阅读说明：本技术 非洲猪瘟病毒的锁核酸探针荧光定量pcr检测组合物、检测方法及检测试剂盒 (Locked nucleic acid probe fluorescent quantitative PCR detection composition, detection method and detection kit for African swine fever virus ) 是由 李艳 李春玲 郭怡德 勾红潮 蔡汝健 蒋智勇 宋帅 楚品品 卞志标 徐民生 于 2019-12-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种非洲猪瘟病毒的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物、检测方法及检测试剂盒,属于分子生物学领域。本发明的检测引物、探针和检测试剂盒,利用锁核酸的特点,设计含有锁核酸的特异性探针,该探针对DNA有强大的识别能力和强大的亲和力,从而能够很好的应用于非洲猪瘟病毒精准检测,提高了非洲猪瘟病毒的检测效率,漏检的概率降低,为非洲猪瘟病毒检测提供了一种新的检测方法和检测试剂。本发明的探针、引物和试剂盒,与现有的常规检测方法相比,具有特异性强、灵敏度高等优点,特别适用于科研及临床应用,具有很好的商业应用价值。(The invention discloses a locked nucleic acid probe fluorescent quantitative PCR detection composition, a detection method and a detection kit of African swine fever virus, belonging to the field of molecular biology. According to the detection primer, the probe and the detection kit, the characteristic of locked nucleic acid is utilized to design the specific probe containing the locked nucleic acid, and the probe has strong recognition capability and strong affinity to DNA, so that the detection primer, the probe and the detection kit can be well applied to the accurate detection of the African swine fever virus, the detection efficiency of the African swine fever virus is improved, the probability of missed detection is reduced, and a novel detection method and a novel detection reagent are provided for the detection of the African swine fever virus. Compared with the conventional detection method, the probe, the primer and the kit have the advantages of strong specificity, high sensitivity and the like, are particularly suitable for scientific research and clinical application, and have good commercial application value.)

非洲猪瘟病毒的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物、检测方 法及检测试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种非洲猪瘟病毒的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物、检测方法及检测试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASF virus，ASFV)引起的家猪和野猪的一种急性、烈性和高度接触性传染病，死亡率可达100％。非洲猪瘟给养猪业造成了灾难性打击，属于国际动物卫生组织A类疫病，我国农业农村部将其列为一类动物疫病。非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，为有囊膜的双股DNA病毒，也是唯一的DNA虫媒病毒。病毒基因组全长约为170～193kb，基因组编码150～200种蛋白。P72蛋白是ASFV的主要结构蛋白，由基因B646L编码，该基因高度保守，是病毒检测中最常用的靶基因。

目前非洲猪瘟仍然没有有效预防疫苗和特效治疗药物，因此急需建立一种非洲猪瘟快速精准的检测方法，有效做到早发现早根除。PCR技术已成为核酸检测中广泛使用的分子生物学方法，但其存在因非特异性扩增而产生假阳性结果的缺点。因此，基于PCR技术，应用改良的引物探针设计策略已成为核酸检测方法的新方向。

锁核酸(locked nucleic acid,LNA)探针，是在TaqMan探针基础上选择性地将探针中的一些碱基修饰成LNA碱基，大大提高探针与目标序列的亲和力，提高探针的Tm值，同时极大缩短探针长度，稳定性、特异性和灵敏度更高。

发明内容

本发明的首要目的在于弥补现有技术的缺点与不足，提供一种非洲猪瘟病毒的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物。

本发明的另一目的在于提供包含上述检测组合物的非洲猪瘟病毒的锁核酸探针荧光定量PCR检测试剂盒。

本发明的再一目的在于提供利用上述检测试剂盒检测非洲猪瘟病毒的锁核酸探针荧光定量PCR方法。

本发明的目的通过下列技术方案实现：一种非洲猪瘟病毒的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物，包括用于扩增非洲猪瘟病毒的1组特异性引物对和1条在引物对的扩增靶标区域内的LNA-Taqman探针。

所述的特异性引物对的序列如Seq ID No.1～2所示。

所述的LNA-Taqman探针的序列如Seq ID No.3所示。

所述的LNA-Taqman探针所示序列的探针中，第7位的碱基“G”、第11位的碱基“A”、第13位的碱基“G”和第17位的碱基“A”均为锁核酸。

所述的LNA-Taqman探针在5′端标记荧光物质，3′端标记淬灭物质。

所述的5′端标记荧光物质为标记FAM。

所述的3′端标记淬灭物质为标记BHQ1。

上述非洲猪瘟病毒的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物在制备非洲猪瘟检测试剂盒中的应用。

一种非洲猪瘟病毒的锁核酸探针荧光定量PCR检测试剂盒，包含上述锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物。

