D609在制备预防和治疗视网膜损伤性疾病药物中的应用
阅读说明：本技术 D609在制备预防和治疗视网膜损伤性疾病药物中的应用 (Application of D609 in preparing medicine for preventing and treating retina injury diseases ) 是由 欧阳宏 王力 于 2019-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了D609在制备预防和治疗视网膜损伤性疾病药物中的应用。D609其中文名为三环葵烷-9-基-二硫代碳酸酯钾盐,是一种抗病毒及抗肿瘤的小分子化合物,属于一种磷脂酰胆碱特异性磷脂酶(PC-PLC)的选择性抑制剂。本发明经过广泛而深入的研究,首次出乎意料地发现,D609通过上调金属硫蛋白表达,能有效抑制RPE细胞氧化损伤,从而可用于预防或治疗氧化应激损伤视网膜色素上皮细胞引起的视网膜损伤性疾病,尤其是可极其有效地用于预防或治疗视网膜黄斑变性疾病,且无明显药物毒性,能够有效控制视网膜损伤性疾病的发生、发展,为开发D609未知的生物活性及将来的临床治疗作用提供新的理论支持。(The invention discloses an application of D609 in preparing a medicament for preventing and treating retina injury diseases. D609 is named as tricyclodecane-9-yl-dithiocarbonate potassium salt in Chinese, is a small molecular compound with antiviral and antitumor effects, and belongs to a selective inhibitor of phosphatidylcholine-specific phospholipase (PC-PLC). Through extensive and intensive research, the invention discovers for the first time unexpectedly that D609 can effectively inhibit RPE cell oxidative damage by up-regulating metallothionein expression, so that the D609 can be used for preventing or treating retinal damage diseases caused by oxidative stress damage of retinal pigment epithelial cells, particularly can be used for preventing or treating retinal macular degeneration diseases extremely effectively, has no obvious drug toxicity, can effectively control the occurrence and development of the retinal damage diseases, and provides new theoretical support for developing unknown bioactivity of D609 and future clinical treatment effect.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及三环葵烷-9-基-二硫代碳酸酯钾盐(D609)在制备预防和治疗视网膜损伤性疾病药物中的应用，为眼科相关疾病的预防和临床治疗开拓新的方法和思路。
背景技术
