从蝇蛆中分离蛆激酶的方法及应用
阅读说明：本技术 从蝇蛆中分离蛆激酶的方法及应用 (Method for separating maggot kinase from fly maggots and application thereof ) 是由 刘灿 刘秋荻 马彤瑶 马兰青 荣龙 张凯欣 戴隆海 雷梦 孙祎振 杨明峰 孙媛霞 于 2021-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明提供蛆激酶的制备方法,所述方法包括将蝇蛆进行匀浆、利用调节杂蛋白等电点沉淀法除去杂蛋白,通过离子交换层析与亲和层析纯化,获得蛆激酶,溶纤实验表明制备的蛆激酶具有高活性溶纤效果。本发明的工艺简单,获得的酶比活高,为抗血栓药物研发提供了基础。(The invention provides a preparation method of maggot kinase, which comprises homogenizing maggots, removing impure protein by using an isoelectric point precipitation method for regulating impure protein, and purifying by ion exchange chromatography and affinity chromatography to obtain maggot kinase, wherein a fiber dissolving experiment shows that the prepared maggot kinase has high-activity fiber dissolving effect. The method has simple process, and the obtained enzyme has high specific activity, thereby providing a foundation for the research and development of antithrombotic drugs.)
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及从蝇蛆中分离蛆激酶的方法及其应用。
背景技术
血栓的形成是局部的血液凝固导致的，血栓主要成分为不溶性纤维蛋白、血小板、白细胞及红细胞。血栓形成作为一种病理过程，与血管、血小板和凝血酶以及血流速度有关。全世界每年数百万人死于脑梗塞、脑溢血、心肌梗死等与血栓相关的疾病，因此亟待开发有溶栓活性的药物。
溶栓药物可通过人工化学合成和天然提取获得。自然界是获取溶栓药物的天然宝库，天然的溶栓酶来源广泛，小到陆生微生物，大到海洋生物、动物以及植物之中均有溶栓活性成分的发现。来源不同的天然溶栓酶，其降解血栓机制的作用存在差异，从目前的研究报道来看，大部分的溶栓酶均可以通过直接作用于纤维蛋白和激活体内纤溶系统，来高效降解血栓、抑制血栓形成。1980年，须见洋等从发酵纳豆中发现了高溶栓活性的纳豆激酶，后续研究表明纳豆激酶不但能溶解血栓，还能抑制血小板凝固，起到防范血栓形成的作用。1983年日本宫崎大学美原恒教授从蚯蚓提取溶栓蛋白酶蚓激酶，首次从蚯蚓中分离出具有溶栓活性的蚓激酶。此外，从海洋生物中的单环刺螠，蛇毒、黄粉虫、人尿液中亦发现了具有溶栓和抗凝血作用的酶。
发明内容
