从蛇毒中提取降纤酶的方法
阅读说明：本技术 从蛇毒中提取降纤酶的方法 (Method for extracting defibrase from snake venom ) 是由 樊献乔 赵尔跃 樊献俄 张洪波 陈学坤 黄兴建 高兴超 杨旭 李�瑞 于 2019-12-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医药技术领域,特别涉及从蛇毒中提取降纤酶的方法。本发明采用了多次不同原理的层析分离,缩短了分离纯化周期,整个过程能在20小时内完成,同时提高降纤酶的纯度和稳定性,从而有效保障了产品质量,显著提升了产品安全性,提高了产品的市场竞争力。(The invention relates to the technical field of medicines, in particular to a method for extracting defibrase from snake venom. The invention adopts chromatographic separation with different principles for a plurality of times, shortens the separation and purification period, can complete the whole process within 20 hours, and simultaneously improves the purity and the stability of defibrase, thereby effectively ensuring the product quality, remarkably improving the product safety and improving the market competitiveness of the product.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别涉及从蛇毒中提取降纤酶的方法。
背景技术
长白山白眉蝮蛇或尖吻蝮蛇蛇毒中的降纤酶是哺乳动物凝血及纤溶系统的蛋白酶。通过专一性的激活或灭活作用，该蛋白酶作用于血液凝固、纤溶系统的各个步骤，产生促凝或抗凝效应。在体外引起血浆纤维蛋白原的凝聚，起凝血作用；在体内它不激活凝血因子XIII。所以由它水解而生成的纤维蛋白凝块没有侧链交联，容易被纤维蛋白溶酶降解、清除，造成体内纤维蛋白原浓度降低而表现为抗凝效应。在临床上蛇毒类凝血酶能用于防治血栓栓塞性疾病、急性脑梗死，以及脑梗死再复发的预防等。
降纤酶为白色非结晶粉末，有引湿性，易溶于水。有分解血浆纤维蛋白原、溶解血栓、降低血液粘度和血小板聚集力作用。用于急性缺血性脑血管病、不稳定性绞痛、高粘滞血症等血栓性疾病。
国内公开的降纤酶的制备方法较多，但多因步骤多、时间长、收率低、蛋白构想不稳定导致其活性低，染菌污染的风险较大等缺陷。下面具体介绍一下这些分离纯化降纤酶的方法﹕
杨开荣等发表在《蛇志》上的方法为﹕(1﹚取DEAE-Sephadex A-50，加入新鲜蒸馏水，加热煮沸15min，放至室温，加PH7.6的0.05mol/L Tris-HCL缓冲液搅拌，放置数小时，弃去上清液，再加入上述缓冲液，如此反复数次，测pH为7.6，即达平衡。用上述缓冲液平衡，是因为降纤酶的最适pH为7.4～7.6，且在pH7.6的条件下，DEAE-Sephadex A-50稳定。(2﹚蛇毒粗品均匀加在DEAE-Sephadex A-50柱中。洗脱条件，第一梯度，在搅拌瓶中加pH7.6,0.1mol/L氯化钠的Tris缓冲液1000ml；第二梯度，在搅拌瓶中加pH7.6,0.1mol/L氯化钠的Tris缓冲液1000ml，贮存瓶中加pH7.6,0.1mol/L氯化钠的Tris缓冲液1000ml。共分离出9个峰，将合格峰合并，即得。
何国振等发表在《广东药学》上的方法如下﹕
将尖吻蝮蛇蛇毒20克溶于8.0的缓冲液1000ml中，上柱，用平衡缓冲液冲洗后再用含0.15氯化钠的缓冲液洗脱，收集含降纤酶活性成分的溶液。亲和层析填料系用经溴化氰活化，接上二氨基二丙基胺后经琥珀酸化，偶联亲和降纤酶的配基而成。将柱层析收集的洗脱液上亲和层析柱，用平衡缓冲液冲洗后，用含0.2盐酸胍的平衡缓冲液洗脱，收集洗脱液，经超滤去盐浓缩，冻干，即得产品。此法从蛇毒20克制得产品69.3毫克，比活2886单位/毫克。
魏金荣等发表在《中国生化药物杂志》上的方法如下﹕将Benzamidine Sepharose6B 150ml装入A柱(2.6cm×30cm﹚中，将Sephadex G-25 200ml装入B柱(1.6cm×100cm﹚中,分别用含0.1mol/LNaCL的0.05mol/L Tris-HCL缓冲液(pH8.0﹚平衡。取蛇毒冻干粉10克，用上述缓冲液60ml溶解，10,000r/min离心5min，取上清液上A柱。待供试品全部进入胶内，用含1.50mol/L NaCL的0.05mol/L Tris-HCL缓冲液(pH8.0)洗脱，流速为0.3ml/min，弃流出液。待紫外吸收峰回到基线后，将A柱与B柱串联，用含0.1mol/L NaCL和0.25mol/LBenzamidine的0.05mol/L Tris-HCL缓冲液洗脱，流速0.3ml/min，收集第II峰的后部分。