视网膜色素上皮细胞(RPE)是一层紧贴于视网膜下的色素细胞，是位于视神经网膜和Brunch’s膜之间的整齐排列的单层六边形细胞。保持RPE正常的生理功能对感光信号的正常接收和传导具有重要作用，主要表现在：1)调控营养物质由脉络膜毛细血管向感光细胞的输送；2)吸收光线，提高视觉系统的质量及减轻光氧化的刺激；3)分泌大量调控因子及信号分子来与内皮细胞或免疫细胞互动；4)维持视神经网膜层间的液态环境等。维持视网膜色素上皮细胞的稳定对视觉系统具有重要意义。任何RPE病理上的改变导致其功能紊乱或者丧失都会引起感光细胞的继发损伤。另外研究表明，RPE易受到氧化损伤，而这种损伤与老年性黄斑变性的发病与进展起重要作用。
老年性黄斑变性又称年龄相关性黄斑变性(age-related maculardegeneration，AMD)，是一种会出现视力模糊或者中央视野视力障碍的症状。在病患眼底的中心区域，黄斑区视网膜组织发生退行性、不可逆的病变，视网膜色素上皮区域性萎缩。虽然此病并没有造成视力的完全损失，但是黄斑是位于视网膜后极部中央直径约1.5毫米的特殊结构，主要负责精细视觉、色觉等，作为视觉最敏锐的部分，黄斑一旦受损，将严重影响中心视力，而中央视力的丧失，可能会对患者在脸部识别、驾驶、阅读等日常活动产生障碍。AMD发病主要与年龄相关多发于45岁以上人群，但准确发病机制在全球范围内还不清晰。AMD分为湿性AMD(存在脉络膜新生血管、视网膜色素上皮脱离和盘状纤维化等)和干性AMD(存在软性玻璃膜疣、地图状萎缩等)，湿性AMD(wAMD)相较干性AMD对视力有更严重的损害，包括导致更快的视力下降，以及更高的致盲率。干性AMD占AMD总病例数的85％～90％左右，且干性AMD可能转化为湿性AMD。
在发达国家中，AMD己经成为老龄人口视力丧失的主要原因，大型的流行病学调查显示，西方国家43岁以上人群中AMD的患病率为1.7％～15.6％。据报道，全球AMD患病人群达1.7亿，我国AMD患病人数随老龄化加剧持续增长，在部分地区，50岁以上人群中AMD的患病率可以达到15.5％以上。根据江宁眼科发布的《中国城市老年人群中年龄相关性黄斑变性的患病率》，近年国内50岁以上AMD患者总数为5082万，而且患病率和致盲率随年龄增加而增加。随着社会经济水平和医疗事业的发展，白内障和角膜病等可逆性致盲性眼病己经得到了有效地控制，但是AMD作为一种不可逆的眼病，其发病率逐年上升，己经成为了一项不可忽视的公共卫生问题。目前治疗视网膜疾病的眼科用药主要为VEGF抑制剂，AMD传统治疗方法(激光疗法、光动力疗法)效果有限，难以满足治疗需求，已逐步淘汰，而国外AMD市场以诺华(罗氏)与再生元(拜耳)为龙头，正加紧研发新的AMD疗法，提高疗效及顺应性是AMD新药未来发展的趋势。
三环葵烷-9-基-二硫代碳酸酯钾盐(Tricyclodecan-9-yl-xanthogenate，D609)是一种抗病毒及抗肿瘤的小分子化合物，属于一种磷脂酰胆碱特异性磷脂酶(PC-PLC)的选择性抑制剂。申请号为CN 200410023498.X的中国专利文献公开了可利用D609诱导血管内皮细胞向神经元分化，D609有治疗神经性退行疾病的作用。文献《Induction of nitricoxide synthase activity in phagocytic cells inhibited by tricyclodecan-9-yl-xanthogenate》报到了D609具有抗淀粉样β肽诱导的氧化应激作用。但关于D609对氧化应激状态下的视网膜色素上皮细胞的影响国内外尚未有相关报道D609是否有可能通过减少视网膜色素上皮细胞的氧化应激损伤来延缓AMD的发生和发展，还有待于研究。
发明内容
本发明的目的是提供D609在制备预防和治疗视网膜损伤性疾病药物中的新用途，为眼科相关疾病的预防和临床治疗开拓新的方法和思路。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明涉及了D609或其药学上可接受的盐、或立体异构体单用或与抗视网膜损伤保护药物联合在制备预防和治疗视网膜损伤性疾病药物中的应用。
