，再将该小鼠模型与Alb-cre+转基因小鼠品系杂交，获得了Kctd10肝脏特异性基因敲除品系。

本发明为人类肝干细胞疾病研究提供在体动物模型，为深入了解肝病发生提供有效的研究途径和方法，为特异性治疗肝脏疾病提供了药物筛选方法，也为肝脏疾病的基因治疗奠定基础。

发明内容

本发明旨在提供一种肝干细胞调控基因肝脏特异性敲除小鼠模型的构建方法。

本发明另一个目的为提供肝干细胞调控基因肝特异性基因敲除小鼠模型的应用。

本发明目的在于为特异性治疗肝脏疾病提供了药物筛选方法。

Kctd10基因在治疗肝脏疾病中的应用，为非治疗非诊断的用途。

肝干细胞调控基因Kctd10肝特异性敲出的非人哺乳动物模型在筛选治疗肝脏疾病药物中的应用，该应用不直接涉及疾病治疗和诊断应用过程。

其中，所述非人哺乳动物为小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猴、羊、猪。

肝干细胞调控基因Kctd10肝特异性基因敲除非人哺乳动物模型的方法，包括步骤：

(Ⅰ)在Kctd10^flox/flox的小鼠模型中，两个Loxp序列位于Kctd10基因的第二号外显子两侧；

(Ⅱ)将Kctd10^flox/flox的小鼠与FLP ER小鼠交配，得到Neo基因去掉的Kctd10^{flox /flox}小鼠；

(Ⅲ)将(Ⅱ)得到的Kctd10^flox/+小鼠；与Alb-Cre小鼠交配,筛选出Alb-cre+；Kctd10^flox/+小鼠；

(Ⅳ)将(Ⅱ)得到的Kctd10^flox/+和(Ⅲ)得到的Alb-cre+；Kctd10^flox/+小鼠交配，筛选出Alb-cre+；Kctd10^floxflox小鼠，即Kctd10基因肝特异性敲除纯合子小鼠。

其中，步骤(Ⅰ)，由于Loxp序列***到外显子2两侧的内含子里面，所以在没有Cre重组酶的情况下，不会影响基因的正常表达。

肝干细胞调控基因Kctd10肝特异性敲除非人哺乳动物模型的应用。

肝干细胞调控基因Kctd10肝特异性敲除非人哺乳动物模型的鉴定方法，包括步骤：

(Ⅰ)PCR-琼脂糖凝胶电泳鉴定Kctd10肝特异性敲除非人哺乳动物模型的基因型；

(Ⅱ)蛋白质印记实验测定Kctd10肝特异性敲除非人哺乳动物模型的KCTD10蛋白表达情况，从而验证Kctd10基因敲除效果；

(Ⅲ)实时荧光定量PCR技术实验验证Kctd10肝特异性基因敲除非人哺乳动物模型的KCTD10 mRNA表达情况，从而验证Kctd10基因敲除效果。

肝干细胞调控基因Kctd10肝特异性敲除非人哺乳动物模型，用于发现肝干细胞标记基因表达异常。

肝干细胞调控基因Kctd10用于肝脏疾病的基因治疗的应用。

前述任一项的应用，使得KCTD10 mRNA水平降至正常水平的30％左右；KCTD10阳性细胞约减少至正常水平的30％左右。

前述任一项的应用，肝干细胞标记基因Bmi1,Nanog，CD44，ALDH1 mRNA水平(A、B)，蛋白水平(C)明显降低。

前述任一项的应用，肝干细胞标记基因Bmi1阳性细胞约减少至正常水平的60％左右。

前述任一项的应用，调控干细胞的Notch信号通路蛋白水平和mRNA水平发生改变。

前述任一项的应用，调控干细胞的Notch信号通路配体DLL3,Jagged1,Jagged2蛋白水平降低至正常水平的50％左右。

前述任一项的应用，调控干细胞的Notch信号通路下游基因TACE蛋白信号强度降低至正常水平的40％左右。

上述应用均为非治疗非诊断目的。

据此，本发明提供了一种肝干细胞调控基因肝特异性敲除动物模型，用于明确肝干细胞及肝脏的生物学功能，由此提供Kctd10肝特异性基因敲除动物模型及Kctd10肝特异性基因敲除动物模型的鉴定方法，以及用于筛选治疗肝脏疾病药物的用途，和为肝脏疾病的基因治疗奠定基础。

