阅读说明：本技术 一种基于snp标记鉴定京科糯2000玉米杂交种纯度的方法 (Method for identifying purity of Jingke waxy 2000 corn hybrid based on SNP marker ) 是由 王蕊 田红丽 许理文 卢柏山 于 2019-11-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种基于SNP标记鉴定京科糯2000玉米杂交种纯度的方法,本发明基于384个SNP位点,采取高通量的KASP技术平台,利用500多份样品进行试验效果、生物学特征以及多态参数的综合评估,最终确定高质量、高稳定性、高多态、高杂合率的4个SNP标记,并设计扩增每个SNP标记的3条引物共12条引物,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-12。利用这4对引物组合可以鉴定京科糯2000的种子纯度,能够鉴定出自交苗、回交苗、异型株,本发明拓展了玉米杂交种纯度鉴定标记类型和方法,为京科糯2000的推广种植提供了强有力的技术保障。(The invention provides a method for identifying the purity of Jingke waxy 2000 corn hybrid based on SNP markers, which is based on 384 SNP sites, adopts a high-flux KASP technical platform, utilizes more than 500 samples to carry out comprehensive evaluation on test effect, biological characteristics and polymorphic parameters, finally determines 4 SNP markers with high quality, high stability, high polymorphism and high heterozygosity, designs 3 primers for amplifying each SNP marker, and has 12 primers with nucleotide sequences as SEQ ID NO. 1-12. The 4 pairs of primer combinations can be used for identifying the seed purity of the Jingke glutinous 2000, and identifying the self-bred seedling, the backcrossed seedling and the abnormal-shaped strain.)

一种基于SNP标记鉴定京科糯2000玉米杂交种纯度的方法

技术领域

本发明属于农作物分子生物学技术领域，具体地说，涉及一种基于SNP标记鉴定京科糯2000玉米杂交种纯度的方法。

背景技术

种子是农业的基本生产资料，优良品种的增产潜力，容易受到种子纯度的影响。纯度鉴定，是判定商业化种子质量是否合格的指标之一，也是杜绝假冒伪劣种子流入市场的重要手段，还是种子企业进行产品质量控制的重要途径。建立快速高效、低成本、高通量的种子纯度鉴定方法，十分有利于提高种子质量监测、促进规范化生产经营、保障种业企业和农民的切身利益。

传统的田间鉴定方法，需要观察发育阶段品种的特征特异，存在周期长、工作量大、易受环境影响等缺陷。随着分子生物学技术的发展，基于DNA多态性的分子标记正逐渐成为农作物种子鉴定的有力工具。SNP(single nucleotide polymorphism)标记由于具有共显性、二等位基因变异、易实现高通量检测等特征被认为最适宜用于种子纯度检测的标记之一。

玉米杂交种京科糯2000(京糯6、白糯6)是由北京市农林科学院玉米研究中心选育的优良品种，2006年通过国家审定(国审玉2006063)；具有品质优，产量高，可适应粮、经、饲、果等多用途加工的特点；自审定推广种植以来一直占据全国糯玉米的主导地位。

已报道玉米种子纯度鉴定方法有田间小区种植鉴定、同工酶蛋白电泳、SSR标记的鉴定方法，基于SNP标记的纯度鉴定方法还没有报道。已报道的方法存在鉴定周期长，工作量大，易受环境或发育阶段影响，不易形成高通量检测方法等问题。

发明内容

本发明的目的是提供适用于KASP技术的一种基于SNP标记鉴定京科糯2000玉米杂交种纯度的方法，该方法稳定、结果准确，可高通量鉴定京科糯2000玉米及其杂交种的纯度。

为了实现本发明目的，本发明利用“玉米DNA指纹库及品种分子鉴定SNP核心位点组合-maizeSNP384”(ZL 201410756086.0)专利公布的384个SNP位点作为起始位点集合，并建立了335个玉米国审杂交种SNP-DNA指纹数据。选取192个不同玉米杂交种，采取快速法提取、CTAB、试剂盒、多种方法提取DNA，基于KASP技术体系，利用不同方法提取的DNA验证位点的分型效果、重复性、稳定性，获得候选位点集合。利用200份不同类型玉米自交系，335个玉米杂交种数据，分别评估引物的多态性参数PIC(多态信息指数)、MAF(低等位基因频率)以及DP(品种识别能力)；依据PIC和MAF值大于0.35，DP值大于0.5进一步筛选。利用335份玉米杂交种的指纹数据，分析位点杂合率，杂合率值大于0.45进行筛选。

