阅读说明：本技术 一种与小麦抗白粉病基因Pm37连锁的分子标记及其应用 (Molecular marker linked with wheat powdery mildew resistance gene Pm37 and application thereof ) 是由 马朋涛 刘成 何华纲 杜文晓 贾梦淑 张旭 王文瑞 于 2019-12-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种与小麦抗白粉病基因<I>Pm37</I>连锁的分子标记及其应用；所述分子标记YTURGA的上游引物为YTURGA-F,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述分子标记YTURGA的下游引物为YTURGA-R,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；以所述分子标记YTURGA的标记引物对小麦基因组DNA进行PCR扩增,将扩增产物电泳分离,获得对应的扩增产物分子量为296bp,即为与小麦抗白粉病基因<I>Pm37</I>连锁的分子标记。本发明开发的与<I>Pm37</I>连锁的分子标记YTURGA,可高效检测作图群体,应用于<I>Pm37</I>的分子标记定位和图位克隆；可高效检测育种群体,提高转移抗病基因<I>Pm37</I>基因的效率,加快<I>Pm37</I>基因不同遗传背景抗白粉病小麦新品种的培育,提高小麦抗白粉病育种的效率。(The invention discloses a powdery mildew resistance gene of wheat Pm37 Linked molecular markers and uses thereof; the upstream primer of the molecular marker YTURGA is YTURGA-F, and the nucleotide sequence of the upstream primer is shown as SEQ ID NO. 1; the downstream primer of the molecular marker YTURGA is YTURGA-R, and the nucleotide sequence of the downstream primer is shown in SEQ ID NO. 2; carrying out PCR amplification on wheat genome DNA by using the marker primer of the molecular marker YTURGA, and carrying out electrophoretic separation on the amplification product to obtain a corresponding amplification product with the molecular weight of 296bp, namely the gene which is resistant to powdery mildew of wheat Pm37 Linked molecular markers. The invention was developed with Pm37 The linked molecular marker YTURGA can be used for efficiently detecting mapping population and is applied to Pm37 The molecular marker positioning and map location cloning; can efficiently detect breeding groups and improve transferred disease-resistant genes Pm37 Efficiency of gene, acceleration of Pm37 Cultivation of new wheat variety with gene different genetic backgrounds for resisting powdery mildew and improving wheat qualityThe efficiency of breeding against powdery mildew.)

一种与小麦抗白粉病基因Pm37连锁的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及小麦分子生物技术与育种应用领域，具体地说是一种与小麦抗白粉病基因Pm37连锁的分子标记及其应用。

背景技术

小麦白粉病是小麦病害中最严重的三大病害之一（Ma et al. Characterizationof a powdery mildew resistance gene in wheat breeding line 10V-2 and itsapplication in marker-assisted selection. Plant Disease. 2018, 102:925–931.），严重威胁小麦安全生产。在众多小麦白粉病防治措施中，利用品种抗性是最为经济、有效和环保的策略（Petersen et al. Mapping of powdery mildew resistance genePm53introgressed from Aegilopsspeltoides into soft red winter wheat.Theoretical and Applied Genetics. 2015, 128:303-312.）。

抗病基因是培育抗病品种的基础。迄今，已发现了70多个正式命名的小麦抗白粉病基因，分布在53个位点（McIntosh et al. Catalogue of gene symbols for wheat:2017 supplement. http://www.shigen.nig.ac.jp/wheat/komugi/genes/symbolClassList.jsp. 2017）。但是，很多抗病基因由于品种-菌群的互作逐渐丧失了对白粉病的抗性，一些有效抗病基因又因为缺少可利用的育种可用标记，大大影响了在育种上的应用效率（李洪杰等，中国小麦品种对白粉病的抗性反应与抗病基因检测. 作物学报.2011, 37:943-954；Li et al. Characterization of Pm65, a new powdery mildewresistance gene on chromosome 2AL of a facultative wheat cultivar.Theoretical and Applied Genetics. 2019, 132:2625–2632）。因此，加强广谱抗白粉病基因在生产上的高效利用可有效防控小麦白粉病。