黄寓等发表在《中国药业》上的方法为﹕称取冻干粗毒2克，溶于20ml基础缓冲液(0.02mol/LTris-HCl，pH8.0)中，4℃条件下完全溶解，然后置4℃冷冻离心机，在10,000/min转速下离心处理10分钟，取上清液，上预先用基础缓冲液平衡好的DEAE-SepharoseFast Flow柱。先用基础缓冲液洗脱，洗脱至基线平直，然后用基础缓冲液对含1mol/L NaCL的基础缓冲液进行直线梯度洗脱(5个柱体积)。收集有降纤酶活力的部分，装入透析袋内，用0.05mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS,PH7.40﹚进行透析除盐，然后上以0.05mol/LPBS缓冲液(pH7.4﹚平衡过的亲和层析柱，上完样先用0.05mol/L pH7.4PBS缓冲液洗脱杂蛋白，直至基线平直。然后用0.1mol/L的甘氨酸-HCL缓冲液(pH4.0﹚洗脱，收集活性峰，立即用1mol/L的Tris溶液中和，使pH值在6.0～8.0之间。
金星光等发表在《中国药业》上的纯化方法如下﹕第一步上EAE-Sepharose FastFlow离子交换柱，第二步上肝素-Sepharose 4B亲和层析柱，第三步上Sephadex G-75凝胶层析柱。
申请号为201510936687.4的专利，用10000MW和50000MW的膜超滤蛇毒溶液，去除绝大部分的的杂质，再用肝素-Sepharose4B柱分离纯化降纤酶。申请号为201410807957.7的专利，采用Argmatin-Sepharose亲和层析，DEAE-Sepharose Fast flow离子交换层析，SepharcylS-200凝胶过滤层析分离纯化降纤酶。申请号为201310083428.2的专利，采用Butyl-PGMA、Octyl-PGMA、Penyl-PGMA等聚甲基丙烯酸环氧丙酯(PGMA)对80％左右降纤酶进行疏水层析纯化。申请号为201710709123.6的专利，采用DEAE-Sepharose A50离子交换层析分离纯化降纤酶。申请号为201410807768.X的专利，采用DEAE-Sepharose Fast flow离子交换层析和Sepharcyl S-200凝胶过滤层析凝胶过滤层析分离纯化降纤酶。
从以上文献中可以看出，由于蛇毒中降纤酶目标蛋白含量低，杂蛋白干扰大，简单运用离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析或疏水层析，很难纯化到高纯度的降纤酶目标蛋白。另一方面，降纤酶稳定性差，不选择恰当的缓冲液和贮藏条件，即使分离到高纯度目标蛋白，也会很快降解，文献中公开的工艺很难应用于产业化，所以开发一种纯度高、稳定性好的降纤酶工艺成为一种迫切需求。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种从蛇毒中提取降纤酶的方法。该方法制得的降纤酶纯度高、活性高且稳定性好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种从蛇毒中提取降纤酶的方法，包括如下步骤：
步骤1、取蛇毒干粉经第一缓冲液溶解，离心，收集上清液；
步骤2、取步骤1制得的所述上清液经阴离子交换层析，以所述第一缓冲液洗脱至基线平稳，经NaCl溶液梯度洗脱，收集具有酶活性的蛋白峰溶液；
步骤3、取步骤2制得的具有酶活性的蛋白峰溶液超滤浓缩后，以第二缓冲液稀释，制得第一浓缩调整液；
步骤4、取步骤3制得的第一浓缩调整液经阴离子交换层析，以所述第二缓冲液洗脱至基线平稳，经NaCl溶液梯度洗脱，收集具有酶活性的蛋白峰溶液；
步骤5、取步骤4制得的具有酶活性的蛋白峰溶液超滤浓缩后，以所述第二缓冲液稀释，制得第二浓缩调整液；
步骤6、取步骤5制得的所述第二浓缩调整液经阴离子交换层析，以所述第二缓冲液洗脱至基线平稳，经NaCl溶液梯度洗脱，收集具有酶活性的蛋白峰溶液；
步骤7、取步骤6制得的具有酶活性的蛋白峰溶液超滤浓缩后，以第三缓冲液稀释，制得第三浓缩调整液；
步骤8、取步骤7制得的所述第三浓缩调整液经疏水层析，以所述第三缓冲液洗脱至基线平稳，经NaCl溶液梯度洗脱，收集具有酶活性的蛋白峰溶液；
步骤9、取步骤8制得的具有酶活性的蛋白峰溶液超滤浓缩后，以储备缓冲液洗涤，超滤浓缩，收集洗涤液，制得降纤酶溶液；
所述第一缓冲液为含0.1％～0.5％PEG或甘油的、pH值为7.5±0.5的0.01～0.1MTris-HCl缓冲液；
所述第二缓冲液为含0.01M～1.0MNaCl、0.1％～0.5％PEG或甘油、pH5.2±1.0的无机酸盐缓冲液；
所述第三缓冲液为含0.5M～2M硫酸铵的、pH值为7.0±0.5的0.01M～0.1M Tris-HCl缓冲液；
所述储备缓冲液为pH值7.0±0.5含0.01mol/L～0.05mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液、含0.01～0.05mol/L NaCl溶液或去离子水中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述蛇毒为长白山白眉蝮蛇蛇毒或尖吻蝮蛇蛇毒。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述阴离子交换层析采用UniGel-DEAE、UniCore-DEAE、DEAE-Sepharose F.F、DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换层析柱；
所述阴离子交换层析的上样流速为8～10ml/min，以所述第一缓冲液洗脱的流速为10～15ml/min；所述梯度洗脱的浓度为0～0.1mol/L、0～0.5mol/L或0～1.0mol/L，速度为10～15ml/min。