蝇蛆容易饲养，原料成本低廉，通常以饲料作为商品进行销售，目前尚无蛆激酶的研究方法和生产工艺。本发明提供了从蝇蛆中分离蛆激酶的方法，该酶显示出高溶纤、抗栓活性，为蝇蛆的高附加值开发提供了基础，同时也为新的溶栓药物的开发提供了思路和技术，具有重大的社会价值和经济价值。
具体来说，本发明提供了以下技术方案：
一方面，本发明提供蛆激酶的制备方法，其特征在于包括将蛆激酶提取溶液的pH调节为4.5-6.0，以除去杂质蛋白的步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括将蛆激酶提取溶液的pH调节为4.5-6.0，4-8℃静置，以除去杂质蛋白的步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括采用亲和填料对蛆激酶进行精制的步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括对蛆激酶粗制品进行亲和层析的步骤，所述亲和层析优选阳离子交换树脂CM52。
在一些实施方案中，所述方法还包括在获得蛆激酶粗制品前进行脱盐至电导率<100μs/cm的步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括对获得的蛆激酶进行辐照或滤膜除菌的步骤。
在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(1)将蝇蛆用清水清洗，按原料质量与水或缓冲液质量比为1:3-15进行匀浆；
(2)匀浆液高速离心或过滤，除去杂质和不溶物，得到蛆激酶提取溶液；
(3)调节提取溶液的pH，优选pH范围为4.5-6.0，在低温(4-8℃)静置，待有蛋白沉淀析出，离心去沉淀，收集上清液；
(4)用缓冲液(例如PBS缓冲液)将所述上清液平衡至pH 5～8，缓冲液浓度优选10-50mM，用0.45μm滤膜过滤，获得平衡好的澄清溶液；
(5)利用离子交换树脂，吸附(4)所获得的澄清溶液中的蛆激酶蛋白分子，洗脱后收集活性峰溶液，优选阳离子交换树脂CM52；
(6)将溶液通过超滤或透析，进行脱盐，获得截留分子量为10000-50000道尔顿的蛋白溶液，经浓缩、脱盐至电导率<100μs/cm，得到蛆激酶浓缩液；
(7)浓缩液冷冻或真空干燥后，获得粗酶；
(8)酶的精制：步骤(5)获得的活性峰溶液，脱盐、进行亲和吸附，收集洗脱峰，所用的亲和填料为吸附丝氨酸蛋白的填料；
(9)将洗脱的蛋白进行纯化，干燥(优选冷冻干燥)后获得蛆激酶。
在一些实施方案中，步骤(8)的亲和填料接枝有选自以下任一种能吸附丝氨酸蛋白酶的配体，所述配体优选选自苯甲脒、对氨基苯甲脒、对氨基苯脒盐酸盐、精氨酸、慈菇蛋白酶抑制剂、大豆胰蛋白酶抑制剂和卵黏蛋白。
在一些实施方案中，步骤(1)中所述原料为选自家蝇、市蝇、大头金蝇、红头丽蝇及丝光绿蝇的幼虫。
在一些实施方案中，步骤(1)中所述原料还可以为麻蝇科幼虫，例如别麻蝇属幼虫，例如棕尾别麻蝇。
另一方面，本发明提供根据上述的方法获得的蛆激酶在作为抗血栓药物原料和辅料成分中的用途。
另一方面，本发明提供血栓疾病的治疗方法，所述方法包括将根据上述方法获得的蛆激酶施用至需要其的受试者。
有益效果
(1)发现蝇蛆中杂蛋白等电点主要分布在pH4.5-6，在对提取液进行预处理时，利用调节pH的方法，将杂蛋白沉淀，蛆激酶保留，工艺简单，试剂成本低。
(2)首次利用蝇蛆获得高活性的溶栓酶，为蝇蛆的高价值开发提供了基础。
(3)本发明的蛆激酶原料便宜、易获取、活性高，为低价、高活性抗血栓药物开发提供了基础，具有重要的社会价值。