本发明人经过广泛而深入的研究，首次出乎意料地发现，D609通过上调Metallothionein(金属硫蛋白)表达，能有效抑制RPE细胞的氧化损伤，对于氧化应激状态下的视网膜色素上皮细胞具有保护作用，对视网膜色素上皮细胞的氧化损伤具有良好的抑制效果，从而可用于预防或治疗氧化应激损伤视网膜色素上皮细胞引起的视网膜损伤性疾病，尤其是可极其有效地用于预防或治疗视网膜黄斑变性疾病，且无明显药物毒性，能够有效控制视网膜损伤性疾病的发生、发展，为开发D609未知的生物活性及将来的临床治疗作用提供新的理论支持。
在另一优选例中，所述视网膜损伤性疾病为视网膜色素上皮细胞损伤引起的视网膜损伤性疾病。
在另一优选例中，所述视网膜损伤性疾病为氧化应激损伤视网膜色素上皮细胞引起的视网膜损伤性疾病。
在另一优选例中，所述视网膜色素上皮细胞为ARPE-19。
在另一优选例中，所述视网膜损伤性疾病包括年龄相关性黄斑变性疾病、视网膜色素变性疾病或脉络膜视网膜病变疾病中的一种或几种。
在另一优选例中，所述年龄相关性黄斑变性疾病包括湿性年龄相关性黄斑变性疾病和/或干性年龄相关性黄斑变性疾病。
在另一优选例中，所应用的对象是人或动物。本发明中“动物”意指从动物的与年龄相关的视觉系统的损失或其他的衰退的改善或减少获益的任何动物，包括人、鸟类动物(avian)、牛类动物(bovine)、犬科动物(canine)、马类动物(equine)、猫科动物(feline)、山羊类动物(hicrine)、狼类动物(lupine)、鼠科动物(murine)、绵羊类动物(ovine)和猪类动物(porcine)，且优选家养的动物。其中家养的动物，包括诸如狗、猫、鸟、兔、豚鼠、雪貂、仓鼠、小鼠、沙鼠、消遣用马、奶牛、山羊、绵羊、驴、猪，以及由人类喂养的更多的外来物种。
在另一优选例中，所述抗视网膜损伤保护药物为甾族化合物、光敏剂、整联蛋白、抗氧化剂、干扰素、黄嘌呤衍生物、生长激素、神经营养因子、新血管形成调节剂、抗-VEGF抗体、***素、抗生素、植物性***、抗炎性化合物或抗血管生成化合物。
在另一优选例中，沙利度胺、维替泊芬、血管稳定类固醇、rhuFab、干扰素-2α或己酮可可碱，或其药学上可接受的盐或立体异构体。
在另一优选例中，当应用对象为动物(例如小鼠)时，D609的有效剂量为10～100mg/kg，较佳地20～80mg/kg，更佳地25～50mg/kg。
当应用对象为人时，可按照药学领域的相关给药标准，相应折算成人体的给药量。如在另一优选例中，当应用对象为人时，D609的有效剂量约为1000～2500mg，在单次剂量较大的情况下，可分多次多日给药。
在另一优选例中，当应用对象为人或动物时，D609的有效浓度为1～50μg/mL，较佳地5～30μg/mL，更佳地10～20μg/mL。
在另一优选例中，所述药物的制剂形式包括片剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、微囊、微球、注射液、脂质体或气雾剂。
在另一优选例中，所述药物为缓控释制剂或不为缓控释制剂。
本发明还涉及了一种预防和/或治疗视网膜损伤性疾病的药物组合物，其特征在于，包括D609以及药学上可接受的载体。
在另一优选例中，在本发明的药物组合物中，D609作为唯一活性成分占制剂总重量的0.0001～50wt％(较佳地0.001～20wt％，更佳地0.01～10wt％)，其余为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。
在另一优选例中，在本发明的药物组合物中，D609作为其中一种活性成分与其他活性成分共同组成所述药物组合物。其中，D609作为活性成分之一占制剂总重量的0.0001～50wt％(较佳地0.001～20wt％，更佳地0.01～10wt％)。其他活性成分可以是甾族化合物、光敏剂、整联蛋白、抗氧化剂、干扰素、黄嘌呤衍生物、生长激素、神经营养因子、新血管形成调节剂、抗-VEGF抗体、***素、抗生素、植物性***、抗炎性化合物或抗血管生成化合物。具体可以是染料木黄酮、咖啡酸、沙利度胺、维替泊芬、血管稳定类固醇、rhuFab、干扰素-2α或己酮可可碱，或其药学上可接受的盐或立体异构体。