小麦传统育种在过去几十年中，取得了瞩目成就。然而，传统育种往往具有一定的盲目性，无法保持稳定的增长。利用分子育种则可以在较少的回交代数中去除不利基因，加速育种进程（Chhetri et al. Development of robust molecular markers for marker-assisted selection of leaf rust resistance gene Lr23 in common and durumwheat breeding programs. Molecular Breeding. 2017, 37: 21）。在小麦抗病分子育种过程中，遗传标记的开发及遗传连锁图谱的构建起到了至关重要的作用。迄今已经发表了多张四倍体和六倍体小麦的遗传图谱，小麦参考基因组序列不断完善（The InternationalWheat Genome Sequencing Consortium. Shifting the limits in wheat research andbreeding using a fully annotated reference genome[J]. Science, 2018, 361(6403): eaar7191；Ling et al. Genome sequence of the progenitor of wheat AsubgenomeTriticumurartu[J]. Nature, 2018, 557:424-428；Zhao et al. TheAegilopstauschii genome reveals multiple impacts of transposons[J]. Natureplants, 2017, 3: 946-955），小麦优异基因分子标记的开发效率大大提高，这有效促进了小麦抗病分子育种的进程（Semagn et al. Single nucleotide polymorphismgenotyping using kompetitive allele specific PCR (KASP): overview of thetechnology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 2016,33:1–14.）。

小麦抗白粉病基因Pm37是一个源于提莫菲维小麦（Triticumtimopheevii，AAGG）的广谱抗白粉病基因，目前已被转育到普通小麦品系NC99BGTAG11背景下，被定位在小麦7AL染色体上（Perugini et al. Pm37, a new broadly effective powdery mildewresistance gene from Triticumtimopheevii. Theoretical and Applied Genetics.2008, 116:417–425）。经本实验室27个不同毒性白粉病菌株抗谱分析表明， Pm37基因对所有菌株均表现免疫，是一个具有广谱抗性的优秀抗白粉病基因，但是Pm37目前尚无育种可用标记报道，大大影响了Pm37在分子育种中的利用。因此，若能开发与Pm37连锁的分子标记，且可用于高效检测和追踪该抗白粉病基因，对实现Pm37的高效育种利用具有非常重要的价值和意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种与小麦抗白粉病基因Pm37连锁的分子标记及其应用，为高效检测小麦抗白粉病基因Pm37提供了便利工具，应用于基因克隆和抗白粉病分子标记辅助选择育种。

本发明是通过以下方法实现的：一种与小麦抗白粉病基因Pm37连锁的分子标记，该分子标记是显性标记YTURGA；

所述分子标记YTURGA的上游引物为YTURGA-F，其核苷酸序列如下所示：

YTURGA-F：5' - 3'：TGAGCTCCACTACTTCATCATCCAG；

所述分子标记YTURGA的下游引物为YTURGA-R，其核苷酸序列如下所示；

YTURGA-R：5' - 3'：AGTGTATTTCCTCCATCACTGACT；

以所述分子标记YTURGA的上游引物和下游引物对小麦基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳分离，获得扩增产物分子量为296bp，该段扩增产物即为与Pm37连锁的分子标记。

所述PCR扩增体系为10μL体系：30 ng/μL小麦基因组DNA 1.0 μL、10×PCR buffer1.0μL、10 mMdNTP 0.2μL、10 mM MgCl₂ 1.0μL、5U Taq聚合酶0.2μL、5μM上游引物0.4μL、5μM下游引物0.4μL和无菌去离子水5.8μL。

所述PCR扩增程序为：94℃预变性8分钟；94℃变性30秒，57℃退火40秒，延伸40秒，36个循环；72℃延伸10min；扩增完毕后，扩增产物4℃保存。

扩增产物电泳分离在质量百分比浓度为8%的变性聚丙烯酰胺凝胶上进行，扩增电压为280 V恒压，电泳时间为3h。

本发明提供的与小麦抗白粉病基因Pm37连锁的分子标记在小麦抗白粉病基因Pm37检测和图位克隆中的应用。

本发明提供的与小麦抗白粉病基因Pm37连锁的分子标记用于检测Pm37的方法包括以下步骤：

（1）从待测小麦样品的叶片提取基因组DNA；

（2）利用分子标记YTURGA的引物对所述基因组DNA进行PCR扩增；所述分子标记YTURGA的引物包括上游引物YTURGA-F和下游引物YTURGA-R；所述上游引物YTURGA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述下游引物YTURGA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

（3）PCR扩增产物检测：获得的扩增产物在质量百分比浓度为8%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，将所述扩增产物和6μL上样缓冲液混合后，取2.0μL混合物点样，280 V恒压下电泳3h，利用硝酸银染色后进行拍照,若能扩增出296bp的条带，说明待测种质中存在抗白粉病基因Pm37，否则，若扩增不出来296bp的特异条带，则说明待测小麦种质中不存在小麦抗白粉病基因Pm37。

