甲基黄连碱用作jnk2激酶抑制剂和治疗银屑病的用途
阅读说明：本技术 甲基黄连碱用作jnk2激酶抑制剂和治疗银屑病的用途 (Use of methylprednisolone coptisine as JNK2 kinase inhibitor and for treating psoriasis ) 是由 朱峰 段秋红 路慧 马腾飞 倪小芳 于 2019-12-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了甲基黄连碱用作JNK2激酶抑制剂的用途,甲基黄连碱能特异性结合JNK2激酶且二者具有较强的结合能力,同时呈剂量依赖性抑制JNK2的活性。甲基黄连碱对银屑病具有很好的治疗活性,该活性与甲基黄连碱抑制JNK、STAT3信号通路的活化以及银屑病标志分子S1007的表达密切相关,因此可作为活性成分用于制备治疗银屑病的药物。(The invention discloses application of methylprednisolone coptisine as a JNK2 kinase inhibitor, wherein the methylprednisolone coptisine can be specifically combined with JNK2 kinase, has stronger combining capacity and simultaneously inhibits the activity of JNK2 in a dose-dependent manner. The methylprednisolone coptisine has good therapeutic activity on psoriasis, and the activity is closely related to the inhibition of the activation of JNK and STAT3 signal pathways and the expression of psoriasis marker molecule S1007 by the methylprednisolone, so that the methylprednisolone coptisine can be used as an active ingredient for preparing a medicament for treating psoriasis.)
技术领域
本发明涉及甲基黄连碱的新用途，尤其是用作JNK2激酶抑制剂的新用途，本发明还涉及甲基黄连碱在制备治疗银屑病药物方面的用途以及一种治疗银屑病的药物。
背景技术
c-jun氨基末端激酶[c-jun N-terminal kinases(JNK)]最早被定义为压力活化蛋白激酶[stress-activated protein kinases(SAPK)]，是一种丝苏氨酸激酶，属于丝裂原活化蛋白激酶[mitogen-activated protein kinase(MAPK)]家族成员。哺乳动物的JNKs由三种不同的基因编码，分别为JNK1、JNK2、JNK3，经选择性剪接有十余种蛋白产物，分子量大小从46kDa到55kDa不等[1]。JNK1和JNK2在大部分组织表达，JNK3的表达则主要限于大脑、心脏和睾丸。JNKs亚型在器官组织分布不同表明其在不同细胞中的功能差异。
JNK2与JNK3有84％序列相近，与JNK1有80％序列相近。JNK2蛋白晶体结构显示具有一个典型的蛋白激酶双叶结构，即N-端结构域(含大量β-折叠)和C-端结构域(含大量α-螺旋)，两叶之间的铰链区(109-113位氨基酸)，为ATP及ATP的竞争抑制剂提供了结合位点。另外，JNK2存在MAPKs独特的***和扩展序列[2]。
JNKs作为MAPK的成员，JNK的活化同MAPK级联激活一样，胞外的刺激(如生长因子、细胞因子)、细胞压力(如热休克、高渗透压、UV-辐射和缺血/再灌注)均能激活JNK信号通路，参与调节细胞增殖、分化、有丝***、细胞存活、细胞凋亡以及自噬等生命活动，在肿瘤的生长和耐药、炎症反应、肥胖与胰岛素抵抗、神经突触可塑性及记忆损伤等病理过程中发挥重要作用[3-19]。