所述的检测试剂盒还包含阳性对照。

所述的阳性对照优选为包含所述的非洲猪瘟病毒的主要结构蛋白P72编码基因B646L的重组质粒。

上述非洲猪瘟病毒的锁核酸探针荧光定量PCR检测试剂盒在鉴定和/或检测非洲猪瘟病毒中的应用。

一种检测非洲猪瘟病毒的锁核酸探针荧光定量PCR方法，包括如下步骤：

(1)提取样品的基因组DNA；

(2)配制锁核酸探针荧光定量PCR反应体系；

(3)将步骤(2)中配制的锁核酸探针荧光定量PCR反应体系置于荧光定量PCR仪中，进行扩增反应；

(4)将基因组DNA的循环阈值Ct与标准曲线对照，得到基因组DNA中非洲猪瘟病毒基因片段拷贝浓度。

步骤(2)中所述的锁核酸探针荧光定量PCR反应体系包括包含锁核酸探针荧光定量PCR组合物，反应体系为：Premix Ex Tag(2×)10uL、浓度为10μmol/L的上游引物0.6uL(体系中浓度为0.3umol/L)、浓度为10μmol/L的下游引物0.6uL(体系中浓度为0.3umol/L)、浓度为10μmol/L的探针0.3uL(体系中浓度为0.15umol/L)、模板DNA 1uL、灭菌水加至20uL。

步骤(3)中所述的扩增反应的反应条件为：预变性95℃、10min；95℃、15s，59℃、30s，扩增45个循环。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明的非洲猪瘟病毒的检测组合物和检测试剂盒，利用锁核酸的特点，设计含有锁核酸的特异性探针，该探针对DNA有强大的识别能力和强大的亲和力，从而能够有效提高非洲猪瘟病毒检测的效率，降低漏检的概率，为非洲猪瘟病毒检测提供了一种新的检测方法和检测试剂。

(2)本发明的引物、探针和试剂盒，与现有的常规检测方法相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，特别适用于科研及临床应用，具有很好的商业应用价值。

附图说明

图1是实施例中不同Tm值得到的ASFV B646L基因LNATaqMan探针荧光定量PCR扩增曲线图。

图2是实施例中不同引物浓度得到的ASFV B646L基因LNATaqMan探针荧光定量PCR的扩增曲线图。

图3是实施例中不同探针浓度得到的ASFV B646L基因LNATaqMan探针荧光定量PCR的扩增曲线图。

图4是实施例中ASFV B646L基因LNA TaqMan探针荧光定量PCR的灵敏性检测结果图；其中，1为3.9×10⁹拷贝的阳性重组质粒；2为3.9×10⁸拷贝的阳性重组质粒；3为3.9×10⁷拷贝的阳性重组质粒；4为3.9×10⁶拷贝的阳性重组质粒；5为3.9×10⁵拷贝的阳性重组质粒；6为3.9×10⁴拷贝的阳性重组质粒；7为3.9×10³拷贝的阳性重组质粒；8为3.9×10²拷贝的阳性重组质粒；9为3.9×10¹拷贝的阳性重组质粒；10为3.9×10⁰拷贝的阳性重组质粒。

图5是实施例中ASFV B646L基因常规TaqMan探针荧光定量PCR的灵敏性检测结果图；其中，1为3.9×10⁹拷贝的阳性重组质粒；2为3.9×10⁸拷贝的阳性重组质粒；3为3.9×10⁷拷贝的阳性重组质粒；4为3.9×10⁶拷贝的阳性重组质粒；5为3.9×10⁵拷贝的阳性重组质粒；6为3.9×10⁴拷贝的阳性重组质粒；7为3.9×10³拷贝的阳性重组质粒；8为3.9×10²拷贝的阳性重组质粒；9为3.9×10¹拷贝的阳性重组质粒。

图6是实施例中ASFV B646L基因的特异性检测结果图；其中，1是以非洲猪瘟病毒B646L基因的阳性重组质粒3.9×10⁶拷贝为模板的检测结果；2是以猪瘟病毒核酸为模板的检测结果；3是以猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸为模板的检测结果；4是以猪圆环病毒2型核酸为模板的检测结果；5是阴性对照的检测结果。

图7是实施例中ASFV B646L基因的阳性重组质粒pMD19-T-ASFV-p72 3.9×10⁶拷贝的重复性检测结果图。

具体实施方式

下面将结合实施方式和附图对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

材料、方法与结果

1.病毒株

猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)病毒均采购自市场上的商品化疫苗，其中猪瘟病毒活疫苗、猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗购自广东永顺生物制药股份有限公司，猪圆环病毒2型灭活疫苗购自上海海利生物技术有限公司。

2.主要试剂与仪器

2×Premix Ex Tag(Probe qPCR)(购自TaKaRa，Cat No.RR390)。本申请中所用的试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682中一级水的规格。所有试剂均为无DNA酶污染的容器分装。荧光定量PCR仪(LightCycler96)，紫外分光光度计(BioTek)等仪器均由本实验室提供。

