阅读说明：本技术 海马孵化酶基因及其编码蛋白和应用 (Hippocampus japonicus hatching enzyme gene and coding protein and application thereof ) 是由 张辉贤 林强 张博 张艳红 于 2019-08-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了海马孵化酶基因及其重组蛋白和应用。本发明首次鉴定了线纹海马具有两种孵化酶HCE和LCE,且通过体外重组表达,获得了具有生物学活性的孵化酶蛋白,且发现孵化酶HCE和LCE具有消化溶解海马胚胎卵膜的作用,介导海马的孵化过程。本发明为大规模海马繁育技术提供了理论指导,具有潜在的重要经济价值和意义。(The invention discloses a hippocampal hatching enzyme gene, a recombinant protein and application thereof. The invention firstly identifies that the hippocampus kelloggi has two hatching enzymes HCE and LCE, obtains hatching enzyme protein with biological activity by in vitro recombination expression, and finds that the hatching enzymes HCE and LCE have the function of digesting and dissolving the embryo egg membrane of the hippocampus, and mediates the hatching process of the hippocampus. The invention provides theoretical guidance for large-scale hippocampal breeding technology and has potential important economic value and significance.)

海马孵化酶基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明涉及水产动物分子生物学技术领域，具体涉及一种海马孵化酶基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

海马(Hippocampus)是珍贵的海洋药源鱼类，同时具有很高的观赏价值；近年来，过度捕捞、生境破坏和环境污染导致野生海马资源急剧衰减，绝大多数海马种类都濒临灭绝。资源短缺的加剧和市场需求的旺盛推动这海马养殖产业的快速发展，海马的人工繁育技术是资源保护与可持续性利用的最有效策略，线纹海马(Hippocampus erectus)目前是我国养殖量最大的海马种类。然而，海马的人工繁育技术还存在诸多难题，特别对海马繁殖生物学的基础研究较少，关于海马产卵和孵化机理等方面的研究仍有限，无法为大规模海马繁育技术提供足够的理论指导。

孵化酶是参与鱼类孵化过程的关键酶，鱼类的孵化过程主要包括孵化酶对卵膜的溶解消化和胚胎通过肌肉运动使其从卵膜中孵化出来的两个阶段。大多数鱼类的孵化酶包括两种酶：一种为高卵膜裂解酶(high choriolytic enzyme,HCE)，另一种是低卵膜裂解酶(low choriolytic enzyme,LCE)。其作用机理为：HCE首先使得完整卵壳膨胀，膨胀后的卵膜内层即成为LCE的底物，可进一步被LCE彻底消化。目前尚未见线纹海马孵化酶HCE和LCE基因相关研究的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种线纹海马孵化酶基因及其编码蛋白和应用，所述的线纹海马孵化酶HCE和LCE基因产生的重组表达蛋白具有消化溶解海马胚胎卵膜的作用，介导海马的孵化过程。

为实现上述的发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种线纹海马孵化酶HCE基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。相应的，由HCE基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种线纹海马孵化酶LCE基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。相应的，由LCE基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组表达载体，其含有上述的线纹海马孵化酶HCE基因和/或LCE基因。优选，所述的载体为pET3c载体。

一种宿主细胞，其含有上述的线纹海马孵化酶HCE基因和/或LCE基因或上述的重组表达载体。优选，所述的宿主细胞为大肠杆菌细胞。

本发明还提供由上述的线纹海马孵化酶HCE或其编码基因，或线纹海马孵化酶LCE或其编码基因在制备促进海马胚胎孵化制剂中的应用。

一种促进海马胚胎孵化制剂，其含有线纹海马孵化酶HCE或其编码基因，或线纹海马孵化酶LCE或其编码基因。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

本发明首次鉴定了线纹海马具有两种孵化酶HCE和LCE，且通过体外重组表达，获得了具有生物学活性的孵化酶蛋白，且发现孵化酶HCE和LCE具有消化溶解海马胚胎卵膜的作用，介导海马的孵化过程。本发明为大规模海马繁育技术提供了理论指导，具有潜在的重要经济价值和意义。