在另一优选例中，D609所作用部位可直接应用于视网膜或其周围组织。当用于预防或治疗视网膜细胞损伤相关疾病时，优选的是进行眼内给药(如玻璃体内给药)。因此，所述的药物组合物可以是一种眼内给药的剂型，如眼内注射剂。适用于眼内注射的任何药学载体均是可用的。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次出乎意料地发现，D609能有效抑制碘酸盐对RPE细胞造成的氧化损伤，显著提高PRE细胞的存活率，同时能够显著降低氧化应激状态下的乳酸脱氢酶释放水平，在给D609后，对RPE细胞损伤的保护作用更强，能使氧化应激状态下的乳酸脱氢酶恢复到正常水平，从而有效降低RPE细胞的损伤程度，而对正常的ARPE-19细胞没有表现出明显的毒性作用，说明D609能有效治疗视网膜色素上皮层的损伤。另外，动物体内的实验表明，在对黄斑变性模型小鼠的尾静脉同时注射D609的实验组与对照组相比，D609能有效预防视网膜色素上皮层的损伤，药效较高，且无明显药物毒性，D609未来可能成为临床上治疗AMD的一种强有效的药物。
附图说明
图1为D609的筛选过程。
图2为给药D609(10μg/mL)12h、24h后各实验组ARPE-19细胞数量及形态变化。
图3为给药D609(10μg/mL)18h、24h后CCK8检测的各实验组ARPE-19细胞存活率(％)图。
图4为给药D609(10μg/mL)24h后各实验组乳酸脱氢酶释放水平图。
图5为各实验组ARPE-19细胞DAPI及HMBG1免疫荧光染色图。
图6为D609(10μg/mL)对SI氧化应激损伤的ARPE-19细胞的金属硫(Metallothionein，MT)蛋白表达水平。
图7为各实验组小鼠眼球视网膜色素上皮层组织进行F-actin与ZO-1的免疫荧光染色图。
图8为不同浓度的D609(25mg/kg、50mg/kg)对各实验组小鼠的影响；其中从图8的A图中可以看到D609最佳浓度为25mg/kg，到50mg/kg时细胞的形态已经没有25mg/kg好看了；而图8的B图中则是给定浓度的SI与不同浓度的D609搭配，可以看到25mg/kg的效果最好；图8的图C中显示，SI与D609均对心肝肾等器官无显著影响。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
D609(三环葵烷-9-基-二硫代碳酸酯钾盐)
D609是一种选择性的磷脂酰胆碱特异性的磷脂酶C(phosphatidyl choline-specific phospholipase C)抑制剂。D609具有如下的化学结构式：
D609的异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体也被包括在本发明中，只要它们具有与D609相同或接近的防止细胞损伤的功能。所述的“药学上可接受的盐”是指D609或其类似物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。所述的“前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在哺乳动物体内进行代谢或化学反应而转变成结构式(I)的一种化合物或其类似物。
所述的D609或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体可通过化学合成的方式获得。
防止视网膜损伤的用途
本发明提供了D609的用途，用于制备预防或治疗哺乳动物视网膜损伤相关疾病的制剂。
为了论证D609的上述用途，本发明人应用D609，通过其在碘酸钠损伤的视网膜色素上皮细胞模型干预性研究，观察到D609能使视网膜色素上皮细胞免受有毒物质侵害和氧化损伤的保护作用；在细胞实验中证明了D609保护细胞免受碘酸钠造成的细胞线粒体损伤及细胞凋亡和坏死的发生；并揭示了D609通过上调抗氧化蛋白家族-金属硫蛋白的表达拮抗氧化应激导致的细胞死亡发生。