本发明所述蛇毒来源于尖吻蝮蛇[Agkistrodon acutus(Guenther)]或长白山白眉蝮蛇[Agkistrodon halys(ussriensis Emelianor)]。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述收集具有酶活性的蛋白峰溶液具体为：开始收集时峰高吸收值(500mA左右)，电导率(11ms/cm左右)及梯度(30％左右)，从峰翘起端滞后开始收集；到峰降至峰谷前止收，止收峰高吸收值(400mA左右)，电导率(15ms/cm左右)及梯度(40％左右)。酶活性蛋白峰的参数与填料特性、缓冲液种类和浓度、梯度条件等有关，峰参数不尽一致，根据实际情况收集。本发明在此不做限定。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述超滤浓缩采用分子量不大于30KDa超滤膜加压浓缩；
步骤3中所述稀释的倍数为：5ml～100ml所述第二缓冲液/g蛇毒蛋白。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述超滤浓缩采用分子量为10KDa～30KDa超滤膜在氮气0.1MPa～0.3MPa压力下浓缩，0～10℃时的浓缩比为10～30。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤4中所述阴离子交换层析采用UniGel-DEAE、UniCore-DEAE、DEAE-Sepharose F.F阴离子交换层析柱；
所述阴离子交换层析的上样流速为8～10ml/min，以所述第二缓冲液洗脱的流速为10～15ml/min；所述梯度洗脱的浓度为0.01～2.0mol/L、0.1～3.0mol/L或1.0～4.0mol/L NaCl，速度为10～15ml/min。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤4中所述收集具有酶活性的蛋白峰溶液为：开始收集时峰高吸收值(70mA左右)，电导率(13.5ms/cm左右)及梯度(43％左右)，从峰翘起端滞后开始收集；到峰降至峰谷前止收，止收峰高吸收值(70mA左右)，电导率(15ms/cm左右)及梯度(49％左右)，到该峰降至峰谷前止收。酶活性蛋白峰的参数与填料特性、缓冲液种类和浓度、梯度条件等有关，峰参数不尽一致，根据实际情况收集。本发明在此不做限定。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤5中所述超滤浓缩采用分子量不大于30KDa超滤膜加压浓缩；
步骤5中所述稀释的倍数为：5ml～100ml所述第二缓冲液/g蛇毒蛋白。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤5中所述超滤浓缩采用分子量为10KDa～30KDa超滤膜在氮气0.1MPa～0.3MPa压力下浓缩，0～10℃时的浓缩比为10～30。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤6中所述阴离子交换层析采用UniQ、NanoQ、UniCore-Q阴离子交换层析柱；
所述阴离子交换层析的上样流速为3～6ml/min，以所述第二缓冲液洗脱的流速为5～10ml/min；所述梯度洗脱的浓度为0.01～2.0mol/L、0.1～3.0mol/L或1.0～4.0mol/L，速度为5～10ml/min。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤6中所述收集具有酶活性的蛋白峰溶液为：开始收集时峰高吸收值(70mA左右)，电导率(13.5ms/cm左右)及梯度(43％左右)，从峰翘起端滞后开始收集；到峰降至峰谷前止收，止收峰高吸收值(70mA左右)，电导率(15ms/cm左右)及梯度(49％左右)，到该峰降至峰谷前止收。酶活性蛋白峰的参数与填料特性、缓冲液种类和浓度、梯度条件等有关，峰参数不尽一致，根据实际情况收集。本发明在此不做限定。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤7中所述超滤浓缩采用分子量不大于30KDa超滤膜加压浓缩；
步骤7中所述稀释的倍数为：5ml～100ml所述第三缓冲液/g蛇毒蛋白。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤7中所述超滤浓缩采用分子量为10KDa～30KDa超滤膜在氮气0.1MPa～0.3MPa压力下浓缩，，0～10℃时的浓缩比为10～30。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤8中所述疏水层析采用UniHR Butyl、UniHRPhenyl、NanoHR Butyl、NanoHR Phenyl疏水层析柱；
所述疏水层析的上样流速为4～8ml/min，以所述第三缓冲液洗脱的流速为5～10ml/min。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤8中所述收集具有酶活性的蛋白峰溶液，即穿透峰。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤9中所述超滤浓缩采用分子量不大于30KDa超滤膜加压浓缩；
步骤9中所述洗涤的倍数为：5ml～100ml所述储备缓冲液/g蛇毒蛋白。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤9中所述超滤浓缩采用分子量为10KDa～30KDa超滤膜在氮气0.1MPa～0.3MPa压力下浓缩，，0～10℃时的浓缩比为10～30。