因此，以JNKs为靶点设计或发现抑制剂有望治疗JNKs异常所致相关疾病。目前，根据作用方式，JNKs抑制剂分为两类——ATP竞争性抑制剂和ATP非竞争性抑制剂。关于靶向JNKs的ATP竞争性抑制剂的研究较多，主要包括一些吲唑类、氨基吡唑类、氨基吡啶类、吡啶酰胺类、喹啉派生物和氨基嘧啶类。但是，这些抑制剂尚未作为临床药物广泛应用，仅在动物或细胞疾病模型中作为研究对象。如SP600125，这是一种最早和最被广泛研究的ATP竞争性JNK抑制剂，低浓度可同时抑制三种JNK激酶，高浓度可抑制ERKs和p38 MAPKs[20，21]，在小鼠帕金森疾病模型中展示出良好效果[22]。AS601245是JNKs另外一种抑制剂，在高浓度下也可以抑制转录因子c-jun，在鼠的局部脑缺血再灌注模型中表现出了良好的神经保护作用[23，24]。JNK-IN-7和JNK-IN-8是有效的JNKs特异性抑制剂，共价结合ATP结合位点的保守半胱氨酸基团，对JNKs产生不可逆的抑制[25]。针对JNKs抑制另一策略是通过ATP非竞争性的肽段和小分子化合物来抑制JNKs酶活性，如pepJIP1，是从与JNK结合蛋白——JIP1的结合区域截取的11个氨基酸的肽段，体外试验证实pepJIP1能特异性有效抑制JNKs的活性[26，27]。此外，抑制肽PYC71N也可以阻止JNK与c-jun相互作用进而抑制JNKs的作用[28，29]。
虽然JNKs的抑制剂的开发和研究正在不断发展、成熟，对应抑制剂的作用机制也在细胞和动物模型中越来越清楚，但是JNKs抑制剂作为临床药物的案例并未出现，其中一个重要的问题就是JNKs抑制剂针对JNK不同亚型的选择性差，而JNK1和JNK2在细胞生长过程中往往扮演着互相对立的角色。因此，在JNKs抑制剂的研究中，需要针对不同疾病的发生机理研发特异性靶向不同亚型的JNKs特异性抑制剂，才能发挥更好的治疗作用。
黄连作为我国传统中草药，很早被应用治疗炎症。现已从黄连中分离出多种生物碱，有非洲防己碱、小檗碱、表小檗碱、药根碱、黄连碱、甲氧檗因、甲基黄连碱、小檗红碱、白屈菜赤碱、两面针碱等[30]。研究发现黄连多种成分具有生物学活性，具有抗氧化、抗炎、抗高血压、抗癌等多种功能[31，32]。虽然黄连的药理作用明确，但是其有效成分多，分子靶标不明，作用机理不清，限制了其广泛应用。甲基黄连碱(worenine)是黄连有效成分之一，属于异喹啉类生物碱[33]，其活性及功能研究不详。采用计算机辅助药物筛选技术，我们筛选出甲基黄连碱候选作用靶标，并在细胞和动物实验中发现甲基黄连碱可作为JNK2的抑制剂并用于治疗银屑病。
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发明内容
本发明的目的是提供中药单体药物——甲基黄连碱在抑制JNK2激酶和治疗银屑病方面的新用途。
上述目的是在以下研究的基础上实现的：
1、证明甲基黄连碱能结合JNK2激酶并抑制其酶活性。
对JNK2激酶进行了MST和体外激酶实验，结果发现甲基黄连碱能特异性结合JNK2激酶且二者具有较强的结合能力。同时甲基黄连碱呈剂量依赖性抑制JNK2的活性，从而抑制JNK2对其底物H2AX的磷酸化修饰。
因此，甲基黄连碱可用作JNK2激酶抑制剂，在人或动物由于体内JNK2激酶活性异常所导致的疾病治疗和预防方面具有广泛的应用前景，在体外，甲基黄连碱也具有通过抑制酶活进行相应的检测或诊断等应用的潜力。
2、在银屑病细胞模型中研究甲基黄连碱的作用机理，发现甲基黄连碱抑制JNK2信号通路从而抑制银屑病相关炎症反应。
S1007、STAT3、JNK和p38信号通路高度激活是银屑病最主要分子变化特征。M5(10ng/ml TNF-a,IL-17A,IL-22,IL-1a和Oncostatin-M)(参考文献：Teng X,Hu Z,Wei X,Wang Z,Guan T,Liu N,Liu X,Ye N,Deng G,Luo C,Huang N,Sun C,Xu M,Zhou X,Deng H,Edwards CK 3rd,Chen X,Wang X,Cui K,Wei Y,Li J.IL-37ameliorates theinflammatory process in psoriasis by suppressing proinflammatory cytokineproduction.J Immunol.2014Feb 15；192(4):1815-23.Epub 2014Jan 22.)刺激皮肤细胞是研究银屑病的经典细胞模型，为了进一步研究甲基黄连碱的作用及机制，我们采用M5刺激的银屑病细胞模型观察甲基黄连碱对S1007、STAT3、JNK和p38通路的影响。结果显示甲基黄连碱显著抑制M5诱导的JNK、STAT3信号通路的活化，以及银屑病标志分子S1007的表达。
3、在银屑病动物模型中观察甲基黄连碱的作用，发现甲基黄连碱有效抑制银屑病临床症状和病理改变。