附图说明

图1为SDS-PAGE检测线纹海马孵化酶HCE和LCE重组蛋白的大小。其中，1.HCE包涵体；2.LCE包涵体；3.诱导HCE蛋白上清液，4.诱导LCE蛋白上清液；5.未诱导的HCE蛋白；6.未诱导的LCE蛋白；7.BL21(DE3)pLysE菌体8.蛋白Marker。

图2为线纹海马孵化酶HCE和LCE的特异性底物检测(MCA多肽底物分析)。其中，纵坐标表示酶的活性指数，单位为nM_AMC//CA/30min，横坐标表示底物种类，1.Boc-Val-Pro-Arg-MCA；2.Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA；3.Z-Ala-Ala-Asn-MCA；4.Suc-Ile-Ile-Trp-MCA；5.Suc-Ala-Pro-Ala-MCA；6.Suc-Ala-Glu-MCA；7.Z-Leu-Arg-Gly-Gly-MCA；8.Z-Val-Lys-Met-MCA；9.Z-Phe-Arg-MCA；10.Boc-Phe-Ser-Arg-MCA；11.Ac-Asp-Glu-Val-Asp-MCA；12.Bz-Arg-MCA；13.Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-MCA；16.Boc-Val-Leu-Lys-MCA；17.Sue(OMe)-Ala-Ala-Pro-Val-MCA；18.Z-Leu-Leu-Glu-MCA；19.Z-Leu-Leu-Leu-MCA。

图3为线纹海马孵化酶HCE和LCE消化受精卵膜的活性大小检测。其中，control：未做任何处理的海马卵膜(阴性对照)；HCE：HCE消化后的海马卵膜；LCE：LCE消化后的海马卵膜；HCE+LCE：HCE和LCE共同消化后的海马卵膜。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1线纹海马孵化酶HCE和LCE重组蛋白的制备

(1)构建HCE-pET3c和LCE-pET3c重组表达载体，其具体方法如下：

用两对特异性引物分别扩增HCE和LCE蛋白的成熟肽序列(所述的HCE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，LCE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，并将其***表达载体pET3c的NdeI和BamHI多克隆位点间，经PCR和测序证明构建的重组表达载体成功：

所述的两对特异性引物：

HCE正向引物F1：5’-CATATGAATGCCATTAAGTGCTGGTCCCAG-3’(SEQ ID NO.5)；

HCE反向引物R1：5’-GGATCCTAACAGCTGTAGAGCATGTTTATC-3’(SEQ ID NO.6)；

LCE正向引物F2：5’-CATATGACCGCCATCAAGTGCGCGGTGAAC-3’(SEQ ID NO.7)；

LCE反向引物R2:5’-GGATCCCTAATTCCAACACTTGTATAGACG-3’(SEQ ID NO.8)；

划线部分的碱基序列CATATG、GGATCC分别为NdeI和BamHI内切酶位点。

(2)获得转化子高拷贝的大肠杆菌表达菌株HCE/LCE-pET3c:BL21(DE3)pLysE，其具体方法为：

以线纹海马胚胎cDNA为模板，使用引物F1/R1和F2/R2分别扩增得到约600bp的HCE和LCE基因；将PCR产物和pET3c载体同时进行NdeI和BamHI双酶切，于37℃酶切3h后，胶回收酶切后的HCE、LCE片段，以及pET3c载体，于16℃使用DNA连接酶将HCE、LCE片段分别与pET3c载体过夜连接，得到HCE-pET3c(其是将核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的线纹海马孵化酶HCE基因***到pET3c载体中)和LCE-pET3c(其是将核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的线纹海马孵化酶LCE基因***到pET3c载体中)重组表达载体；