在本发明的一些实施例中，步骤4、步骤6中柱层析无机酸盐缓冲液是磷酸氢二钠-磷酸缓冲液、磷酸氢二钾-磷酸缓冲液、乙酸钠-乙酸缓冲液中的一种。
在本发明的一些实施例中，步骤1、步骤2、步骤4、步骤6中PEG为PEG2000、PEG4000、PEG6000中的一种，或多种的混合物。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的方法制得的降纤酶。
本发明采用了多次不同原理的层析分离，缩短了分离纯化周期，整个过程能在20小时内完成(见表1)，同时提高降纤酶的纯度和稳定性，从而有效保障了产品质量，显著提升了产品安全性，提高了产品的市场竞争力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示RP-HPLC法检测三批样品纯度图谱；
图2示电泳法(SDS-PAGE法)检测三批样品纯度的电泳图。
具体实施方式
本发明公开了一种从蛇毒中提取降纤酶的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种从尖吻蝮蛇蛇毒或长白山白眉蝮蛇中提取降纤酶的方法，该方法包括如下步骤：
步骤1、蛇毒粉溶解离心：蛇毒干粉用含0.1％-0.5％PEG或甘油的0.01-0.1MTris-HCl(pH:7.5±0.5)缓冲液溶解，5000～8000rpm离心10～20min去沉淀，得上清液。
步骤2、粗品纯化：将上清液以8～10ml/min流速上样于UniGel-DEAE、UniCore-DEAE、DEAE-Sepharose F.F、DEAE-Sepharose CL-6B等阴离子交换层析柱，用含0.1％-0.5％PEG或甘油的0.01-0.1MTris-HCl(pH:7.5±0.5)缓冲液A以12～15ml/min洗脱流速洗脱直至基线平稳，然后加入并不断增大NaCl溶液的浓度0～0.1mol/L、0～0.5mol/L或0～1.0mol/L进行梯度洗脱(12～15ml/min)，收集具有酶活性的蛋白峰溶液，开始收集时峰高吸收值(500mA左右)，电导率(11ms/cm左右)及梯度(30％左右)，从峰翘起端滞后开始收集；到峰降至峰谷前止收，止收峰高吸收值(400mA左右)，电导率(15ms/cm左右)及梯度(40％左右)。酶活性蛋白峰的参数与填料特性、缓冲液种类和浓度、梯度条件等有关，峰参数不尽一致，根据实际情况收集。
步骤3、超滤浓缩1：将步骤2收集的具有酶活性蛋白峰溶液分次装入截留分子量不大于30KDa超滤膜的超滤器内，加压(0.1MPa～0.3MPa)浓缩，收集浓缩液于洁净瓶中，用适量步骤4柱层析缓冲液稀释备用(5-100ml缓冲液/g蛇毒)。
步骤4、中品纯化1：将上步浓缩调整液以8～10ml/min流速上样于UniGel-DEAE、UniCore-DEAE、DEAE-Sepharose F.F等阴离子交换层析柱，用含0.01-1.0M NaCl、0.1％-0.5％PEG或甘油、pH5.2±1.0的无机酸盐缓冲液A以10～15ml/min洗脱流速洗脱至基线平稳，然后不断增大NaCl溶液的浓度(0.01～2.0mol/L、0.1～3.0mol/L或1.0～4.0mol/L)进行梯度洗脱(10～15ml/min)，收集具有酶活性的蛋白峰溶液，开始收集时峰高吸收值(70mA左右)，电导率(13.5ms/cm左右)及梯度(43％左右)，从峰翘起端滞后开始收集；到峰降至峰谷前止收，止收峰高吸收值(70mA左右)，电导率(15ms/cm左右)及梯度(49％左右)，到该峰降至峰谷前止收。酶活性蛋白峰的参数与填料特性、缓冲液种类和浓度、梯度条件等有关，峰参数不尽一致，根据实际情况收集。
步骤5、超滤浓缩2：将步骤4收集的具有酶活性蛋白峰溶液分次装入截留分子量不大于30KDa超滤膜的超滤器内，加压(10KDa～30KDa)浓缩，收集浓缩液至洁净瓶中，用适量步骤6层析缓冲液稀释备用(5-100ml缓冲液/g蛇毒)。
步骤6、中品纯化2：将上步浓缩调整液以3～6ml/min流速上样于UniQ、NanoQ、UniCore-Q等阴离子交换层析柱用含0.01-1.0MNaCl、0.1％-0.5％PEG或甘油、pH5.2±1.0的无机酸盐缓冲液A以一定洗脱流速(5～10ml/min)洗脱至基线平稳，然后不断增大NaCl溶液的浓度(0.1～3.0mol/L或1.0～4.0mol/L)进行梯度洗脱(5～10ml/min)，收集具有酶活性的蛋白峰溶液，开始收集时峰高吸收值(70mA左右)，电导率(13.5ms/cm左右)及梯度(43％左右)，从峰翘起端滞后开始收集；到峰降至峰谷前止收，止收峰高吸收值(70mA左右)，电导率(15ms/cm左右)及梯度(49％左右)，到该峰降至峰谷前止收。酶活性蛋白峰的参数与填料特性、缓冲液种类和浓度、梯度条件等有关，峰参数不尽一致，根据实际情况收集。
步骤7、超滤浓缩3：将步骤6收集的具有酶活性蛋白峰溶液分次装入截留分子量不大于30KDa超滤膜的超滤器内，加压(10KDa～30KDa)浓缩，收集浓缩液至洁净瓶中，用适量步骤8层析缓冲液稀释备用(5-100ml缓冲液/g蛇毒)。
步骤8、精品纯化：将降纤酶中品2以4～8ml/min的流速上样于UniHR Butyl、UniHRPhenyl、NanoHR Butyl、NanoHR Phenyl等疏水层析柱，用含0.5-2M硫酸铵的0.01-0.1MTris-HCl(pH:7.0±0.5)冲液以一定洗脱流速(5～10ml/min)洗脱，收集具有酶活性的蛋白峰溶液备用，即穿透峰。