银屑病的经典动物模型是连续5天5％咪唑莫特(Imiquimod，IMQ)涂抹成年Balb/c鼠(九周龄)背部和耳部皮肤，诱导皮肤病变。我们采用此模型观察甲基黄连碱对银屑病的治疗作用。结果显示甲基黄连碱有效抑制5％咪唑莫特诱导的皮肤症状和病理改变。
综合以上以上研究发现，甲基黄连碱对银屑病具有很好的治疗活性，该活性与甲基黄连碱抑制JNK、STAT3信号通路的活化以及银屑病标志分子S1007的表达密切相关，因此可作为活性成分用于制备治疗银屑病的药物，为了进一步提高疗效，也可以将甲基黄连碱与其它活性成分复配后制备治疗银屑病的药物，在制备这些药物时，还可以加入药剂学上可以接受的载体。
根据本发明的一个实施例，该药物为外用药。
附图说明
图1甲基黄连碱抑制JNK2活性的体外激酶实验结果。
图2银屑病细胞模型的建立。
图3采用Western blot检测信号分子评价甲基黄连碱对银屑病细胞模型中JNK2信号通路的抑制作用。
图4甲基黄连碱对咪喹莫特诱导的银屑病动物模型皮肤病理改变的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细地说明。
实施例1甲基黄连碱与JNK2激酶的结合能力和抑制活性
一、微量热泳动仪(MST)测定甲基黄连碱和JNK2的结合常数Kd
(1)从addgene公司购买pGSTag Flag Jnk2a2质粒，转入BL21细菌中表达，37℃培养，ITPG诱导4小时，用GSH-beads分离纯化GST-JNK2a2蛋白。
(2)将GST-JNK2a2重组蛋白根据Monolith NTTM蛋白标记试剂盒RED(Cat#L001)进行标记。甲基黄连碱用DMSO配置成50mM母液，用含5％DMSO的20mM HEPES(pH7.4)测定液进行倍比稀释，最高浓度为2mM，最低浓度为0.14nM，一共16个稀释工作液。各工作液加入浓度为869.6nM的GST-JNK2a2蛋白，在微量热泳动仪上测定平衡解离常数Kd。通过NTAnalysis软件分析，甲基黄连碱与JNK2的结合常数Kd值为116.4μM，说明甲基黄连碱能特异性结合JNK2且二者具有较强的结合能力。
二、通过体外激酶实验测定甲基黄连碱对JNK2活性的抑制
组蛋白H2AX是JNK2激酶的反应底物，为了检测甲基黄连碱对JNK2的活性是否具有抑制作用，我们采用体外激酶实验进行分析。即通过原核表达获取GST-H2AX融合蛋白作为活性JNK2的反应底物以反应激酶活性。实验过程如下：(1)原核表达获取GST-H2AX融合蛋白：从addgene公司购买质粒pDONR223_H2AFX_WT，设计引物PCR扩增H2AX基因片段，构建到原核表达载体pGEX上，转入BL21细菌，37℃培养，ITPG诱导4小时，用GSH-beads分离纯化GST-H2AX蛋白；(2)将重组的组蛋白GST-H2AX作为底物与活性JNK2进行体外激酶反应。首先，将1×激酶缓冲液，活性JNK2和甲基黄连碱(6.25、12.5、25、50、100μM)加到反应管中，32℃水浴40分钟。然后，将组蛋白GST-H2AX和100μM的ATP加入到反应管中，继续32℃孵育1小时。反应产物加入5×上样缓冲液，直接进行Western blot检测磷酸化GST-HAX(p-H2AX)水平。从图1可以看出甲基黄连碱剂量依赖性抑制JNK2活性，在25μM浓度下，甲基黄连碱对活性JNK2的底物GST-H2AX的磷酸化修饰抑制程度达到了90％以上。
实施例2在银屑病细胞模型中观察甲基黄连碱抑制银屑病的作用及分子机理
一、MTT法确定甲基黄连碱加入后80％HaCat细胞存活的浓度
将HaCat细胞消化计数，接种7000个细胞每孔于96孔板，24h后分别加入不同浓度甲基黄连碱(0μM、0.4μM、2μM、10μM、50μM、250μM、1250μM)，每个浓度10孔，加药后24h、48h后，每孔加100μl的0.5mg/ml的MTT，37℃孵育4小时，弃MTT液，加入150μl DMSO，充分震荡使孔中结晶溶解完全，用酶标仪测定490nm波长的吸光度值，分析细胞活力。以80％HaCat细胞存活率作为用药安全浓度，即12.5μM，IC50＝175μM。
二、建立银屑病细胞模型，发现甲基磺连碱抑制银屑病的作用及分子机理
接种HaCat细胞在6cm的培养皿中，60-70％的细胞融合度时，加入M5(10ng/mlTNF-a,IL-17A,IL-22,IL-1a,and Oncostatin-M)和不同浓度甲基黄连碱，48小时后收样，提取细胞总蛋白，Western blot检测银屑病标志分子S1007、STAT3及JNK2信号通路关键分子活性变化。图2显示M5成功诱导JNK2-STAT3-S1007通路活化，表明银屑病细胞模型建立成功。图3显示12.5μM的甲基黄连碱有效抑制M5诱导的JNK2-STAT3-S1007通路活化。试验结果表明在银屑病细胞模型中甲基黄连碱有效抑制JNK2信号通路进而预防和治疗银屑病。