利用构建好的HCE-pET3c和LCE-pET3c重组表达载体，经42℃热激转化BL21(DE3)pLysE感受态细胞，经氨苄青霉素和氯霉素筛选，分别获得阳性克隆菌株HCE-pET3c:BL21(DE3)pLysE和LCE-pET3c:BL21(DE3)pLysE。

(3)转化子的发酵培养与诱导表达：

分别挑取8个表达菌株的单克隆菌落(HCE-pET3c:BL21(DE3)pLysE或LCE-pET3c:BL21(DE3)pLysE)于装有20mL LB培养基的锥形瓶中，加入氨苄青霉素和氯霉素两种抗生素筛选，于37℃、150转/分的转速的培养箱中培养3～4h，直到OD600值为0.6时，转至装有200mL的LB培养基的锥形瓶中，培养1.5～2h，直到OD600值为0.6时，加入0.1mM的IPTG进行诱导表达，表达4h后，5000g离心10min，去除上清，收集菌体，加入10mL Tris-EDTA溶液(50mM Tris pH8.0，1mM EDTA)溶解，冷冻过夜。

(4)制备包涵体

将冷冻处理后的菌体置于37℃培养箱中溶解，使得菌体中的溶菌酶裂解菌体，超声波破碎1min，超声1s，间隔1s，直到菌体较为比较顺滑，不再粘稠，4℃，10000g离心10min，去除上清。利用洗涤溶液10mL(5％Triton X，1mM EDTA，50mM Tris pH8.0)洗涤包涵体，超声波破碎1min，超声1s，间隔1s，直到菌体完全溶解，37℃培养箱静置30min，4℃，10000g离心10min，去除上清。重复上述洗涤过程3次，用4.5mL蒸馏水溶解沉淀，得到重组蛋白HCE和LCE包涵体，于4℃保存包涵体。

(5)重组蛋白HCE或LCE的变性和复性，具体方法如下：

取1mL制备好的含重组蛋白HCE和LCE的包涵体于2mL离心管中，13000g离心5min，去掉上清，利用尿素溶液(8M尿素，0.1Mβ-巯基乙醇，50mM Tris pH8，1mM EDTA)至于37℃培养箱中溶解包涵体沉淀30min，13000g离心5min，取10μL上清通过ABS280检测蛋白浓度，将10mg蛋白跑SDS-PAGE检测目的条带的大小(参见图1，Lane 1，HCE；Lane 2，LCE)。如果为目的条带，则用8M尿素稀释上清，至终浓度为0.4mg/mL，于盐酸精氨酸溶液中(0.8ML(+)-Arginine Hydrochloride，50mM Tris pH8，0.6mM还原型谷胱甘肽，0.1mM氧化型谷胱甘肽，5μM ZnSO₄)4℃透析过夜(透析3次，每次不少于10倍体积的透析)，再转到25mM Tris pH8的溶液中透析4次(首次透析时加入5μM ZnSO₄)。透析完成后，用滤纸过滤掉沉淀，将上清液于-20℃保存，得到孵化酶HCE、LCE(孵化酶HCE的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，孵化酶LCE的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)。

(6)检测孵化酶活性

将制备好的孵化酶HCE、LCE分别加至1％酪蛋白溶液中(125μL 1％酪蛋白+250μL酶)，于30℃培养箱中消化30min，加入125μL的20％v/v高氯酸，立即置于冰上10min，13000g离心5min，检测ABS280。如果孵化酶的ABS280高于0.1，则说明具有蛋白酶活性，将孵化酶进行浓缩柱浓缩，使得酶活性ABS280高于0.1/10μL酶/30min。

(7)检测孵化酶的特异性底物(MCA多肽底物分析)