步骤9、缓冲液置换：将步骤8具有酶活性蛋白的峰溶液装入截留分子量不大于30KDa超滤膜的超滤器内，加压(10KDa～30KDa)浓缩，0～10℃时的浓缩比为10～30。再加入冷却至2-10℃的储备缓冲液，超滤浓缩更换缓冲液。重复操作以上步骤1-3次，用冷却的储备缓冲液洗涤浓缩液，合并洗涤液混匀，即为降纤酶溶液，所得溶液2-10℃保存备用或冷冻干燥。
在本发明的一些实施例中，步骤1中所述的缓冲液是pH:7.5±0.5的含0.1％～0.5％PEG或甘油的0.01-0.1MTris-HCl缓冲液。
在本发明的一些实施例中，步骤2中的阴离子交换层析柱是UniGel-DEAE、UniCore-DEAE、DEAE-Sepharose F.F、DEAE-Sepharose CL-6B中的一种。
在本发明的一些实施例中，步骤2中的缓冲液是pH:7.5±0.5的含0.1％～0.5％PEG或甘油的0.01-0.1MTris-HCl-缓冲液。
在本发明的一些实施例中，步骤4中的阴离子交换层析柱是UniGel-DEAE、UniCore-DEAE、DEAE-Sepharose F.F中的一种。
在本发明的一些实施例中，步骤4中的缓冲液是pH5.2±1.0的含0.1％～0.5％PEG或甘油、0.01-1.0MNaCl的无机酸盐缓冲液中的一种。
在本发明的一些实施例中，步骤6中的阴离子交换层析柱是UniQ、NanoQ、UniCore-Q中的一种。
在本发明的一些实施例中，步骤6中的缓冲液是pH5.2±1.0的含0.1％～0.5％PEG或甘油、0.01-1.0MNaCl的无机酸盐缓冲液中的一种。
在本发明的一些实施例中，步骤4、步骤6中柱层析无机酸盐缓冲液是磷酸氢二钠-磷酸缓冲液、磷酸氢二钾-磷酸缓冲液、乙酸钠-乙酸缓冲液中的一种。
在本发明的一些实施例中，步骤1、步骤2、步骤4、步骤6中PEG为PEG2000、PEG4000、PEG6000中的一种，或多种的混合物。
在本发明的一些实施例中，步骤8中所述的疏水层析柱是UniHR Butyl、UniHRPhenyl、NanoHR Butyl、NanoHR Phenyl中的一种。
在本发明的一些实施例中，步骤8中所述缓冲液是pH7.0±0.5的含0.5～2.0mol/L硫酸铵的0.01-0.1MTris-HCl缓冲液。
在本发明的一些实施例中，步骤9中所述储备缓冲液是pH7.0±0.5含0.01～0.05mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液、含0.01～0.05mol/L NaCl溶液、去离子水中的一种。
本发明与现有技术相比，克服了现有技术不足，优点在于采用了多次不同原理的层析分离，缩短了分离纯化周期、提高降纤酶的纯度和活性，从而有效保障了产品质量，显著提升了产品安全性，提高了产品的市场竞争力。
本发明提供的从蛇毒中提取降纤酶的方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1缓冲液配制
第一步阴离子交换层析(UniCore-10DEAE柱)：
缓冲A液：0.01MTris，0.1％PEG6000，盐酸调节pH7.0
缓冲B液：A液+0.1M NaCl，盐酸调节pH7.0
第二步阴离子交换层析(UniGel-30DEAE柱)：
缓冲A液：0.025M磷酸氢二钠，0.01M NaCl，0.1％PEG6000，磷酸调节pH4.2
缓冲B液：0.05M磷酸氢二钠，2.0M NaCl，0.1％PEG6000，磷酸调节pH4.2
第三步阴离子交换层析(NanoQ-30L柱)：
缓冲A液：0.025M磷酸氢二钠，0.01M NaCl，0.1％PEG6000，磷酸调节pH4.2
缓冲B液：0.05M磷酸氢二钠，2.0M NaCl，0.1％PEG6000，磷酸调节pH4.2
疏水层析(UniHR Phenyl-30L柱)：
缓冲A液：0.01M Tris，0.5M硫酸铵，盐酸调节pH6.5
储备缓冲液500ml：0.585gNaCl
2缓冲液过滤
将配制好的缓冲液用0.45μm滤膜过滤至洁净瓶中，挂状态标识备用。
3蛇毒粉溶解过滤
将10g尖吻蝮蛇蛇毒粉溶于200ml第一步阴离子交换层析缓冲液A中，充分溶解后，8000rpm离心10min去沉淀，贮于洁净瓶中待纯化。
4分离纯化
4.1粗品纯化
4.1.1将蛇毒溶液以10ml/min的速度泵入预分离柱UniCore-10DEAE(上样时气泡不可进入管道内)，用缓冲液A在15ml/min流速下进行洗脱至基线平稳后，用缓冲液A：B按照0～0.1mol/L NaCl溶液梯度洗脱,洗脱速度15ml/min，收集具有酶活性的蛋白峰溶液至洁净瓶中备用。
4.1.2超滤浓缩
将收集的降纤酶粗品溶液分次装入10KDa超滤膜的超滤器内，在氮气0.1MPa压力下浓缩至20ml左右，收集浓缩液至洁净瓶中备用，并用第二步阴离子交换层析缓冲液A稀释至50ml。
4.2中品1纯化
4.2.1将上步浓缩调整液以10ml/min的流速上样于UniGel-30DEAE柱，用缓冲液A在15ml/min流速下进行洗脱至基线平稳后，用缓冲液A：B按照0.01～2.0mol/L NaCl溶液梯度洗脱，洗脱速度15ml/min，收集具有酶活性的蛋白峰溶液至洁净瓶中备用。
4.2.2超滤浓缩
将收集的降纤酶中品1溶液分次装入10KDa超滤膜的超滤器内，在氮气0.1MPa压力下浓缩至20ml左右，收集浓缩液至洁净瓶中备用，并用第三步阴离子交换层析缓冲液A稀释至50ml。
4.3中品2纯化
4.3.1将降纤酶中品1溶液以6ml/min的流速度上样于NanoQ-30L柱，上样结束，用缓冲液A：B 0.01～2.0mol/L NaCl溶液梯度洗脱，洗脱速度10ml/min，收集具有酶活性的蛋白峰溶液至洁净瓶中备用。