3.引物和探针的设计与筛选

根据GenBank中公布的非洲猪瘟病毒的基因组序列中保守稳定的B646L基因(p72蛋白基因，登录号：MH713612)序列设计两对特异性引物，五条特异性探针，用于后续试验筛选。引物和探针具体序列如表1所示。本申请所有的引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1荧光定量PCR引物和探针序列

表1中，ASFV-F1R1-probe1探针中，第7位、11位、13位和17位碱基为锁核酸修饰碱基；ASFV-F1R1-probe3探针中，第13位、14位和15位碱基为锁核酸修饰碱基；ASFV-F2R2-probe1探针中，第12位、13位和14位碱基为锁核酸修饰碱基；ASFV-F2R2-probe2探针中，第6位、9位、14位和17位碱基为锁核酸修饰碱基。所有探针在5＇端标记FAM，3＇端标记BHQ1。

经过大量比对筛选，Seq ID No.1所示序列的上游引物ASFV-F1、Seq ID No.2所示序列的下游引物ASFV-R1和Seq ID No.3所示序列的探针ASFV-F1R1-probe1组合对阳性质粒的检测范围为3.9×10⁰～3.9×10⁹copies/uL，其它三个组合(Seq ID No.1所示序列的上游引物ASFV-F1、Seq ID No.2所示序列的下游引物ASFV-R1和Seq ID No.5所示序列的探针ASFV-F1R1-probe3组合，Seq ID No.6所示序列的上游引物ASFV-F2、Seq ID No.7所示序列的下游引物ASFV-R2和Seq ID No.8所示序列的探针ASFV-F2R2-probe1组合，Seq ID No.6所示序列的上游引物ASFV-F2、Seq ID No.7所示序列的下游引物ASFV-R2和Seq ID No.9所示序列的探针ASFV-F2R2-probe2组合)对阳性质粒的检测范围为3.9×10¹～3.9×10⁹copies/uL。本例最终从表1的引物探针中筛选出Seq ID No.1所示序列的上游引物ASFV-F1、Seq ID No.2所示序列的下游引物ASFV-R1和Seq ID No.3所示序列的探针ASFV-F1R1-probe1，该引物和探针组合可用于对非洲猪瘟病毒进行高效检测。

4.试剂盒中阳性对照物的制备

将NCBI GenBank中公布的非洲猪瘟病毒主要结构蛋白基因B646L基因(p72蛋白基因，登录号：MH713612)部分序列(引物ASFV-F1:5＇-CTTTGGTGCGGCTTGTGCAA-3＇、引物ASFV-R1:5＇-TGACTGGATATAAGCACTTGGTTGGC-3＇)送生工生物工程(上海)股份有限公司合成基因片段，克隆到pMD19-T载体中，命名为pMD19-T-ASFV-p72。将阳性对照质粒pMD19-T-ASFV-p72送样测序，测序结果与GenBank序列比对无误后，采用全自动紫外分光光度计测定质粒的浓度和纯度。

5.病毒核酸提取

按照病毒核酸提取试剂盒(Magen(美基)生物，R4410-03)操作说明，提取CSFV、PRRSV和PCV2的病毒基因组，作为模板。

6.PCR反应条件优化

采用20uL反应体系，退火温度设置为58℃、58.5℃、59℃、59.5℃、60℃、60.5℃、61℃、61.5℃8个温度梯度进行扩增，得到扩增曲线，优化退火温度。

上下游引物的浓度按照0.3umol/L、0.4umol/L、0.5umol/L、0.6umol/L、0.7umol/L5个浓度的反应体系进行扩增，得到扩增曲线，优化上下游引物浓度。

探针浓度按照0.05umol/L、0.1umol/L、0.15umol/L、0.2umol/L、0.25umol/L 5个浓度梯度的反应体系进行扩增，得到扩增曲线，优化探针浓度。

反应条件为：预变性95℃、10min；以95℃、15s，60℃、30s，扩增45个循环。扩增结束后，验证反应体系及其引物的特异性。

表2 Real-time PCR反应体系

通过对不同退火温度(Tm)扩增曲线的Ct值进行比较，结果如图1所示，59℃时的Ct值为17.26，是8个退火温度中的最小值。因此，退火温度为59℃时，pMD19-T-ASFV-p72阳性对照质粒的扩增效率最高。

通过对200、300、400、500、600nmol/L 5个不同浓度的上下游引物的反应体系进行扩增，得到扩增曲线，优化上下游引物浓度。结果如图2所示，上下游引物浓度为0.3umol/L时，pMD19-T-ASFV-p72阳性对照质粒的扩增效率最高，Ct值最低，所以上下游引物的最佳浓度为0.3umol/L。依据最低的Ct值，探针的最佳浓度为0.15umol/L，如图3所示。