将步骤(5)制备的孵化酶HCE、LCE分别加至不同种多肽的底物中，多肽后面连接MCA，如果多肽被剪切后，MCA就能通过荧光系统检测出来。反应体系如下：MCA 0.5μL，1MTris pH8 2.5μL，enzyme 5μL，H₂O 42μL，于30℃反应30min后，加入20％v/v的醋酸100μL中止反应，检测荧光信号。结果发现线纹海马孵化酶HCE和LCE的底物比较类似(参见图2)，主要特异底物为：Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA、Suc-Ile-Ile-Trp-MCA、Boc-Val-Leu-Lys-MCA和Z-Leu-Leu-Glu-MCA。

(8)检测孵化酶消化受精卵膜的活性大小

将步骤(5)制备的孵化酶HCE，LCE和HCE+LCE(1:1v/v)各10μL加入到线纹海马的受精卵膜中，消化30min后，在显微镜下观察卵膜被消化的程度，并以未做任何处理的海马卵膜作为阴性对照。结果发现HCE单独处理组可以将海马的卵膜出现膨胀且部分降解，LCE单独处理组中海马的卵膜无明显变化，HCE和LCE共同处理时可以使得海马卵膜完全降解(参见图3)。由此可见，孵化酶HCE+LCE具有消化溶解海马胚胎卵膜的作用，介导海马的孵化过程。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 海马孵化酶基因及其编码蛋白和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 259

<212> PRT

<213> 线纹酶海马(Hippocampus erectus)

<400> 1

Met Ser Arg Phe Ala Ser Leu Leu Met Leu Leu Leu Leu Gly Leu Thr

1 5 10 15

Gln Ala Tyr Gln Asp Glu Phe Val Pro Glu Gln Glu Glu Glu Asp Gln

20 25 30

Ile Asp Ile Ser Asp Lys Ile Leu Thr Ala Asn Arg Gly Ser Asp Glu

35 40 45

Val Leu Val Glu Gly Asp Met Met Val Pro Lys Thr Arg Asn Ala Ile

50 55 60

Lys Cys Trp Ser Gln Ser Cys Leu Trp Lys Lys Ala Ala Asn Gly Tyr

65 70 75 80

Val Thr Val Pro Tyr Val Val Ser Arg Glu Phe Pro Glu Trp Glu Lys

85 90 95

Gln Met Ile Glu Thr Ala Met Arg Ser Phe Gln Glu Ser Thr Cys Ile

100 105 110

Arg Phe Val Ala Arg Ser Asp Glu Phe Asp Tyr Val Ser Val Glu Asn

115 120 125

Lys Ile Gly Cys Tyr Ser Ala Leu Gly Lys Gln Gly Gly Lys Gln Val

130 135 140

Val Ser Ile Asn Arg Gly Ser Cys Leu Tyr Asn Gly Ile Ile Gln His

145 150 155 160

Glu Leu Asn His Val Leu Gly Phe Gln His Glu Gln Asn Arg Ser Asp

165 170 175

Arg Asp Arg His Val Arg Ile Asn Trp Glu Asn Ile Asn Pro Ala Ala

180 185 190

Ala Leu Asn Phe Asn Lys Gln Asp Thr Asn Asn Leu Asn Thr Pro Tyr

195 200 205

Asp Tyr Thr Ser Ile Met His Tyr Gly Arg Thr Ala Phe Ser Ser Asn

210 215 220

Gly Lys Asp Thr Ile Thr Pro Ile Pro Asp Ala Ser Val Arg Ile Gly

225 230 235 240

His Arg Pro Gly Met Ser Lys Trp Asp Ile Thr Arg Ile Asn Met Leu

245 250 255

Tyr Ser Cys

<210> 2

<211> 269

<212> PRT

<213> 线纹酶海马(Hippocampus erectus)