4.3.2超滤浓缩：
4.3.2.1将收集的降纤酶中品2溶液分次装入10KDa超滤膜的超滤器内，在氮气0.1MPa压力下超滤浓缩至15ml左右后，并用第四步疏水层析柱缓冲液A稀释至50ml备用。
4.4精品纯化
4.4.1将降纤酶中品2溶液以8ml/min的流速上样于UniHR Phenyl-30L上样结束，用缓冲液A洗脱，洗脱速度10ml/min，收集具有酶活性的蛋白峰溶液至洁净瓶中备用。
4.5冷冻干燥
向4.4.1制备的蛋白峰溶液中装入10KDa超滤膜的超滤器内，在氮气0.1MPa压力下超滤浓缩至10ml左右后，加入氯化钠溶液超滤浓缩(0～10℃时的浓缩比为10～30。)更换缓冲液至50ml以内。重复操作一次，将收集液混匀，即为降纤酶溶液，计量体积，取样送检。
实施例2
1缓冲液配制
第一步阴离子交换层析(DEAE-Sepharose F.F柱)：
缓冲A液：0.05M Tris，0.3％甘油，盐酸调节pH7.5
缓冲B液：A液+0.5M NaCl，盐酸调节pH7.5
第二步阴离子交换层析(UniCore-3DEAE柱)：
缓冲A液：0.05M乙酸钠，0.1M NaCl，0.3％甘油，醋酸调节pH5.2
缓冲B液：0.05M乙酸钠，3.0M NaCl，0.3％甘油，醋酸调节pH5.2
第三步阴离子交换层析(UniQ-15L柱)：
缓冲液A：0.05M乙酸钠，0.1M NaCl，0.3％甘油，醋酸调节pH5.2
缓冲液B：0.05M乙酸钠，3.0M NaCl，0.3％甘油，醋酸调节pH5.2
疏水层析(UniHR Phenyl-60s柱)：
缓冲A液：0.05MTris，1.5M硫酸铵，盐酸调节pH7.0
储备缓冲液500ml：去离子水
2缓冲液过滤
将配制好的缓冲液用0.45μm滤膜过滤至洁净瓶中，挂状态标识备用。
3蛇毒粉溶解过滤
将2g白眉蝮蛇蛇毒粉溶于100ml第一步阴离子交换层析缓冲液A中，充分溶解后，5000rpm离心10min去沉淀，贮于洁净瓶中待纯化。
4分离纯化
4.1粗品纯化
4.1.1将蛇毒溶液以9ml/min的速度泵入预分离柱DEAE-Sepharose F.F柱柱(上样时气泡不可进入管道内),用缓冲液A在12ml/min流速下进行洗脱至基线平稳后，用缓冲液A：B按照0～0.5mol/L NaCl溶液梯度洗脱,洗脱速度12ml/min，收集具有酶活性的蛋白峰溶液至洁净瓶中备用(用核酸蛋白检测仪控制)。
4.1.2超滤浓缩
将收集的降纤酶粗品溶液分次装入30KDa超滤膜的超滤器内，在氮气0.2MPa压力下浓缩至20ml左右，收集浓缩液至洁净瓶中备用，并用第二步阴离子交换层析缓冲液A稀释至100ml。
4.2中品1纯化
4.2.1将上步降纤酶粗品溶液以9ml/min的流速上样于UniCore-3DEAE柱柱，用缓冲液A在12ml/min流速下进行洗脱至基线平稳后，用缓冲液A：B按照0.1～3.0mol/L NaCl溶液梯度洗脱,洗脱速度12ml/min，收集具有酶活性的蛋白峰溶液至洁净瓶中备用。
4.2.2超滤浓缩
将收集的降纤酶中品1溶液分次装入30KDa超滤膜的超滤器内，在氮气0.2MPa压力下浓缩至10ml左右，收集浓缩液至洁净瓶中备用，并用第三步阴离子交换层析缓冲液A稀释至100ml。
4.3中品2纯化
4.3.1将降纤酶中品1溶液以5ml/min的流速度上样于UniQ-15L柱，上样结束，用缓冲液A：B 0.1～3.0mol/L NaCl溶液梯度洗脱，洗脱速度8ml/min，收集具有酶活性的蛋白峰溶液至洁净瓶中备用。
4.3.2超滤浓缩：
4.3.2.1将收集的降纤酶中品2溶液分次装入30KDa超滤膜的超滤器内，在氮气0.2MPa压力下超滤浓缩至10ml左右后，并用疏水层析缓冲液A稀释至100ml备用。
4.4精品纯化
4.4.1将降纤酶中品2溶液以6ml/min的流速度上样于UniHR Phenyl-60s柱，上样结束，用缓冲液A洗脱,洗脱速度8ml/min，收集具有酶活性的蛋白峰溶液至洁净瓶中备用。
4.5冷冻干燥
向4.4.1制备的蛋白峰溶液中装入30KDa超滤膜的超滤器内，在氮气0.2MPa压力下超滤浓缩至10ml左右后，加入去离子水更换缓冲液至40ml以内。重复操作一次，将收集液混匀，即为降纤酶溶液，计量体积，取样送检。
实施例3
1缓冲液配制
第一步阴离子交换层析(UniGel-80DEAE柱)：
缓冲A液：0.1M Tris，0.5％PEG2000，盐酸调节pH8.0
缓冲B液：A液+1.0M NaCl，盐酸调节pH8.0
第二步阴离子交换层析(UniCore-3DEAE柱)：
缓冲A液：0.04M、磷酸氢二钾，1.0M NaCl，0.5％PEG2000，磷酸调节pH6.2
缓冲B液：0.04M磷酸氢二钾，4.0M NaCl，0.5％PEG2000，磷酸调节pH6.2
第三步阴离子交换层析(UniCore-10Q柱)：
缓冲A液：0.04M、磷酸氢二钾，1.0M NaCl，0.5％PEG2000，磷酸调节pH6.2
缓冲B液：0.04M磷酸氢二钾，4.0M NaCl，0.5％PEG2000，磷酸调节pH6.2疏水层析(UniHR Butyl-80L柱)：
缓冲A液：0.05M Tris，1.0M硫酸铵，盐酸调节pH7.5
储备缓冲液500ml：去离子水
2缓冲液过滤
将配制好的缓冲液用0.45μm滤膜过滤至洁净瓶中，挂状态标识备用。
3蛇毒粉溶解过滤
将5g尖吻蝮蛇蛇毒粉溶于1000ml第一步阴离子交换层析缓冲液A中，充分溶解后，5000rpm离心15min去沉淀，贮于洁净瓶中待纯化。
4分离纯化
4.1粗品纯化