7.标准曲线的建立和灵敏性试验

将步骤4中测定浓度和纯度后的阳性重组质粒pMD19-T-ASFV-p72分别做10倍的倍比稀释，得到3.9×10⁰～3.9×10⁹copies/uL共10个稀释度的重组质粒作为标准品模板，每个模板浓度作3个平行样。根据步骤6建立的LNA TaqMan探针荧光定量PCR的反应体系和反应参数进行LNATaqMan探针荧光定量PCR(SEQ ID No.1所示上游引物、SEQ ID No.2所示下游引物及SEQ ID No.3所示探针)及常规TaqMan探针荧光定量PCR(SEQ ID No.1所示上游引物、SEQ ID No.2所示下游引物及SEQ ID No.4所示探针)扩增，获得荧光扩增曲线并绘制标准曲线。通过观察扩增曲线来确定检测到重组质粒的最低拷贝数，并最终以Ct值为纵坐标，拷贝数的对数为横坐标，建立标准曲线，对整个PCR体系的灵敏性进行评价。

结果显示，pMD19-T-ASFV-p72阳性对照质粒10倍稀释为3.9×10⁰～3.9×10⁹copies/uL共10个稀释度，进行LNA TaqMan探针荧光定量PCR扩增，获得了扩增曲线，如图4，标准曲线的浓度在3.9×10⁰～3.9×10⁹copies/uL范围内具有很好的相关性，线性方程式y＝-2.9481x+40.651，R²＝0.9913，绘制标准曲线；进行常规TaqMan探针荧光定量PCR扩增，获得了扩增曲线，如图5，标准曲线的浓度在3.9×10¹～3.9×10⁹copies/uL范围内具有很好的相关性，线性方程式y＝-3.0843x+42.572，R²＝0.9957，绘制标准曲线。

以不同拷贝数的重组质粒为模板进行的检测结果显示，该基因的扩增曲线呈现较为典型的S型，各曲线间距均匀。基于B646L基因(p72蛋白基因)LNA TaqMan探针荧光定量PCR方法的最低检测量是3.9个拷贝，而基于B646L基因(p72蛋白基因)常规TaqMan探针荧光定量PCR方法的最低检测量是39个拷贝，LNA TaqMan探针荧光定量PCR方法的灵敏性比常规TaqMan探针荧光定量PCR方法高10倍。

8.特异性检测

采用步骤6建立的LNA TaqMan探针荧光定量PCR反应体系和反应参数，以3.9×10⁶拷贝的阳性质粒pMD19-T-ASFV-p72作为标准的阳性对照。CSFV、PRRSV、PCV2基因组模板作为其它毒株模板，无菌水作为阴性对照；使用罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪进行锁核酸探针荧光定量PCR扩增，以验证所建立方法的特异性。

结果如图6所示，只有pMD19-T-ASFV-p72阳性重组质粒可产生特异性荧光曲线，其余均为阴性，证明该方法特异性较好。

9.重复性检测

采用3.9×10⁶拷贝的阳性质粒pMD19-T-ASFV-p72为模板，按步骤6进行锁核酸探针荧光定量PCR试验，重复检测三次分析其稳定性。结果如图7所示，曲线1至曲线3检测结果基本一致，在相同位置均可观察到相对应得荧光曲线，说明锁核酸探针荧光定量PCR方法重复性良好。

10.临床样品的检测

采用筛选出的引物对ASFV-F1、ASFV-R1和探针ASFV-F1R1-probe1对送检样品进行检测，同时用OIE推荐的实时荧光PCR方法(AFRICAN SWINE F EVER，OIE TerrestrialManual 2012)进行检测。

临床样品的检测结果显示，采用筛选的引物对ASFV-F1、ASFV-R1和探针ASFV-F1R1-probe1对送检样品进行检测，100份样品均无扩增曲线出现，检测结果为阴性，与OIE推荐的实时荧光PCR法检测结果相同。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>广东省农业科学院动物卫生研究所

<120>非洲猪瘟病毒的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物、检测方法及检测试剂盒

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV-F1

<400> 1

ctttggtgcg gcttgtgcaa 20

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV-R1

<400> 2

tgactggata taagcacttg gttggc 26

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV-F1R1-probe1

<400> 3

tgcataggag agggccact 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV-F1R1-probe2

<400> 4

tgcataggag agggccact 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV-F1R1-probe3

<400> 5

aggagagggc cactggttcc 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV-F2

<400> 6

aatgtgatcg gatacgtaac gggg 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV-R2

<400> 7

gattggcaca agttcggaca tgtt 24

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV-F2R2-probe1

<400> 8

ctgcgtggtg agtgggctg 19

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ASFV-F2R2-probe2

<400> 9

tgcgtctgga agagctgtat c 21