实施例3甲基黄连碱减轻咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病临床表现和病理改变
一、建立银屑病动物模型
将成年Balb/c鼠(九周龄)提前1天进行背部剃毛，随机分成四组：丙酮处理组(n＝4)，丙酮/IMQ组(n＝6),氢化可的松/IMQ组(n＝6),甲基黄连碱/IMQ组(n＝6)。建立银屑病小鼠模型是连续5天在小鼠背部涂抹62.5mg,5％IMQ,左耳涂抹5mg,5％IMQ。丙酮，氢化可的松0.1％30mg，甲基黄连碱(2mM,150ul)在给小鼠背部和耳部涂抹5％IMQ前5h时局部用于小鼠背部和耳部，连续处理5天，杀死小鼠后，收集背部和耳部组织，用于后续试验。
二、用PASI评分法确定甲基黄连碱处理后对IMQ诱导的银屑病临床表现的影响
使用http://pasi.corti.li/评分网站对银屑病动物背部和耳部受损部位进行评分，根据银屑病病变区域占比、病变区域发红(0-4)、增厚(0-4)、鳞屑症状严重程度(0-4)来综合计算银屑病评分。结果见表1－4。
表1甲基黄连碱减轻IMQ诱导小鼠耳部和背部皮肤鳞状斑块形成
注：与咪喹莫特组比，*P<0.05。
表2甲基黄连碱减轻IMQ诱导小鼠耳部和背部皮肤红色斑块形成
注：与咪喹莫特组比，***P<0.005。
表3甲基黄连碱抑制IMQ诱导小鼠耳部和背部皮肤厚度增加
注：与咪喹莫特组比，*P<0.05；***P<0.005。
表4甲基黄连碱降低IMQ诱导小鼠耳部和背部皮肤PASI的综合评分
注：与咪喹莫特组比，*P<0.05；***P<0.005。
三、病理分析
1.HE染色
1.1取皮及固定:颈椎脱臼处死小鼠，用无菌的解剖工具取下小鼠背部皮肤(刮去真皮的脂肪组织和肌肉)和左耳，背部皮肤一分为二，一半置于预先配好的固定液中(10％多聚甲醛)固定24h，用作HE染色及免疫组化，另一半背部皮肤和耳部组织分别置于冻存管中冻于液氮罐中用于后期实验，(蛋白印迹试验和酶联免疫吸附试验)。
1.2.脱水及透明:将预先固定好的组织放入包埋盒中，流水冲洗(去除组织中的固定液)30分钟。置于不同浓度的酒精脱水，一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。
1.3.浸蜡及包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋，冷却凝固成块即成。包埋好的组织块***，才能在切片机上切成很薄的切片。
1.4.切片、展片、烤片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5—8微米厚。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。
1.5.染色：染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。将已入蒸馏水后的切片放入苏木***溶液中染色数分钟。置酸水及氨水中分色，各数秒钟。流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。置70％和90％酒精中脱水各10分钟。置酒精伊红染色液染色2—3分钟。染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。将已透明的切片滴上树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，贴上标笺，切片标本就可使用。
2.在IMQ诱导的小鼠模型中评估甲基黄连碱的局部用药治疗效果
通过形态学观察和病理切片初步探讨了甲基黄连碱对IMQ诱导的银屑病小鼠模型的影响。如图4所示，与正常组相比，IMQ诱导的皮损中出现典型的银屑病特征包括红斑、结垢、增厚和鳞状皮肤病变。IMQ和甲基黄连碱联合处理组显著抑制这些病理变化，只表现出轻微的症状，包括分散的老茧还有几乎看不见鳞片，表皮未见明显增厚，和IMQ与氢化可的松联合处理组效果类似。IMQ处理的皮肤表现为表皮角质层的病理改变，包括上皮层明显的角化病、棘皮病和血管周围炎性细胞浸润，大量的淋巴细胞浸润真皮和表皮层，而且有明显的血管扩张，是典型的银屑病皮肤表型。甲基黄连碱能显著降低表皮厚度，减轻IMQ诱导的银屑病。总之，这些数据表明甲基黄连碱能有效抑制IMQ诱导的小鼠银屑病样炎症和表皮增生。