4.1.1将蛇毒溶液以8ml/min的速度泵入预分离柱UniGel-80DEAE柱(上样时气泡不可进入管道内)，用缓冲液A在10ml/min流速下进行洗脱至基线平稳后，用缓冲液A：B按照0～1.0mol/L NaCl溶液梯度洗脱，洗脱速度10ml/min，收集具有酶活性的蛋白峰溶液至洁净瓶中备用(用核酸蛋白检测仪控制)。
4.1.2超滤浓缩
将收集的降纤酶粗品溶液分次装入10KDa超滤膜的超滤器内，在氮气0.3MPa压力下浓缩至20ml左右，收集浓缩液至洁净瓶中备用，并用第二步阴离子交换层析缓冲液A稀释至1000ml。
4.2中品1纯化
4.2.1将上步降纤酶粗品溶液以8ml/min的流速上样于UniCore-3DEAE柱，用缓冲液A在10ml/min流速下进行洗脱至基线平稳后，用缓冲液A：B按照1.0～4.0mol/L NaCl溶液梯度洗脱,洗脱速度10ml/min，收集具有酶活性的蛋白峰溶液至洁净瓶中备用。
4.2.2超滤浓缩
将收集的降纤酶中品1溶液分次装入10KDa超滤膜的超滤器内，在氮气0.3MPa压力下浓缩至10ml左右，收集浓缩液至洁净瓶中备用，并用第三步阴离子交换层析缓冲液A稀释至1000ml。
4.3中品2纯化
4.3.1将降纤酶中品1溶液以3ml/min的流速度上样于UniCore-10Q柱，上样结束，用缓冲液A：B 1.0～4.0mol/L NaCl溶液梯度洗脱,洗脱速度5ml/min，收集具有酶活性的蛋白峰溶液至洁净瓶中备用。
4.3.2超滤浓缩：
4.3.2.1将收集的降纤酶中品2溶液分次装入10KDa超滤膜的超滤器内，在氮气0.3MPa压力下超滤浓缩至8ml左右后，并用疏水层析缓冲液A稀释至1000ml备用。
4.4精品纯化
4.4.1将降纤酶中品2溶液以4ml/min的流速度上样于UniHR Butyl-80L柱，上样结束，用缓冲液A洗脱，洗脱速度5ml/min，收集具有酶活性的蛋白峰溶液至洁净瓶中备用。
4.5冷冻干燥
向4.4.1制备的蛋白峰溶液中装入30KDa超滤膜的超滤器内，在氮气0.2MPa压力下超滤浓缩至10ml左右后，加入去离子水更换缓冲液至40ml以内。重复操作一次，将收集液混匀，即为降纤酶溶液，计量体积，取样送检。
效果例
对于上述实施例分离纯化得到的样品除按照降纤酶质量标准(国家药品标准第十六册WS1-XG-031-2000)进行全项检验外，还增加了采用RP-HPLC法测定降纤酶的纯度。检验方法和结果如下(检验结果见表2、图1、图2)：
(1)出血毒检测
实验材料：氯化钠注射液：上海现代哈森(商丘)药业有限公司，批号1610280221。降纤酶原料，批号：实施例1样品、实施例2样品、实施例3样品，昆明龙津药业股份有限公司生产。
实验动物：品系：ICR小鼠，购于昆明医科大学实验动物中心，动物合格证号：No53004100000727，体重为18-20g/6周龄。性别：雌雄各半。动物数：每组5只。
实验方法：取降纤酶原料，用氯化钠注射液制成每1ml含100单位的溶液作为供试品溶液。取体重18-22g的小白鼠5只，背部皮下注射供试品溶液0.2ml，注射后24小时处死动物，剥皮观察，小鼠背部注射部位不得有出血现象。
检测结果：实施例1样品、实施例2样品、实施例3样品出血毒符合规定。
(2)神经毒性检测
实验材料：氯化钠注射液：上海现代哈森(商丘)药业有限公司，批号1610280221。降纤酶原料，批号：实施例1样品、实施例2样品、实施例3样品，，昆明龙津药业股份有限公司生产。
实验动物：家鸽，体重为300-500g。性别：雌雄各半。动物数：每组3只。
实验方法：取降纤酶原料，用氯化钠注射液制成每1ml含75单位的溶液作为供试品溶液。取体重300-500g的鸽子3只，按照每1kg体重静脉注射供试品溶液0.5ml，观察24小时，动物不得出现抽搐、死亡，如3只鸽子中有一只出现抽搐死亡，应另取鸽子5只复试，均不得出现死亡。
检测结果：实施例1样品、实施例2样品、实施例3样品神经毒符合规定。
(3)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定降纤酶纯度
试剂：
1、丙烯酰胺-双丙烯酰胺贮备液取丙烯酰胺29.2g，双丙烯酰胺0.8g，加水溶解并稀释至100ml，过滤至棕色瓶中，4℃保存。
2、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.8)取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加水溶解，用2mol/L盐酸溶液调节pH至8.8，加水稀释至100ml，4℃保存。
3、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH6.8)取上述羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.8)适量，加水(1:2)稀释，用2mol/L盐酸溶液调节pH至6.8，加水稀释至100ml，4℃保存。
4、10％十二烷基硫酸钠溶液取十二烷基硫酸钠10g，加水溶解并稀释至100ml，室温保存。
供试品缓冲液取水4.8ml，三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH6.8)1.2ml，甘油1.0ml，10％十二烷基硫酸钠溶液2.0ml，0.5％(w/v)溴酚蓝溶液0.5ml，β-巯基乙醇0.5ml混匀，4℃保存。
电极储备液(pH8.3)取三羟甲基氨基甲烷15g，甘氨酸72g，十二烷基硫酸钠5g，加水溶解并稀释至1000ml，4℃保存。临用前5倍稀释。
10％过硫酸铵(临用前配制)