附图说明

图1：Kctd10肝特异性基因敲除小鼠交配方案示意图。

图2：Kctd10肝特异性基因敲除小鼠基因型PCR琼脂糖凝胶电泳鉴定；Alb cre+；Kctd10^flox/flox代表KCTD10肝特异性基因敲除小鼠纯合子，Alb cre-；Kctd10^flox/flox代表KCTD10肝特异性基因敲除小鼠野生型。

图3：特异性敲除小鼠肝脏Kctd10基因后，KCTD10蛋白表达情况。

图4：特异性敲除小鼠肝脏Kctd10基因后，KCTD10 mRNA水平降至正常水平的30％左右。

图5：特异性敲除小鼠肝脏Kctd10基因后，KCTD10阳性细胞约减少至正常水平的30％左右。

图6：该方法获得的小鼠模型中肝干细胞标记基因Bmi1,Nanog，CD44，ALDH1 mRNA水平(A、B)，蛋白水平(C)明显降低。

图7：该方法获得的小鼠模型中肝干细胞标记基因Bmi1阳性细胞约减少至正常水平的60％左右。

图8：该方法获得的小鼠模型中调控干细胞的Notch信号通路蛋白水平和mRNA水平发生改变。

图9：该方法获得的小鼠模型中调控干细胞的Notch信号通路配体DLL3,Jagged1,Jagged2蛋白水平降低至正常水平的50％左右。

图10：该方法获得的小鼠模型中调控干细胞的Notch信号通路下游基因TACE蛋白信号强度降低至正常水平的40％左右。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，建立了Kctd10肝特异性基因敲除小鼠模型，并对鉴定敲除小鼠基因型的方法有很好的指导意义。以下通过实施例进一步说明本发明。

表1：PCR引物表

表2：qPCR引物表

实施例1：Kctd10肝特异性基因敲除小鼠模型的建立

材料及来源：C57BL/6J背景的KCTD10^loxP/+鼠，Alb-Cre和FLP ER小鼠购于南京模式动物研究所。小鼠饲养于湖南师范大学医学院实验动物中心SPF级动物房，许可证号：SYXK(湘)2014-0006。动物房温度控制在20-25℃，湿度在40％-70％，噪音＜60dB，小鼠光照15-20lx 12h(12h明暗周期)，实验室工作照度150-300lx。小鼠饲料垫料均经高温消毒处理，饮水经高温灭菌处理，垫料每7天更换2次，饲料和饮水每日补充。

方法：小鼠交配方案如图1(图1：Kctd10肝特异性基因敲除小鼠交配方案示意图)所示，Kctd10^flox/+小鼠自交，筛选出子代基因型为Kctd10^flox/flox的小鼠；与FLPER小鼠交配，得到Kctd10^flox/flox小鼠；然后分别与C57BL/6小鼠交配去除FLP酶，筛选出Kctd10^flox/+小鼠；与Alb-Cre小鼠交配,筛选出Alb-cre+；Kctd10^flox/+小鼠；将得到的Kctd10^flox/+和Alb-cre+；Kctd10^flox/+小鼠交配,筛选出Alb-cre+；Kctd10^flox/flox小鼠,即肝特异性Kctd10基因敲除小鼠。

实施例2：敲除小鼠模型基因组DNA的提取

材料及来源：小鼠尾巴消化液(500ml配方：1M Tris.HCl(pH8.0)25ml，0.5M EDTA(PH8.0)100ml，NaCl 2.925g，10％SDS 50ml，加水定容至500ml.室温保存)，蛋白酶K(MERCK，Cat No:1245680100,100mg，4℃保存)加纯水稀释为10％分装后-20℃保存。