抗视网膜损伤保护药物的例子包括但不限于用于治疗或预防黄斑变性的常用治疗试剂，例如甾族化合物、光敏剂、整联蛋白、抗氧化剂、干扰素、黄嘌呤衍生物、生长激素、神经营养因子、新血管形成调节剂、抗-VEGF抗体、***素、抗生素、植物性***、抗炎性化合物或抗血管生成化合物。抗视网膜损伤保护药物的具体实例包括但不限于沙利度胺、维替泊芬、血管稳定类固醇、rhuFab、干扰素-2α或己酮可可碱，或其药学上可接受的盐或立体异构体。
除非另有指明，本文使用的术语“治疗视网膜损伤性疾病”是指在视网膜损伤性疾病症状发作后施用本发明的化合物或其它活性试剂，而“预防”是指在症状发作前给药，特别是对有视网膜损伤性疾病危险的患者给药。除非另有指明，本文使用的术语“控制视网膜损伤性疾病”包括预防已经患有视网膜损伤性疾病的患者中视网膜损伤性疾病的复发，和/或延长已经患视网膜损伤性疾病的患者保持在缓解状态的时间。
本发明包括治疗、预防和控制患有各阶段和各特定类型的疾病的患者的视网膜损伤性疾病以及相关综合症的方法，所说的疾病包括但不限于湿性年龄相关性黄斑变性疾病、干性年龄相关性黄斑变性疾病、年龄相关性黄斑病(ARM)、脉络膜新生血管(CNVM)、视网膜色素上皮细胞脱离(PED)和视网膜色素上皮细胞(RPE)萎缩。
防治年龄相关性黄斑变性疾病的用途
作为本发明的特别优选的方式，所述的D609可特别有效地防止视网膜色素上皮细胞(RPE)的损伤，从而可用于年龄相关性黄斑变性疾病(AMD)的预防和治疗。
视网膜色素上皮细胞在人眼成像中扮演重要角色，它的功能包括：1)在视网膜和毛细血管中运输营养和代谢废物；2)调节视网膜周围电解液成分及体积；3)吞噬脱落的组织碎片；4)参与维生素A及其类似物的代谢循环。尽管AMD的发病机理包括不同的临床症状，在发病的早期阶段都经常观察到RPE细胞的衰退。最初的AMD发病机理包括异常的RPE形态和色素沉着及RPE细胞内的脂褐质积累。
AMD主要表现为视网膜色素上皮细胞对视细胞外节盘膜吞噬消化能力下降，结果使未被完全消化的盘膜残余小体潴留于基底部细胞原浆中，并向细胞外排出，沉积于Bruch膜，形成玻璃膜疣。由于黄斑部结构与功能上的特殊性，此种改变更为明显。玻璃膜疣也见于正常视力的老年人，但由此继发的种种病理改变后，则导致黄斑部变性发生。
氧化损伤与老年性视黄斑疾病(AMD)有密切关系，如太阳射线照射、空气污染、吸烟和抗氧化营养素的低量摄取等。碘酸钠可导致视网膜色素上皮细胞的氧化损伤。
本领域至今尚无有效治疗和根本性的预防措施。近年来多数学者主张对渗出性者应及早施行激光光凝新生血管，避免病情恶化。氩激光能有效的封闭视网膜下新生血管，所以目前应用较多。但对神经上皮层有一定损害，而且激光光凝仅是为了封闭已经存在的新生血管，并不能阻新的新生血管形成，是一种对症治疗。同时激光稍一过量，本身可以使脉络膜产生新生血管。
本发明首次意外地发现，D609可特别有效地防止视网膜色素上皮细胞的损伤，从而可用于预防和治疗老年性视网膜黄斑变性。
组合物
本发明提供了一种药物组合物，含有：(a)有效量的D609或其药学上可接受的盐或立体异构体；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由……组成”和“由……组成”包含在术语“含有”中。
本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)即有合理的效益/风险比的物质。“药学上可接受的载体”是用于将本发明的609或其生理上可接受的盐传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。
本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自：片剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、微囊、微球、注射液、脂质体或气雾剂。其中609可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中。