附图说明
图1示出在预处理中调节pH＝5.5使杂蛋白沉淀的示意图；
图2示出利用CM52填料进行层析洗脱的示意图，可以看到有多个蛋白峰；
图3示出利用卵黏蛋白亲和吸附洗脱的示意图，可以看出通过亲和层析获得了单一洗脱峰，制备出了高纯度的蛆激酶；
图4示出利用苯甲脒亲和吸附后洗脱的示意图，可以看出通过亲和层析获得了单一洗脱峰，制备出了高纯度的蛆激酶；
图5示出实施例5中由原料纯化为蛆激酶的SDS蛋白质电泳图，从左至右第一泳道为电泳marker，第二泳道为原料匀浆液，第三泳道为酸沉后上清液，第四泳道为CM52层析后样品，第五泳道为苯甲脒亲和纯化样品，第六泳道为marker；
图6示出依据国家药品标准WS1-(X-052)-2001Z，利用纤维平板法进行活性测定的平板图，溶纤圈1、2为蚓激酶标准品(购置于中国食品药品检定研究院)，溶纤圈3为本发明苯甲脒亲和层析后获得的蛆激酶样品。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
实施例1蛆激酶的制备
在预处理工艺上，本发明不是通过硫酸铵沉淀的方法，除去杂蛋白保留蛆激酶，而是在预处理时，“调节上清溶液的pH，优选pH范围为4.5-6.0，在低温4-8℃静置，待有蛋白沉淀析出，离心去沉淀”，通过调节pH除去杂蛋白，工艺更简单，成本低。
具体来说，实施例1包括以下步骤：
(1)家蝇幼虫100g用水或氯化钠进行清洗，加入500mL水进行匀浆。
(2)匀浆液8000r/min离心，除去杂质和不溶物，收集上清，用500目滤膜过滤，得到蛆激酶提取溶液A。
(3)收集提取溶液A，用稀盐酸调节溶液A的pH至pH＝5.5，在4℃静置2h，溶液中出现絮状蛋白并发生沉淀，如附图1所示，8000r/min高速离心，弃去沉淀(杂质蛋白)，收集上清液，上清液用0.45μm滤膜过滤，获得澄清溶液B。
(4)利用0.01M PBS、pH＝8缓冲液将溶液B平衡至pH＝8，利用0.45μm滤膜过滤，获得溶液C。
(5)利用阳离子交换树脂CM-52，吸附溶液C中蛆激酶分子，利用含有0.5M NaCl的PBS(0.01M PBS、pH＝8，在一些实施方案中，可以采用KCl)缓冲液洗脱后收集活性峰溶液D。
(6)将溶液D通过超滤，获得截留分子量为10000-50000道尔顿的分子截留液，用电导仪测定截留液电导率，浓缩、脱盐至电导率<100μs/cm，得到蛋白浓缩液E。
(7)浓缩液E冷冻或真空干燥后，获得粗酶0.0071g(7.1mg),比活力68872U/mg。
(8)或将步骤(5)获得的溶液D，透析，将溶液D置于PBS中平衡至pH＝7.4，用0.45μm滤膜过滤，滤液用苯甲脒琼脂糖凝胶4FF进行亲和吸附，收集洗脱峰F溶液。
注：苯甲脒琼脂糖凝胶4FF填料(索莱宝公司)，平衡液为0.1M pH7.4PBS，含0.05MNaCl；洗脱液为50mM pH3甘氨酸盐酸缓冲液含0.5MNaCl；
(9)将F溶液进行透析脱盐，冷冻干燥后获得高活性蛆激酶分子0.0005g(0.5mg)。产物活性依据参照国家食品药品监督管理局国家药典委员会审定国家药品标准WS1-(X-052)-2001Z，进行活性测定。比活力为：451512U/mg。
蛆激酶溶纤活性测定
取纤维蛋白原溶液39ml(每1ml中含1.5mg的可凝蛋白溶液)，置烧杯中，边搅拌边加入55℃琼脂糖溶液39ml、凝血酶溶液3.0ml(每1ml中含1BP单位的溶液)，立即混匀，快速倒入直径14cm塑料培养皿中，室温水平放置1小时，打孔。精密量取不同浓度的蚓激酶标准品溶液及供试品溶液，分别点在同一平皿中，加盖，置37℃恒温箱中反应18小时。取出后用卡尺测量溶圈垂直两直径，以蚓激酶标准品单位数的对数为横坐标，垂直两直径乘积的对数为纵坐标，计算回归方程，将供试品垂直两直径乘积的对数代入回归方程，计算供试品效价单位数。)