固定液取三氯醋酸5g，加水200ml溶解，加入甲醇200ml，再加水至500ml。
染色液取0.5g考马斯亮蓝R-250，溶于200ml水中，量取甲醇200ml与冰醋酸50ml，再加水至500ml。
脱色液取甲醇400ml，醋酸100ml，加水至1000ml，充分混合。
保存液取甲醇400ml，醋酸100ml与甘油100ml，加水至1000ml，充分混合。
凝胶的制备
分离胶的制备(12％)取水3.35ml，2.5ml三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.8)。10％十二烷基硫酸钠100μl，丙烯酰胺-双丙烯酰胺储备液4.0ml，混匀，脱气15分钟后，再加入10％过硫酸铵溶液50μl，四甲基乙二胺5μl，充分混匀，立即小心地倒入制胶模具中，在胶面上覆盖一层水，水平静置至胶体凝固。
浓缩胶的配制取水6.0ml，2.5ml的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH6.8)，10％十二烷基硫酸钠100μl，丙烯酰胺-双丙烯酰胺储备液1.3ml，混匀，脱气15分钟后，再加入10％过硫酸铵溶液50μl，四甲基乙二胺10μl，充分混匀，立即倒入去掉水层的分离胶上，***梳子，梳子底部与分离胶的前沿距离约1cm，水平放置至胶体凝固。
标准品和供试品的制备
标准蛋白溶液取标准蛋白，加供试品缓冲液制成每1μg蛋白的标准蛋白溶液。临用前置沸水浴中5分钟，冷却。
供试品溶液取本品适量(按蛋白含量计算)，加供试品缓冲液制备成每1μl中含11μg蛋白供试品溶液。临用前置沸水浴中5分钟，冷却。
电泳
凝胶板制好后，各孔分别加入10μl的供试品溶液或标准蛋白溶液，倒入电极缓冲液，200伏电压下进行电泳。当蓝色溴酚蓝接近胶板底部时，停止电泳，取下胶板，在溴酚蓝处做标记。
染色和脱色
将胶板置于固定液中，固定液30分钟，再取出胶板置于染色液中，37℃染色2-3小时，然后将胶板置于脱色液中，至背景清晰(中途可换几次脱色液)，将胶板置于保存液中，室温放置1小时。
检测结果：实施例1样品、实施例2样品、实施例3样品电泳呈一条带，符合规定。
(4)RP-HPLC法测定降纤酶纯度
RP-HPLC法测定降纤酶纯度的色谱条件为：色谱柱为Vydac214TP54-C4(5um,250mm×4.6mm),流动相A为0.1％三氟乙酸，B为乙腈-水(90:10含0.1％三氟乙酸)，流速为每分钟0.8ml,柱温为45℃，检测波长为280nm；按下表进行梯度洗脱。样品中主峰与相邻杂峰分离度应大于1.5；理论板数按降纤酶计算均大于20000。
测定方法：取实施例1～3制得的降纤酶，用流动相稀释成每1ml中含1mg的溶液作为供试品溶液。取供试品溶液和对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按照面积归一化法计算，供试品中主峰的相对百分含量不得低于99.0％。
测定结果，实施例1样品的纯度100％、实施例2样品的纯度99.62％、实施例3样品的纯度99.60％。
(5)效价测定
酶活力测定
标准品溶液的制备取降纤酶标准品，加三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.4)制成每1ml中含20、10、5、2.5单位的溶液。
供试品溶液的制备取本品适量，用三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.4)(取三羟甲基氨基甲烷2.42g与氯化钠0.585g，加水适量使溶解，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至7.4，加水稀释至500ml)制成标准曲线范内浓度的溶液。
测定法取试管(1cm×10cm)4支，各精密加入0.4％纤维蛋白原溶液(取纤维蛋白原，用上述三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.4)制成0.4％的可凝蛋白溶液)0.2ml，置(37±0.5)℃水浴中保温2分钟，依次精密量取4种浓度的标准品溶液各0.2ml，迅速加入上述各试管中，立即摇匀。同时即时，于(37±0.5)℃水浴中观察纤维蛋白原的初凝时间，每种浓度测5次，求平均值(5次测定最大于最小值之差不得超过平均值的10％，否则重测)。在双对数坐标纸上，以标准品单位数(U)为横坐标，初凝时间为纵坐标计算回归方程(相关系数应大于0.99)。
取供试品溶液按上法测定，用直线回归方程求得每1mg的单位数。
蛋白含量
试剂：碱性铜试液取氢氧化钠10g，碳酸钠50g，加水400ml使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50ml使其溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使其溶解，将两液混合作为乙液。
临用前，合并甲、乙两液，并加水至500ml。
对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml中含0.3mg的溶液。
取取实施例1～3制得的降纤酶适量，加水制成每1ml中含0.15mg蛋白的溶液作为供试品溶液，精密量取供试品溶液1.0ml，照福林酚测定法测定，计算每1mg的中蛋白含量。
表1：本工艺和查询专利工艺(申请号201410807957.7)生产周期对比
表2：实施例检验结果汇总
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。