该检测方法中所述PCR扩增的扩增体系为：30 ng/μL小麦基因组DNA 1.0 μL、10×PCR buffer 1.0μL、10 mMdNTP 0.2μL、10 mM MgCl₂ 1.0μL、5U Taq聚合酶0.2μL、5μM 上游引物0.4μL、5μM 下游引物0.4μL和无菌去离子水5.8μL，共10μL；所述PCR扩增的扩增程序为：94℃预变性8分钟；94℃变性30秒，57℃退火40秒，延伸40秒，36个循环；72℃延伸10分钟；4℃保存。

本发明中与小麦抗白粉病基因Pm37连锁的分子标记YTURGA在小麦分子标记辅助选择育种中的应用。

本发明通过普通小麦品系NC99BGTAG11携带单个显性基因Pm37，定位在小麦7AL染色体上，借助中国春参考基因组序列，在Pm37初定位区间内首次开发了分子标记YTURGA，通过研究发现分子标记YTURGA经过遗传分离群体检测，与基因Pm37的遗传距离为9.0cM，与Pm37连锁，可以高效检测Pm37的遗传作图大群体，应用于Pm37的精细定位和图位克隆，还可利用该标记进行Pm37的分子标记辅助选择育种，对小麦抗白粉病品种的选育具有非常重要的价值和意义。

附图说明

图1为分子标记YTURGA检测NC99BGTAG11、宁麦13及其F₂分离群体的带型图。

图中：M：DNA marker pUC19 Msp I；1：NC99BGTAG11（抗白粉病品种，携带Pm37）；2：宁麦13（感白粉病品种）；3-7：NC99BGTAG11与宁麦13的抗病F₂单株；8-12：NC99BGTAG11与宁麦13的感病F₂单株；箭头指示的是可以追踪Pm37的296bp的特异性条带。

图2为分子标记YTURGA检测部分感病主栽品种育种可用性的结果。

图中：M：DNA marker pUC19 Msp I；1：NC99BGTAG11（抗白粉病品种，携带Pm37）；2：宁麦13（感白粉病品种）；3：邯麦13；4：泰农1014；5：良星619；6：济麦20；7：石新633；8：濮麦28；9：烟187；10：中育1311；11：FC009；12：新漯4号；黑色箭头为能追踪Pm37的特异性条带。

具体实施方式

下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1 与小麦抗白粉病基因Pm37连锁的分子标记YTURGA的开发

1、材料

抗病亲本和感病亲本分别为NC99BGTAG11和宁麦13，其中NC99BGTAG11是携带Pm37的普通小麦种质资源（Perugini et al. 2008），由国外引种，对小麦白粉病表现高抗；宁麦13江苏省农业科学院粮食作物研究所选育的国审小麦品种，对小麦白粉病表现感病。NC99BGTAG11和宁麦13杂交，所得F1自交，获得F₂群体。

2、小麦基因组DNA的提取

利用采用酚/氯仿法小麦基因组DNA提取，技术流程如下：

(1) 剪取新鲜小麦叶片在研钵中加入液氮研磨2遍，至粉磨状态，冷却状态下取约0.2g粉末置于2mL离心管中待用。

(2) 配置DNA提取液：100 mMTris, 50mM EDTA, 500 mMNaCl, 1.8% SDS, pH =8.0，加入600 μL DNA提取液，65℃水浴40-60 min，期间每隔5 min上下混匀一次。

(3) 冷却至室温后，加入600 μL氯仿-异戊醇 (24:1, v/v)，置于摇床上轻摇10-15 min。

(4) 静止5 min，待分层后，放入冷冻离心机，4℃下以12000 rpm/min离心15 min，取上清于另一2 mL离心管中，加入3倍体积的预冷无水乙醇，置于-20 ºC冰箱中沉淀60min。

(5) 用枪头挑出絮状DNA沉淀，然后将沉淀用75%预冷乙醇洗涤2遍。

(6) 用枪头将DNA沉淀挑出，置于1.5 mL离心管中，室内自然风干。

(7) 待沉淀干燥后，加入60 μLTE缓冲液 (100 mMTris-Hcl，10 mM的EDTA，pH =8.0) 将DNA沉淀溶解成DNA储存液，-20ºC冰箱中储存备用。