经过上述多级评估筛选，基于京科糯2000及其双亲的指纹数据，确定了4对适于京科糯2000种子纯度鉴定的引物组合；3对引物的京科糯2000指纹为杂合基因型，双亲为互补的纯合基因型(主要用于鉴定母本自交苗、回交苗)；有1对引物京科糯2000、双亲均为相同的纯合基因型(主要用于鉴定异型株的情况)；上述4对引物结合使用，可相互进行基因型数据和鉴定结果的验证。

基于本发明的研究，本发明提供了一种用于鉴定京科糯2000玉米杂交种纯度的玉米SNP分子标记组合，其特征在于，含有4个SNP分子标记，所述4个SNP分子标记的信息如下表1：

表1

进一步地，本发明发现确定的上述4个SNP标记高质量、高稳定性、高多态、高杂合率，主要信息如下表2：

表2

所述4个SNP分子标记SNPCP_1、SNPCP_2、SNPCP_3、SNPCP_4分别通过4个特异性引物组依次扩增得到，所述特异性引物组含有2条上游引物，1条下游引物；所述4个特异性引物组含有的引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-3，SEQ ID NO.4-6，SEQ ID NO.7-9，SEQID NO.10-12所示。

进一步地，本发明提供了一种用于鉴定京科糯2000玉米杂交种纯度的特异性引物组合，其含有4个特异性引物组，所述4个特异性引物组中，每组含有2条上游引物，1条下游引物；4个特异性引物组含有引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-3，SEQ ID NO.4-6，SEQID NO.7-9，SEQ ID NO.10-12所示。

基于KASP技术体系对京科糯2000玉米杂交种纯度进行鉴定，在本发明的实施例中，采用2条上游引物F1、F2，并在上游引物5'端分别增加上通用接头序列。本发明一个实施例中，上游引物F1增加的通用接头序列为"5’GAAGGTGACCAAGTTCATGCT 3’，上游引物F2增加的通用接头序列为5’GAAGGTCGGAGTCAACGGATT 3’。

本发明还提供一种用于鉴定京科糯2000玉米自交苗、回交苗的特异性引物组合，其含有3个特异性引物组，所述3个特异性引物组中，每组含有2条上游引物，1条下游引物；3个特异性引物组含有引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-3，SEQ ID NO.4-6，SEQ IDNO.10-12所示。

本发明提供一种用于鉴定玉米京科糯2000种子异形株的特异性引物组合，含有2条上游引物，1条下游引物；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7-9所示。

本发明提供了上述玉米SNP分子标记、或特异性引物组合在鉴定京科糯2000玉米种子纯度或杂交种纯度中的应用。

本发明提供了上述玉米SNP分子标记、或特异性引物组合在鉴定京科糯2000玉米自交苗、回交苗和/或异型株中的应用。

本发明提供了上述玉米SNP分子标记、或特异性引物组合在京科糯2000玉米鉴定、或在玉米分子标记辅助育种中的应用。

基于本发明的研究，本发明还提供了一种基于SNP标记鉴定京科糯2000玉米杂交种子纯度的方法，采用含有上述4个特异性引物组的特异性引物组合，以待测玉米种子样品的DNA为模板，基于KASP技术进行PCR扩增，根据待测玉米种子样品在每对引物上的基因型数据，判定该单株是正常植株、自交苗、还是异型株，判断标准为：

根据判断结果结合双亲的基因型数据，确定自交苗种子数目和杂株种子数目，综合判定种子的纯度值。

适于京科糯2000种子纯度鉴定的4对SNP引物在KASP技术平台上的试验分型效果如图1-图4所示。

纯度计算公式：P(％)＝[(NT-NP-ND)/NT]×100％；其中，P为种子纯度；NT供检种子数目；NP自交苗数目；ND杂株数目(包含回交苗和异型株)。

4对引物分析京京科糯2000，如果所有单株在SNPCP_1、SNPCP_2、SNPCP_3、SNPCP_4引物的基因型均为AG、GT、CC、CT，则所有单株均为正常京科糯2000的单株。如果有的单株在SNPCP_1、SNPCP_2、SNPCP_4引物的基因型数据为纯合的母本京糯6基因型，即AA、TT、TT，则检测到的单株为自交苗。如果有的单株在SNPCP_1、SNPCP_2、SNPCP_4引物的基因型正常京科糯2000杂合基因型和母本京糯6纯合基因型均有出现过，则检测到的单株为回交苗。如果有的单株在SNPCP_3引物的基因型为杂合基因型或另为一个纯合基因型，则检测到的单株为异型株。