(9)通过辐照或滤膜进行除菌。
注：进行离子交换层析和亲和层析时，利用JP-3000型蛋白核酸检测仪器，实时测定洗脱蛋白的吸光值
实施例2蛆激酶的制备-未精制
(1)市蝇幼虫100g用水或氯化钠进行清洗，加入1000mL水进行匀浆。
(2)匀浆液7000r/min离心，除去杂质和不溶物，收集上清，用500目滤膜过滤，得到滤液A。
(3)收集溶液A，用稀盐酸调节溶液A的pH至pH＝6，在4℃静置2h，溶液中出现絮状蛋白并发生沉淀，8000r/min高速离心，弃去沉淀，收集上清液B。
(4)利用0.01M PBS、pH＝8缓冲液将溶液B平衡至pH＝8，利用0.45μm滤膜过滤，获得溶液C。
(5)利用阳离子交换树脂CM-52，吸附溶液C中蛆激酶分子，用含0.5M NaCl PBS缓冲液(0.01M PBS、pH＝8)进行洗脱后收集活性峰溶液D。
(6)将溶液D通过超滤手段，获得截留分子量为10000-50000道尔顿分子的蛋白质溶液，溶液经浓缩、脱盐至电导率<100μs/cm，得到蛋白浓缩液E。
(7)浓缩液E冷冻干燥或真空干燥后，获得粗酶0.0081g(8.1mg)，比活力为：71181U/mg。
实施例3蛆激酶的制备-苯甲脒琼脂脂糖凝胶进行精制
(1)家蝇幼虫100g用水或氯化钠进行清洗，加入1000mL水进行匀浆。
(2)匀浆液7000r/min离心，除去杂质和不溶物，收集上清，用500目滤膜过滤，得到滤液A。
(3)用稀盐酸调节滤液A的pH至pH＝6，在4℃静置2h，溶液中出现絮状蛋白并发生沉淀，8000r/min高速离心，弃去沉淀，收集上清液B。
(4)利用0.01M PBS、pH＝8缓冲液将溶液B平衡至pH＝8，利用0.45μm滤膜过滤，获得溶液C。
(4)利用阳离子交换树脂CM-52，吸附溶液C中蛆激酶分子，用含0.5M NaCl水溶液进行洗脱后收集活性峰溶液D。
(5)将溶液D，透析，然后用PBS缓冲液平衡至pH＝7.4，用0.45μm滤膜过滤，滤液用苯甲脒琼脂脂糖凝胶4FF进行亲和吸附，收集洗脱峰E溶液。
注：苯甲脒琼脂糖凝胶4FF填料(索莱宝公司)，平衡液为0.1M pH7.4PBS，含0.05MNaCl；洗脱液为50mM pH3甘氨酸盐酸缓冲液含0.5M NaCl；
(8)将E溶液透析脱盐，冷冻干燥后获得高活性蛆激酶0.0006g(6mg)，优选冷冻干燥。比活力为：453753U/mg。产物用SDS-PAGE电泳进行分子量分析。产物活性依据参照国家食品药品监督管理局国家药典委员会审定国家药品标准WS1-(X-052)-2001Z，进行活性测定。
注：SDS-PAGE电泳条件为：产物进行蛋白质电泳，分离胶、浓缩胶配方如下；电泳条件：电压调至约80v保持恒压。待溴酚蓝标记移动进浓缩胶胶内时，电压调至约120v保持恒压。
表1分离胶、浓缩胶配方
实施例4蛆激酶的制备-预处理时将溶液A的pH至pH＝4.5，卵黏蛋白进行亲和层析、精制
(1)家蝇幼虫100g用水或氯化钠进行清洗，加入1500mL水进行匀浆。
(2)匀浆液8000r/min高速离心，或过滤，除去杂质和不溶物，得到提取溶液A。
(3)用稀盐酸调节溶液A的pH至pH＝4.5，在4℃静置2h，溶液中出现絮状蛋白并发生沉淀，8000r/min高速离心，弃去沉淀，收集上清液B。