(8) 用超纯水将DNA储存液稀释成20-30 ng/μL作为工作液备用。

3、小麦苗期抗白粉病鉴定及抗病遗传分析

小麦抗白粉病鉴定在温度和湿度可控的玻璃温室中完成。将抗感亲本、F₁杂交种、F₂群体种植于128穴的穴盘(2×2cm)中，每个穴播种4粒种子，抗感亲本各播种20粒种子，F₁播种20粒杂交种、F₂群体播种300粒种子，感病对照铭贤169随机分布（插红牌指示）。发苗期间条件控制为光照14h/黑暗10h，温度18-22℃，相对湿度30-40%。待长至一叶期，利用预先在感病材料上已经长满的白粉菌孢子接种白粉病菌株E09，接种后前24h条件控制为：全黑暗，温度18-22℃，相对湿度80-100%，24h之后条件控制为光照14h/黑暗10h，温度18-22℃，相对湿度80-100%。约10-14天后，当感病对照铭贤169第一片叶子布满孢子后开始调查抗感亲本及其F₂群体的反应型。小麦白粉病反应型按0-4级标准记载，其中0-2级为抗病等级，3-4级为感病等级。结果显示，在接种白粉病菌株E09后，出苗的17株抗病亲本均表现为0级抗病，出苗的15感病亲本均表现为4级感病，出苗的18粒F₁杂交种均表现0级抗病，说明NC99BGTAG11中的白粉病抗性受显性基因控制，这与预期Pm37的显隐性特征相符合，出苗的279株F₂群体单株抗感分离比为205:74，卡方检验符合单显性基因的分离比例3:1（χ²=0.09, P=0.56），这也与预期的NC99BGTAG11只携带单个显性抗白粉病基因Pm37相符合。此外，根据抗谱分析表明，NC99BGTAG11苗期对25个具有不同毒性小麦白粉病菌株均表现0级抗性，说明基因Pm37对不同小麦白粉病菌株具有广谱抗性。因此，基因Pm37对小麦抗白粉病遗传育种具有重要意义，将基因Pm37导入到主栽品种后，高效、准确的检测和追踪抗白粉病基因Pm37对实现其育种价值极为重要。

4、与基因Pm37连锁分子标记的开发

利用中国春参考基因组序列，查找相应的Pm37初定位区间，基于初定位区间序列，利用primer5.0软件设计了分子标记YTURGA，通过检测NC99BGTAG11×宁麦14的F₂群体的连锁分析发现，该标记与基因Pm37连锁，遗传距离为9.0cM。

其分子标记YTURGA的引物包括一条上游引物和一条下游引物：

上游引物序列：YTURGA-F：TGAGCTCCACTACTTCATCATCCAG；（5' - 3'）

下游引物序列：YTURGA-R：AGTGTATTTCCTCCATCACTGACT。（5' - 3'）

PCR扩增的反应体系为10μL：30 ng/μL小麦基因组DNA 1.0 μL、10×PCR buffer 1.0μL、10 mMdNTP 0.2μL、10 mM MgCl₂ 1.0μL、5U Taq聚合酶0.2μL、5μM 上游引物0.4μL、5μM下游引物0.4μL以及无菌去离子水5.8μL；所述扩增程序为：94℃预变性8分钟；94℃变性30秒，57℃退火40秒，延伸40秒，36个循环；72℃延伸10分钟；4℃保存；

PCR扩增按如下程序：94℃预变性8分钟；94℃变性30秒，57℃退火40秒，延伸40秒，36个循环；72℃延伸10min；4℃保存备用。

利用质量百分比浓度为8%变性聚丙烯酰胺凝胶（acrylamide/ bisacrylamide =25/1）检测PCR扩增产物，将上述PCR产物和6.0μL上样缓冲液混合，取2.0μL混合物点样，280V恒压下电泳3h，硝酸银染色后拍照，扩增产物分子量为296bp片段为与抗病表型连锁的特异片段，即为与小麦抗白粉病基因Pm37连锁的分子标记。

实施例2小麦抗白粉病基因Pm37的分子标记YTURGA的应用

利用分子标记YTURGA检测NC99BGTAG11、宁麦13以及NC99BGTAG11×宁麦13的F₂群体。

待测样品：NC99BGTAG11、宁麦13以及10个NC99BGTAG11×宁麦13的F₂群体单株。

利用小麦白粉病菌株E09鉴定上述待测样品，确定抗感表型后，提取新鲜叶片，提取DNA做为扩增模板，利用本发明开发的分子标记YTURGA的引物进行扩增：

上游引物序列：

YTURGA-F：（5' - 3'）TGAGCTCCACTACTTCATCATCCAG；

下游引物序列：

YTURGA-R：（5' - 3'）AGTGTATTTCCTCCATCACTGACT。

PCR扩增的反应体系为10μL：30 ng/μL小麦基因组DNA 1.0 μL、10×PCR buffer1.0μL、10 mMdNTP 0.2μL、10 mM MgCl₂ 1.0μL、5U Taq聚合酶0.2μL、5μM 上游引物0.4μL、5μM 下游引物0.4μL以及无菌去离子水5.8μL。