当用于预防或治疗视网膜细胞损伤相关疾病时，优选的是进行眼内给药(如玻璃体内给药)。因此，所述的药物组合物可以是一种眼内给药的剂型，如眼内注射剂。适用于眼内注射的任何药学载体均是可用的。
本发明的D609及其组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。通常，在本发明的药物组合物中，D609作为活性成分占制剂总重量的0.0001～50wt％(较佳地0.001～20wt％，更佳地0.01～10wt％)，其余为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。
实施例1
(1)方法
1.实验材料及步骤
1.1细胞培养基配制：DMEM/F12+10％胎牛血清+1％P/S双抗。
1.2多种抗氧化剂配制：将不同抗氧化剂分别进行稀释，使用浓度为10μg/mL。
1.3碘酸钠配制：将碘酸钠(Sodium Iodate，SI)使用培养基进行直接稀释，终浓度为10mM。
1.4处理细胞：
将于ATCC购买的视网膜色素上皮细胞细胞系ARPE-19细胞培养于DMEM/F12+10％胎牛血清+1％双抗的培养基中，分为阴性对照组、模型对照组(碘酸钠)、实验组：碘酸钠+各种抗氧化剂分别共处理。置于37℃，5％CO2温箱中培养。观察细胞变化，并进行相应分子生物学检测。
(2)结果
结果如下表1和图1所示。
表1 不同抗氧剂与碘酸钠共处理后RPE的存活率
由表1可知，不同抗氧化剂的作用机理不同，对视网膜上皮色素细胞的作用不同，不一定是抗氧化剂就能抑制RPE的氧化损伤，许多抗氧化剂对RPE氧化损伤的抵抗效果并不好。
图1阐述了D609的筛选过程。经过814种小分子与碘酸钠(SI)的共同孵育，绘制出图1中C图的结果，其中横坐标为重复性，纵坐标为存活率，由图1中C图的结果可以看到D609为最佳选择。
实施例2
(1)方法
1.实验材料及步骤
1.1细胞培养基配制：DMEM/F12+10％胎牛血清+1％P/S双抗
1.2 D609配制：将D609粉末使用超纯水进行稀释，终浓度为5mg/mL，最终使用浓度为10μg/mL。
1.3碘酸钠配制：将碘酸钠(Sodium Iodate，SI)使用培养基进行直接稀释，终浓度为10mM。
1.4处理细胞：
将于ATCC购买的视网膜色素上皮细胞细胞系ARPE-19细胞培养于DMEM/F12+10％胎牛血清+1％双抗的培养基中，分为阴性对照组、模型对照组(碘酸钠)、实验组1：碘酸钠+D609、实验组2：D609。置于37℃，5％CO2温箱中培养。其中实验组1将D609添加于含有10mM碘酸钠的培养基中稀释至10μg/mL，观察细胞变化，并进行相应分子生物学检测。
2.明场拍照
2.1拍照时间点选择：将细胞按照上述方法处理后，使用显微镜对六孔板中的细胞进行拍照，以观察记录细胞数量及形态变化。选择细胞组间变化较为明显的处理后作为记录的时间点。
2.2拍照仪器：莱卡DMIL倒置生物显微镜进行拍摄。
(2)结果
结果如图2所示。碘酸钠是氧化剂，碘酸钠诱导的AMD模型是一种成熟的模型，并且在实验中大量应用。图2中，与阴性对照组(control组)相比，碘酸钠组给药18h后ARPE-19细胞数量开始出现减少，给药24h ARPE-19细胞数量出现显著减少，说明碘酸钠能诱导ARPE-19细胞损伤，本实验造模成功。而与碘酸钠组相比，实验组1(碘酸钠+D609)和实验组2(D609)的ARPE-19细胞数量显著增加，说明D609能有效防护碘酸盐对RPE的氧化损伤，提高PRE细胞的存活率。
其他条件与本实施例上述(1)方法相同，将D609的最终使用浓度分别替换为1μg/mL、5μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL，最终发现与碘酸钠组相比，1～50μg/mL的(碘酸钠+D609)组和(D609)组均能显著增加ARPE-19细胞数量，说明1～50μg/mL D609能有效防护碘酸盐对RPE的氧化损伤，提高PRE细胞的存活率，其中D609浓度为5～30μg/mL时效果较佳，D609浓度为10～20μg/mL时效果更佳。