方法：剪取8-12天龄小鼠的尾巴约0.5-1.0cm，剪脚趾编号，将脚趾与尾巴一同放入1.5ml EP管内，每管加入500ul尾巴消化液及10ul蛋白酶K放入水浴锅调温至56℃，消化过夜。消化好的尾巴用力摇匀后，每管加入等体积(500ul)酚氯仿混匀，离心，12000rpm,10min，4℃；转移200ul上清至灭菌后标记好的1.5ml EP管，加入2倍上清体积(即400ul)无水乙醇上下颠倒混匀，可以见到白色丝状物即为DNA；离心去除无水乙醇，12000rpm，5min，4℃；弃去上清，加入2倍上清体积(即400ul)70％乙醇，离心去除无水乙醇，12000rpm，5min，4℃；再次弃去上清，晾干＞30min；每管加入100ul TE溶解DNA，4℃保存。

实施例3：PCR鉴定Kctd10肝特异性基因敲除小鼠模型及野生型的基因型(结果见图2。图2：Kctd10肝特异性基因敲除小鼠基因型PCR琼脂糖凝胶电泳鉴定；Alb cre+；Kctd10^flox/flox代表KCTD10肝特异性基因敲除小鼠纯合子，Alb cre-；Kctd10^flox/flox代表KCTD10肝特异性基因敲除小鼠野生型。)

材料及来源：引物合成与生工生物工程(上海)股份有限公司：引物如表1；2×TagPlus Master MixⅡ(Dye Plus)保存于-20℃)及Ultra GelRed(10000×)(Vazyme code:GR501-01 0.5ml L/N 7E142H7)购自Vazyme公司，DNA marker(北京鼎国昌盛公司，NMW016,-20℃保存)琼脂糖粉，电泳液TBE，Ⅰ级纯水本实验室提供，0.2ml PCR八连管(Axygen公司)，1.5ml离心管灭菌后使用，枪头(公司)灭菌后使用，核酸染料，微波炉。方法：配好体系，加入PCR 8连管后，上机。PCR跑完，配制1％(w/v)琼脂糖胶(1g加100mlTBE溶液)，微波加热三次后冷却待其未凝时加入核酸染料(1：10000即10ul)，将胶倒入制胶膜具凝固后即可上样。恒压120mv,20min即可紫外投射观察条带。

实施例4：提取Kctd10肝特异性基因敲除小鼠及野生型的蛋白

材料及来源：RIPA强裂解液(碧云天)，PMSF蛋白酶抑制剂，冰，离心机方法：用组织匀浆机匀浆上述冻存的加入(200：1)RIPA强裂解液(碧云天):PMSF蛋白酶抑制剂后的小鼠肝组织并置于冰(本实验室制备)上30min，离心机离心12000rPm,10min,4℃，之后吸取上清与新EP管加入5×loading buffer(北京鼎国昌盛公司，WB-0091,5ml,-20℃保存)(4：1即组织：上样缓冲液)。

实施例5：Kctd10肝特异性基因敲除小鼠及野生型的蛋白质浓度

测定材料及来源：BCA试剂盒(碧云天)，96孔板，纯水，酶标仪测定未变性前的蛋白溶度。方法：按BCA说明书配制好体系，加入96孔板后，放入37℃温箱孵育30min，酶标仪测定562nm处各加样孔吸光值，根据所测得的标准曲线算出样本的溶度及下一步蛋白质印迹实验上样体积。

实施例6：蛋白质印迹实验测定Kctd10肝特异性基因敲除小鼠及野生型的KCTD10蛋白及干细胞标记蛋白，Notch信号通路相关蛋白表达情况

材料及来源：10％聚丙烯酰胺凝胶预混液(新塞美，Cat:P40650，600ml)，蛋白marker，电泳液(1L配方：Tris碱3.03g，甘氨酸18.77g，SDS 1g，加水定容至1L)，转膜液(1L配方：Tris碱3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，加水定容至1L)，Bio-rad电泳转膜槽，PVDF膜(Immobilon)，甲醇，ECL化学发光液(Vazyme,E411-04,4℃保存)，KCTD10抗体(发明人课题组提取，兔源)，GAPDH抗体(谷歌生物，GB11002，100ul，-20℃保存，Rabbit anti GAPDHantibody)，兔二抗，脱脂奶粉，BSA，TBS，吐温，立春红染色液(碧云天，P0022，Lot：0624161690908，120ml，室温保存)，摇床。方法：将测定好浓度的Kctd10肝特异性基因敲除小鼠及野生型小鼠的蛋白100℃变性10min，按照制胶说明制备10％胶，点样后恒压150mv电泳50min，转膜恒流150mA 60min，转膜完毕用5％(2.5g加50mlTBST溶液)(w/v)脱脂奶粉封闭1h，TBST洗一下后，孵育GAPDH和KCTD10一抗，4℃过夜；第二天，摇床上TBST洗膜10min×3次，转速90次/min；洗完摇床上室温孵育兔二抗1h，转速60次/min；TBST洗膜10min×3次，现配现用ECL化学发光显影液，显影，结果如图3，图6(图3：特异性敲除小鼠肝脏Kctd10基因后，KCTD10蛋白表达情况)。