PCR扩增按如下程序：94℃预变性8分钟；94℃变性30秒，57℃退火40秒，延伸40秒，36个循环；72℃延伸10分钟；4℃保存备用。

PCR扩增产物检测程序为：在质量百分比浓度为8%变性聚丙烯酰胺凝胶（acrylamide/ bisacrylamide = 25/1）上进行电泳，将上述PCR产物和6.0μL上样缓冲液混合后，取2.0μL混合物点样，280 V恒压下电泳3h，硝酸银染色后拍照。

分子标记YTURGA检测结果见图1。图中1号材料显示抗病亲本NC99BGTAG11中可以扩增出与抗病表型连锁的296bp的特异条带，2号材料为感病亲本宁麦13，其在相应位置无法扩增出该目的条带。NC99BGTAG11×宁麦13的F₂群体中，3-7号5个材料可以扩增出与抗病表型连锁的296bp的特异条带，鉴定其为抗白粉病的单株；8-1号5个材料无法扩增出与抗病表型连锁的296bp的特异条带，鉴定这五个材料为感白粉病的单株。图中M为DNA markerpUC19 Msp I，黑色箭头为能追踪Pm37的特异性条带。

实施例3分子标记YTURGA在检测小麦抗白粉病基因Pm37中的应用

利用小麦抗白粉病基因Pm37的分子标记YTURGA检测现有品种中是否含有抗白粉病基因Pm37。

待测样品包括抗病亲本NC99BGTAG11、感病亲本宁麦13以及10个前期经本实验室鉴定为感白粉病菌株E09的小麦品种。待测样品的12个材料分别为：1、NC99BGTAG11；2、宁麦13；3：邯麦13；4：泰农1014；5：良星619；6：济麦20；7：石新633；8：濮麦28；9：烟187；10：中育1311；11：FC009；12：新漯4号。

提取上述材料新鲜叶片的DNA为模板，利用本发明开发的分子标记YTURGA的引物进行扩增：

上游引物序列：

YTURGA-F：（5' - 3'）TGAGCTCCACTACTTCATCATCCAG；

下游引物序列：

YTURGA-R：（5' - 3'）AGTGTATTTCCTCCATCACTGACT。

PCR反应体系为10μL：30 ng/μL小麦基因组DNA 1.0 μL；10×PCR buffer 1.0μL；10 mMdNTP 0.2μL；10 mM MgCl₂ 1.0μL；5U Taq聚合酶0.2μL；5μM 上游引物0.4μL；5μM 下游引物0.4μL；无菌去离子水5.8μL；

PCR扩增按如下程序：94℃预变性8分钟；94℃变性30秒，57℃退火40秒，延伸40秒，36个循环；72℃延伸10min；4℃保存备用。

PCR扩增产物检测程序为：在质量百分比8%变性聚丙烯酰胺凝胶（acrylamide/bisacrylamide = 25/1）上进行电泳，将上述PCR产物和6.0μL上样缓冲液混合后，取2.0μL混合物点样，280 V恒压下电泳3h，硝酸银染色后拍照。

分子标记YTURGA扩增产物电泳后的图谱如图2所示：NC99BGTAG11中可以扩增出与基因Pm37连锁的296bp的特异条带，其他材料与感病亲本宁麦13一样，均无法扩增出与基因Pm37连锁的296bp的特异条带。这与经本实验室前期抗白粉病鉴定宁麦13和其他10个小麦材料均对小麦白粉病菌株E09表现感病的结果是相一致的。

通过以上实验证明将基因Pm37导入到感病小麦主栽品种中，利用本发明开发的与小麦抗白粉病基因Pm37连锁的分子标记YTURGA，可准确地检测育种大群体，提高转移抗病基因Pm37的效率和精度，加快基因Pm37不同遗传背景抗白粉病小麦新品种的培育，缩短育种年限，有效提高小麦育种的效率。

基因Pm37是一个宝贵的广谱抗白粉病基因，到目前为止，尚未公开过与该基因连锁的分子标记的相关报道，因此，利用本发明开发的与基因Pm37连锁的分子标记YTURGA，可以高效地检测Pm37分子标记辅助选择育种具有重要实践意义。

上述实施例为本发明优化的实施方案，仅用于说明本发明而非限制本发明。本领域的技术人员在不脱离本发明实施方案的宗旨和原理的基础上所作的修改或等同替换，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 烟台大学

山东省农业科学院作物研究所

<120> 一种与小麦抗白粉病基因Pm37连锁的分子标记及其应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 分子标记YTURGA的上游引物YTURGA-F

<400> 1

tgagctccac tacttcatca tccag 25

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 分子标记YTURGA的下游引物YTURGA-R

<400> 2

agtgtatttc ctccatcact gact 24