(4)用离子强度为10mM、pH＝8PBS缓冲液调节上清液B的pH为8，利用0.45μm滤膜过滤，获得溶液C。
(5)利用阳离子交换树脂CM-52，吸附C溶液中酶蛋白分子，洗脱后收集活性峰溶液D。
(6)将步骤(5)获得的溶液D，透析，pH 8Tris-HCl缓冲液平衡，利用卵黏蛋白层析柱进行亲和吸附，用洗脱液洗脱亲和层析柱上吸附的蛋白，收集具有活性的洗脱峰E溶液。
(7)将E溶液透析脱盐，冷冻干燥后获得高活性蛆激酶0.0006g(0.6mg)，比活力为466571U/mg：产物活性测定：依据参照国家食品药品监督管理局国家药典委员会审定国家药品标准WS1-(X-052)-2001Z，进行溶纤活性测定。
溶液D用0.1M pH 8Tris-HCl缓冲液进行平衡，含0.5M KCl；洗脱液为0.1M pH2.5甲酸溶液含0.5M KCl。所用的亲和填料卵黏蛋白层析柱制备方法如下：
1亲和层析柱(卵黏蛋白层析柱的制备)
1.1.琼脂糖凝胶层析介质(Sepharose 4B)的活化
称取8g琼脂糖凝胶层析介质Sepharose 4B，置于G-3玻璃烧结漏斗内，用100ml1.0mol/L NaCl溶液抽洗(少量多次)，100ml蒸馏水抽洗，抽干后转移到100ml三角瓶中备用。
1.2活化剂配方
琼脂糖凝胶层析介质8g依次加入蒸馏水7ml，1,4二氧六环8ml，2mol/L NaOH6.5ml，环氧氯丙烷1.5ml。
1.3活化
将配制的层析介质的三角瓶，放入45℃恒温水浴中，于160r/min，振摇活化2h。停止活化，转移到G-3玻璃烧结漏斗内，抽去活化剂，用100ml蒸馏水洗(少量多次)，转移100ml到三角瓶中，准备偶联。
1.4偶联
称取约100mg鸡卵粘蛋白(购置于sigma公司，)，用10ml 0.1mol/L pH9.5 Na2CO3缓冲液充分溶解。然后将溶解好的鸡卵粘蛋白溶液，转移到100ml三角瓶中与活化的琼脂糖凝胶介质混匀。在40℃恒温水浴中，于130-140r/min，振摇偶联22小时左右，停止偶联。
1.5洗涤
取一个洗净的500ml抽滤瓶，将已经偶联好的琼脂糖凝胶层析介质转移到G-3玻璃烧结漏斗内抽滤。
用100ml 1.0mol/L NaCl溶液抽洗，100ml蒸馏水抽洗，再用20mL亲和层析洗脱液和50mL蒸馏水分别洗涤。将亲和介质转移到50ml的小烧杯内，加入20ml亲和层析平衡液，浸泡20分钟，脱气，待用。
实施例1、3、4均说明含有丝氨酸配体(苯甲脒、卵黏蛋白)的填料均能吸附蛆激酶，使蛆激酶纯化，提示蛆激酶为丝氨酸蛋白酶。
比较例
本实施例为比较实施例，在预处理中，未调节提取液A的pH，A溶液中杂蛋白不能沉淀，则不能获得澄清溶液，将导致后续分离工艺难以进行，如下所示。
(1)原料家蝇幼虫100g用水或氯化钠进行清洗，加入500mL水进行匀浆。
(2)匀浆液7000r/min离心，除去杂质和不溶物，收集上清，用500目滤膜过滤，得到蛆激酶提取溶液A，溶液A为浑浊液体。
(3)利用阳离子交换树脂CM-52，吸附A溶液中蛆激酶分子，因溶液A为浑浊、含大量杂质液体，液体粘稠、色素含量高，故CM-52无法有效吸附蛆激酶，后续提取工艺不能进行。故调节提取液A的pH至4.5-6来沉淀杂蛋白从而获取澄清溶液是进行后续提取家蝇幼虫中蛆激酶工艺的关键步骤。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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