<400> 2

Met Asp Phe Arg Thr Thr Val Phe Leu Leu Leu Leu Gln Leu Gly Thr

1 5 10 15

Phe Cys Tyr Ala Gly Pro Gly Trp Asp Pro Ala Val Asp Asn Asp Asn

20 25 30

Ser Gly Glu Pro Asp Lys Ser Ser Ile Thr Glu Thr Ile Leu Lys Met

35 40 45

Asn Asn Gly Ser Thr Ala Pro Leu Met Glu Gly Asp Leu Met Ile Glu

50 55 60

Arg Thr Arg Thr Ala Ile Lys Cys Ala Val Asn Ala Gln Ser Cys Leu

65 70 75 80

Trp Pro Lys Ser Ala Asn Gly Gln Val Leu Ile Pro Tyr Ile Ile Ala

85 90 95

Asn Gln Tyr Ser Ile Ser Glu Arg Asn Thr Ile Glu Gly Ala Leu Arg

100 105 110

Gly Ile Glu Ala Gly Thr Cys Ile Arg Phe Ile Arg Arg Gly Thr Gln

115 120 125

Lys Ala Tyr Leu Asn Phe Glu Pro Gly Phe Gly Cys Phe Ser Arg Leu

130 135 140

Gly Arg Arg Gly Gly Arg Gln Leu Val Ser Leu Gln Arg Phe Gly Cys

145 150 155 160

Val Gln His Gly Ile Val Gln His Glu Val Leu His Ala Leu Gly Phe

165 170 175

Tyr His Glu His Thr Arg Ser Asp Arg Asp Glu His Ile Leu Ile His

180 185 190

Trp Glu Asn Ile Gln Asp Val Asn Lys Pro Asn Phe Glu Glu Gln Asp

195 200 205

Thr Asp Asn Leu Asp Ile Pro Tyr Asp Tyr Asn Ser Ile Met His Tyr

210 215 220

Gly Arg Thr Ala Phe Gly Val Gln Gly Ala Ile Thr Met Thr Pro Ile

225 230 235 240

Pro Asp Gly Ser Val Glu Ile Gly Gln Lys Glu Gly Leu Ser Glu Ser

245 250 255

Asp Val Leu Arg Ile Asn Arg Leu Tyr Lys Cys Trp Asn

260 265

<210> 3

<211> 780

<212> DNA

<213> 线纹酶海马(Hippocampus erectus)

<400> 3

atgagtcgct tcgccagcct gctgatgctc ctcctgcttg gtctcactca ggcttaccag 60

gacgaattcg tcccagagca agaagaggaa gaccaaattg acatctccga caaaatcctg 120

accgccaaca ggggctcaga cgaggtcctc gtggaaggag atatgatggt tcccaaaacc 180

cggaatgcca ttaagtgctg gtcccagagc tgcttgtgga agaaagccgc caacggctat 240

gtgaccgtcc cgtacgtcgt gagccgtgaa ttccccgaat gggagaagca aatgatcgag 300

acggccatga ggtccttcca agagagcacc tgcatccgct tcgtggcccg gagcgacgag 360

ttcgactacg tcagcgtgga gaacaaaatc ggatgctact cggctctggg aaagcagggc 420

ggcaaacagg tggtgtccat caaccgtggc agctgcctct acaacggcat catccagcac 480

gagctcaacc acgttctggg cttccaacac gagcagaata ggagcgaccg tgaccgccac 540

gtcaggatca actgggagaa catcaacccg gcggcggcct tgaacttcaa taagcaagac 600

accaacaacc tgaacacccc gtacgactac acctccatca tgcactacgg aagaacggcc 660

ttcagcagta acgggaagga caccatcacc cccatccccg acgccagcgt ccggatcggc 720

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<210> 4

<211> 810

<212> DNA

<213> 线纹酶海马(Hippocampus erectus)

<400> 4

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cctgacggct cggttgaaat cggccaaaag gagggcctgt ccgaatcgga tgttcttcgg 780

atcaatcgtc tatacaagtg ttggaattag 810

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catatgaatg ccattaagtg ctggtcccag 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggatcctaac agctgtagag catgtttatc 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

catatgaccg ccatcaagtg cgcggtgaac 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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