本发明基于384个SNP位点，采取高通量的KASP技术平台，利用500多份样品进行试验效果、生物学特征以及多态参数的综合评估，最终确定高质量、高稳定性、高多态、高杂合率的4个SNP标记，并设计扩增每个SNP标记的3条引物共12条引物。利用这12条引物，本发明提供了一种基于SNP标记的京科糯2000玉米杂交种纯度鉴定的快捷高效的方法。该方法可用于鉴定京科糯2000的种子纯度，能够鉴定出自交苗、回交苗、异型株，该方法的应用拓展了玉米杂交种纯度鉴定标记类型和方法，为京科糯2000的推广种植提供了强有力的技术保障。

附图说明

图1为用于京科糯2000种子纯度鉴定SNPCP_1位点的特异性引物组在KASP技术平台上的分型效果图。图中，左上角一簇的基因型为GG，中间一簇的基因型为AG，右下角一簇的基因型为AA。

图2为用于京科糯2000种子纯度鉴定的SNPCP_2位点的特异性引物组在KASP技术平台上的分型效果图。图中，左上角一簇的基因型为TT，中间一簇的基因型为TG，右下角一簇的基因型为GG。

图3为用于京科糯2000种子纯度鉴定的SNPCP_3位点的特异性引物组在KASP技术平台上的分型效果图。图中，左上角一簇的基因型为TT，中间一簇的基因型为TC，右下角一簇的基因型为CC。

图4为用于京科糯2000种子纯度鉴定的SNPCP_4位点的特异性引物组在KASP技术平台上的分型效果图。图中，左上角一簇的基因型为TT，中间一簇的基因型为TC，右下角一簇的基因型为CC。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件。本发明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

若未特别说明，本发明实施例所用生化试剂均为市售，所用玉米材料均为本领域公知公用的玉米。

实施例1用于鉴定京科糯2000玉米杂交种纯度的SNP分子标记及引物的确定

(1)基础位点：利用“玉米DNA指纹库及品种分子鉴定SNP核心位点组合-maizeSNP384”(公开于中国专利201410756086.0中)公布的384个SNP位点作为起始位点集合，并建立了335个玉米国审杂交种SNP-DNA指纹数据。

(2)SNP位点的试验和生物学特征评估：随机选取的不同名称的玉米杂交种192个，采取快速法提取、CTAB、试剂盒、多种方法提取DNA，基于KASP技术体系，利用不同方法提取的DNA验证位点的分型效果、重复性、稳定性，获得候选位点集合。

(3)SNP位点多态性评估：利用200份不同类型玉米自交系，335个玉米杂交种数据，分别评估引物的多态性参数PIC(多态信息指数)、MAF(低等位基因频率)以及DP(品种识别能力)；依据PIC和MAF值大于0.35，DP值大于0.5进一步筛选。

(4)SNP位点杂合率和综合区分效果评估：利用335份玉米杂交种的指纹数据，分析位点杂合率，杂合率值大于0.45进行筛选。

(5)4对SNP引物确定：经过上述多级评估筛选，基于京科糯2000及其双亲的指纹数据，确定了4对适于京科糯2000种子纯度鉴定的引物组合；3对引物的京科糯2000指纹为杂合基因型，双亲为互补的纯合基因型(主要用于鉴定母本自交苗、回交苗)；有1对引物京科糯2000、双亲均为相同的纯合基因型(主要用于鉴定异型株的情况)；上述4对引物结合使用，可相互进行基因型数据和鉴定结果的验证。

适于京科糯2000种子纯度鉴定的4个SNP位点信息如下表3。京科糯2000及其双亲在4个SNP位点上的基因型数据如表4所示。适于京科糯2000种子纯度鉴定的4对SNP引物在KASP技术平台上的试验分型效果如图1-图4所示。

表3适于京科糯2000种子纯度鉴定的四对引物信息

注：上游引物在5'端分别增加上通用接头序列。上游引物F1增加的通用接头序列为5’GAAGGTGACCAAGTTCATGCT 3’，上游引物F2增加的通用接头序列为5’GAAGGTCGGAGTCAACGGATT 3’。