实施例7：提取Kctd10肝特异性基因敲除小鼠模型及野生型的RNA

材料及来源：Trizol试剂(美国Invitrogen Lot：00389377，100ml，4℃保存)，DEPC水(生工公司，Lot：B226BA4474，100ml，常温保存)，异丙醇，氯仿，75％乙醇，冰，计时器，标记笔，电动研磨钻(天根公司)，无酶1.5mlEP管，RNA提取后用酶标仪测浓度和琼脂糖胶测其纯度。方法：取出冻存-80℃冰箱的组织后，每管加入500ultrizol(1mltrizol组织体重不超过50mg)，电动研磨均匀后，补加500ul trizol，总共1ml室温静置5min。加入200ul氯仿，用力摇匀15s,室温孵育3min，12000g，15min，4℃离心。取上清500ul于新的EP管加入等体积500ul异丙醇室温孵育10min，12000g，10min，4℃。去除上清，每管加入1ml 75％乙醇，7500g，5min，4℃离心。去除上清，短暂干燥后加入100ul DEPC水溶解。取2ul测浓度，2ul跑琼脂糖(1％)胶测纯度。

实施例8：逆转录Kctd10肝特异性基因敲除小鼠模型及野生型的RNA

材料及来源：HiscriptⅡReverse Transcriptase SuperMix for qPCR(Vazyme,R223-01,-20℃保存)，PCR仪(eppendorf)。方法：10ul逆转录体系方法：算出500ng模板加的体积(根据具体情况稀释合适浓度)，每个模板(置于冰上)加RNase free ddH2O总共6ul,再加入4×gDNA wiper Mix2ul，混匀后42℃2min。加入每管5×HiscriptⅡReverseTranscriptase SuperMixⅡ2ul，吹打混匀，设定逆转录PCR程序上机，产物保存于-20℃。

实施例9：实时荧光定量PCR实验测定Kctd10肝特异性基因敲除小鼠模型及野生型的KCTD10 mRNA及干细胞标记基因mRNA表达情况

材料及来源：引物36B4合成于生工生物工程(上海)股份有限公司，KCTD10合成于湖南擎科生物技术有限公司(具体如下表2)，SYBR GreenMasterMix(Vazyme,Q111-02,-20℃保存)，96孔PCR低位管(Bio-rad)，qPCR仪(Bio-rad)，无酶的枪头。方法：实时荧光定量PCR 10ul体系，(注：Bio-rad仪器无需加入Rox校正)，样品模板1：20(1ul加20ul DEPC水)稀释，点样三个生物学重复和三个技术重复，2个NC(空白对照)，结果如图4，图5(图4：特异性敲除小鼠肝脏Kctd10基因后，KCTD10 mRNA水平降至正常水平的30％左右。图5：特异性敲除小鼠肝脏Kctd10基因后，KCTD10阳性细胞约减少至正常水平的30％左右)。

经过测定，如图6所示，本文方法获得的小鼠模型中肝干细胞标记基因Bmi1,Nanog，CD44，ALDH1 mRNA水平(A、B)，蛋白水平(C)明显降低。如图7所示，所获得的小鼠模型中肝干细胞标记基因Bmi1阳性细胞约减少至正常水平的60％左右。如图8所示，所获得的小鼠模型中调控干细胞的Notch信号通路蛋白水平和mRNA水平发生改变。如图9所示，所获得的小鼠模型中调控干细胞的Notch信号通路配体DLL3,Jagged1,Jagged2蛋白水平降低至正常水平的50％左右。如图10所示，所获得的小鼠模型中调控干细胞的Notch信号通路下游基因TACE蛋白信号强度降低至正常水平的40％左右。