实施例3细胞存活率实验(CCK8染色)
(1)方法
1.实验材料及步骤
1.1细胞培养基配制：DMEM/F12+10％胎牛血清+1％P/S双抗
1.2D609配制：将D609粉末使用超纯水进行稀释，终浓度为5mg/mL，最终使用浓度为10μg/mL。
1.3碘酸钠配制：将碘酸钠粉末使用培养基进行直接稀释，终浓度为10mM。
1.4准备细胞：将于ATCC购买的视网膜色素上皮细胞细胞系ARPE-19细胞接种至96孔板中，每孔10000个细胞，培养48小时。共分为阴性对照组、模型对照组(碘酸钠)、实验组1：碘酸钠+D609、实验组2：D609。其中实验组1将D609添加于含有10mM碘酸钠的培养基中稀释至10μg/mL，观察细胞变化。
1.5配置CCK8染液：细胞培养液和CCK8染色原液以1：100比例配置。
1.6细胞经药物处理至特定时间点后去上清，每孔加入100μL染液，37℃培养箱中放置1小时。
1.7用酶标仪检测450nm的每孔吸光值进行比较。
存活率计算公式
细胞存活率％＝[A(加药)-A(空白)]/[A(阴性对照)-A(空白)]
(2)结果
结果如图3所示。D609与碘酸钠共同处理组CCK8水平明显恢复至阴性对照组水平。说明D609能有效抑制碘酸盐对RPE的氧化损伤，显著提高PRE细胞的存活率。
实施例4乳酸脱氢酶(LDH)检测
(1)方法
1.实验材料及步骤
1.1细胞培养基配制：DMEM/F12+10％胎牛血清+1％P/S双抗
1.2 D609配制：将D609粉末使用超纯水进行稀释，终浓度为5mg/mL，最终使用浓度为10μg/mL。
1.3碘酸钠配制：将碘酸钠粉末使用培养基进行直接稀释，终浓度为10mM。
1.4准备细胞：将于ATCC购买的视网膜色素上皮细胞细胞系ARPE-19细胞共分为阴性对照组、模型对照组(碘酸钠)、实验组1：碘酸钠+D609、实验组2：D609。其中实验组1将D609添加于含有10mM碘酸钠的培养基中稀释至10μg/mL。在对六孔板中进行相应处理后，收集培养基上清。
1.5按照试剂盒要求配置乳酸脱氢酶(LDH)染液。
1.6在96孔板中每孔加入50μL培养基上清，加入50μL LDH染液，避光室温孵育30分钟。
1.7使用酶标仪检测480nm的每孔吸光值进行比较。
其中，LDH释放水平计算公式：
LDH％＝[A(加药)-A(空白)]/[A(阴性对照)-A(空白)]
(2)结果
结果如图4所示。乳酸脱氢酶释放水平高提示细胞损伤程度严重和细胞坏死的发生。D609与碘酸钠共同处理组能明显降低碘酸钠单独处理引起的乳酸脱氢酶释放水平升高。说明D609能有效抑制碘酸盐对RPE的氧化损伤引起的细胞坏死。
其他条件与本实施例上述(1)方法相同，将D609的最终使用浓度分别替换为1μg/mL、5μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL，最终发现与碘酸钠组相比，1～50μg/mL的(碘酸钠+D609)组和(D609)组均能显著抑制乳酸脱氢酶释放，逆转乳酸脱氢酶释放水平升高，说明1～50μg/mLD609能有效防护碘酸盐对RPE的氧化损伤。
实施例5 DAPI及HMBG1免疫荧光染色
(1)方法
1.实验材料及步骤
1.1细胞培养基配制：DMEM/F12+10％胎牛血清+1％P/S双抗
1.2 D609配制：将D609粉末使用超纯水进行稀释，终浓度为5mg/mL，最终使用浓度为10μg/mL。
1.3碘酸钠配制：将碘酸钠粉末使用培养基进行直接稀释，终浓度为10mM。
1.4准备细胞：将于ATCC购买的视网膜色素上皮细胞细胞系ARPE-19细胞共分为阴性对照组、模型对照组(碘酸钠)、实验组1：碘酸钠+D609、实验组2：D609。其中实验组1将D609添加于含有10mM碘酸钠的培养基中稀释至10μg/mL，观察细胞变化，进行DAPI及HMBG1免疫荧光染色，并通过RNA-sq、Western blog和敲除MT表达基因来检测细胞的金属硫蛋白(Metallothionein，MT)表达水平。
(2)结果