表4京科糯2000及其双亲在4对SNP引物上的基因型数据

样品名称	SNPCP_1	SNPCP_2	SNPCP_3	SNPCP_4
					京科968	GG	GT	CT	CT
京724	GG	GG	CC	CC
					京92	GG	TT	TT	TT

实施例2利用本发明提供的SNP分子标记鉴定京科糯2000玉米杂交种纯度的方法

利用实施例1设计的针对4个SNP位点的引物组合，对京科糯2000进行种子纯度鉴定的方案如下：根据KASP技术要求合成引物，引物为普通引物不含荧光基团；购置KASP技术配套的PCR扩增体系MasterMix；配置反应体系加入DNA、引物和MasterMix；运行扩增反应程序；原位扫描荧光信号；进行数据分析获得基因型数据；根据京科糯2000每个单株在每对引物上的基因型数据，判定该单株是正常植株、自交苗、还是异型株，最后综合判定其纯度值。具体操作如下：

(1)待测样品的制备：

从待测样品中随机抽取至少150粒种子，要求最终获得不低于100株的样本。每个单株可采用种子、幼苗或叶片组织进行DNA提取。DNA提取具体步骤按照玉米DNA分子鉴定标准执行(王凤格等，2014，玉米品种鉴定技术规程SSR标记法，中华人民共和国农业行业标准)，稀释DNA形成工作液浓度为20ng/μL。

(2)PCR扩增：

PCR扩增体系可采用1μl、3μl、10μl体系，具体成分如下表3所示。PCR扩增程序：94℃15min；94℃20s，61-55℃60s，10个循环(每个循环降低0.6℃)；94℃20s，55℃60s，26个循环。

表5基于KASP技术体系，PCR扩增体系

微孔板类型	1536微孔板	384微孔板	96微孔板
				PCR体系	1μl	3μl	10μl
2×PCR预混液	0.5μl	1.5μl	5μl
				去离子水	0.486μl	/	3.36μl
引物工作液	0.014μl	0.042μl	0.14μl
				DNA工作液	1.5μl(烘干)	1.5μl	1.5μl

(3)荧光原位扫描和数据读取：

将扩增产物利用BMG Pherastar(LGC，Middlesex，UK)仪器进行荧光信号扫描，获得原始数据。原始数据导入Kraken软件(LGC，UK)进行分析获得每个数据点的指纹数据。查看并修订原始分型结果，将数据点分为AA，AB，BB分型。

(4)数据分析统计、结果判定：

根据实施例1确定的4组引物对京科糯2000各单株的检测结果，并结合双亲的基因型数据(见表4)，综合判定京科糯2000种子的纯度，原始记录中需要区分正常植株、自交苗、其他类型杂株。

纯度计算公式：P(％)＝[(NT-NP-ND)/NT]×100％；其中，P为种子纯度；NT供检种子数目；NP自交苗数目；ND杂株数目。

4对引物分析京京科糯2000，如果所有单株在SNPCP_1、SNPCP_2、SNPCP_3、SNPCP_4引物的基因型均为AG、GT、CC、CT，则所有单株均为正常京科糯2000的单株。如果有的单株在SNPCP_1、SNPCP_2、SNPCP_4引物的基因型数据为纯合的母本京糯6基因型，即AA、TT、TT，则检测到的单株为自交苗。如果有的单株在SNPCP_1、SNPCP_2、SNPCP_4引物的基因型正常京科糯2000杂合基因型和母本京糯6纯合基因型均有出现过，则检测到的单株为回交苗。如果有的单株在SNPCP_3引物的基因型为杂合基因型或另为一个纯合基因型，则检测到的单株为异型株。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种基于SNP标记鉴定京科糯2000玉米杂交种纯度的方法

<130> KHP191115826.4

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcatccaga aggtcaaact ctcct 25

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catccagaag gtcaaactct ccc 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caggagcagg gaaccaagtc gaa 23

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcatcctaa taacataatt actcacg 27

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgcatccta ataacataat tactcact 28

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcgaaacggg gtgttagata gagtt 25

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctcagatct catctatgct gcc 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cctcagatct catctatgct gct 23

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgtttccaca ttttctgaag gtttcacaa 29

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaagcaatcc ttccggagga ata 23

<210> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

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<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

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