如图5所示，当细胞处于稳态时，HMGB1主要存在于核内；当外界有信号刺激细胞时，HMGB1赖氨酸残基被乙酰化，然后释放到细胞核外，提示细胞损伤或者坏死。D609与碘酸钠共同处理组能明显降低碘酸钠单独处理引起的HMGB1核外释放。说明D609能有效抑制碘酸盐对RPE的氧化损伤。
另外，图6为D609(10μg/mL)对SI氧化应激损伤的ARPE-19细胞的金属硫(Metallothionein，MT)蛋白表达水平。如图6所示，图6中的A图表示通过RNA-sq发现在D609组与SI+D609组中MT的表达量都显著升高。而图6中B图Western blog的结果也跟图6中的A图结果相互印证，另外随着给药时间的推移，MT的表达量也在逐渐升高。在图6中的C图中，敲除MT的表达基因后，D609的抗氧化作用消失(图6中C图第一排)，而在对照组中，载入的是空白的质粒，MT仍可正常表达，D609的抗氧化作用没有受到影响。以上实验结果证明，D609拮抗RPE氧化损主要依赖上调MT表达而不是自身还原性，是D609对细胞保护作用的新机制。
在其他条件与本实施例上述(1)方法相同的条件下，将D609的最终使用浓度分别替换为1μg/mL、5μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL，最终发现与碘酸钠组相比，1～50μg/mL的(碘酸钠+D609)组和(D609)组均能显著随处理时间增加显著升高MT的表达量，说明1～50μg/mL D609能有效防护碘酸盐对RPE的氧化损伤，且D609的浓度优选为5～30μg/mL，进一步优选为10～20μg/mL。
实施例6动物实验
(1)方法
1.动物注射
1.1注射动物为4～6周雄性C57/BL6小鼠，实验分为：模型对照组(碘酸钠，SodiumIodate，SI)、阴性对照组(PBS)、实验组1(碘酸钠+D609)、实验组2(D609)。
1.2碘酸钠注射采用尾静脉注射：将碘酸钠溶解于PBS中，按动物体重计算，每只动物的注射剂量为20mg/kg。
1.3D609注射采用眼眶静脉注射：将D609溶解于PBS中，按动物体重计算，每只动物的注射剂量为50mg/kg。
1.4注射后的小鼠至指定日期后断颈处死，解剖眼球后制作视网膜色素上皮层组织贴片，并用4％PFA固定在载玻片上，随后进行F-actin与ZO-1的免疫荧光染色。
(2)结果
如图7所示，碘酸钠单次尾静脉注射是黄斑变性模型小鼠，可以显著破坏小鼠的视网膜色素上皮层。动物体内的实验表明，在对黄斑变性模型小鼠的尾静脉同时注射D609的实验组与对照组相比，D609能有效预防视网膜色素上皮层的损伤，且无明显药物毒性。
其他条件与本实施例上述(1)方法相同，将D609的最终注射剂量分别替换为25mg/kg、100mg/kg，最终发现与碘酸钠组相比，25mg/kg、100mg/kg的(碘酸钠+D609)组和(D609)组均能显著明显降低碘酸钠单独处理引起的HMGB1核外释放，说明25mg/kg、100mg/kg的D609均能有效预防视网膜色素上皮层的损伤，且无明显药物毒性。
图8为不同浓度的D609(25mg/kg、50mg/kg)对各实验组小鼠的影响；从图8的A图中可以看到D609最佳浓度为25mg/kg，到50mg/kg时细胞的形态已经没有25mg/kg正常；而图8的B图中则是给定浓度的SI与不同浓度的D609搭配，可以看到25mg/kg的效果最好；图8的图C中显示，SI与D609均对心肝肾等器官无显著影响。
实施例7
使用老化的狗进行类似于实施例6中进行类似的试验，验分为：模型对照组(碘酸钠，Sodium Iodate，SI)、阴性对照组(PBS)、实验组1(碘酸钠+D609)、实验组2(D609)、实验组3(碘酸钠+D609+rhuFab)、实验组4(rhuFab)、实验组5(D609+实施例1任意一种抗氧化剂)。结果显示本发明化合物D609可单独使用或与其他抗视网膜损伤保护药物联合用于治疗、减轻、预防或控制动物的视网膜损伤，尤其是对年龄相关性黄斑变性疾病有较好的治疗效果。
申请人声明，以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。