钙蛋白酶-1在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的应用
阅读说明：本技术 钙蛋白酶-1在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的应用 (Application of calpain-1 in resisting porcine epidemic diarrhea virus infection ) 是由 李昱辰 杨倩 王秀羽 张恩 于 2021-09-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了钙蛋白酶-1(Calpain-1)及其抑制猪流行性腹泻病毒感染方面的应用,属于生物工程技术领域。本发明在发现猪小肠黏液总蛋白能抑制PEDV感染的基础上,从猪小肠黏液中鉴定并纯化得到一种能够抑制PEDV侵入宿主细胞的蛋白酶-1,该蛋白编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示,其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明进一步通过真核表达获得的猪源钙蛋白酶-1同样具有显著的抗病毒功能,其主要通过酶解PEDV刺突蛋白抑制PEDV入侵宿主细胞。本发明所述的钙蛋白酶-1还可以应用于抗PEDV感染药物或抗病毒饲料添加剂的制备。(The invention discloses Calpain-1 (Calpain-1) and application thereof in inhibiting porcine epidemic diarrhea virus infection, belonging to the technical field of biological engineering. According to the invention, on the basis that the total protein of the porcine small intestine mucus is found to inhibit PEDV infection, the protease-1 capable of inhibiting the PEDV from invading host cells is obtained by identification and purification from the porcine small intestine mucus, the nucleotide sequence of the protein coding gene is shown as a sequence table SEQ ID No.1, and the amino acid sequence is shown as a sequence table SEQ ID No. 2. The porcine-derived calpain-1 obtained through eukaryotic expression also has an obvious antiviral function, and the PEDV is inhibited from invading host cells mainly through enzymatic hydrolysis of PEDV spike protein. The calpain-1 can also be applied to the preparation of PEDV infection resisting medicines or antiviral feed additives.)
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及猪小肠黏液蛋白钙蛋白酶-1的应用，从猪小肠黏液中筛选、分离和鉴定获得钙蛋白酶-1能够显著抑制PEDV感染，钙蛋白酶-1抗病毒的机制在于其能够酶解PEDV S蛋白，抑制病毒入侵宿主细胞。
背景技术
肠道黏膜构成了机体与外界接触的最大界面，是许多病原微生物侵入并建立感染的重要部位。覆盖于肠上皮细胞表面的黏液层，对于维持猪小肠黏膜结构和功能的完整性具有重要作用。黏液主要经肠道分泌型细胞，如杯状细胞、潘氏细胞等分泌形成，其成分复杂，由水、黏蛋白、无机盐、抗菌肽以及一些小分子蛋白构成。除在消化过程中承担润滑剂的作用以外，黏液在抵抗病原微生物的感染中同样也发挥着重要的作用，例如小肠黏液中的黏蛋白2(Mucin 2，MUC2)能够形成粘稠的凝胶型网状结构，直接阻碍病原微生物接触肠上皮细胞。除发挥物理屏障功能之外，黏液中还存在有大量的生物活性成分，使其能直接灭活病原微生物，发挥主动防御功能。但受提取方法和分析手段的限制，目前人们对黏液中具有保护活性物质认识仍十分有限，如何从黏液中有效筛选并鉴定出具有抗病毒活性的成分，将为新型抗病毒药物或抗病毒饲料添加剂的制备提供有效手段。
猪肠道冠状病毒主要感染哺乳仔猪的小肠(特别是新生仔猪)，并引起严重的胃肠道症状，其中以猪流行性腹泻病毒(PEDV)的危害最大。研究表明极低含量的PEDV就能导致仔猪发病，其感染后能造成小肠绒毛的大量脱落和广泛坏死，最终引起新生仔猪的水样腹泻和脱水性死亡(死亡率高达100％)。目前，仍缺乏能为PEDV感染提供有效肠道黏膜保护力的免疫策略，预防和控制PEDV的发生已成为世界上研究难题。在此情况下，通过加固仔猪肠道黏膜屏障，直接阻断病毒经黏膜入侵，对于预防和控制PEDV的发生具有重要的意义。作为肠道黏膜免疫的第一道防线，猪小肠黏液屏障在抵抗PEDV感染中的潜在作用值得进一步探究。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种从猪小肠黏液中纯化获得，具有抵抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染功能的黏液蛋白-钙蛋白酶-1。
本发明还要解决的技术问题是提供了表达盒、重组载体或细胞系，其含有所述的核酸或基因。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种重组蛋白表达细胞系。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种重组钙蛋白酶-1及其制备方法和应用。
本发明最后要解决的技术问题是提供了猪钙蛋白酶-1、核酸或基因、表达盒、重组载体或细胞系，重组钙蛋白酶-1在制备预防或治疗猪流行性腹泻病毒相关疾病的药物或饲料添加剂中的应用。
技术方案：本发明内容包括一种钙蛋白酶-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明内容还包括核酸或基因，其编码所述的钙蛋白酶-1，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
本发明内容还包括表达盒、重组载体或细胞系，其含有所述的核酸或基因。
其中，所述的重组载体，所述重组载体是将所述的核酸或基因插入到真核表达载体中得到含有猪钙蛋白酶-1的基因的表达载体。其中，所述真核表达载体包括但不仅限于pCDNA3.4。
本发明内容还包括一种重组蛋白表达细胞系，所述细胞系是通过将所述的重组载体转入宿主细胞后获得。所述细胞系包括但不仅限于哺乳动物细胞。
本发明内容还包括一种重组钙蛋白酶-1，所述重组钙蛋白酶-1是通过将所述的表达载体转入细胞后表达、纯化获得。
其中，所述的猪钙蛋白酶-1、所述的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体或细胞系在生产重组钙蛋白酶-1中的应用。
本发明内容还包括一种重组钙蛋白酶-1的制备方法，包括以下步骤：
1)编码钙蛋白酶-1的基因的获得；
2)将编码钙蛋白酶-1的基因导入载体中获得表达载体；
3)将表达载体转染细胞后进行纯化即得。
本发明内容还包括所述的猪钙蛋白酶-1、所述的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体或细胞系，所述的细胞系，所述的重组钙蛋白酶-1在制备预防或治疗猪流行性腹泻病毒相关疾病的药物或饲料添加剂中的应用。
其中，所述应用通过裂解PEDV S1蛋白而实现。
有益效果：本发明首次通过分离纯化获得了猪钙蛋白酶-1，并进一步获得了该酶的核苷酸及氨基酸序列，通过实验研究发现，猪钙蛋白酶-1具有较高的活性，而且进一步进行重组钙蛋白酶-1的制备以及应用。本发明的重组钙蛋白酶-1具备较高的活性和显著的抗PEDV病毒的功能，以及具有高裂解PEDV S1蛋白的活性。
附图说明
图1为小肠黏液总蛋白对PEDV感染的影响；(A)猪小肠黏液收集示意图；(B)CCK8试验测定黏液总蛋白的细胞毒性测定；(C)噬斑中和试验检测不同浓度小肠黏液总蛋白的抗病毒作用；(D-F)排查黏液总蛋白抵抗PEDV感染的具体阶段；(E)空斑形成试验检测培养各组上清中的病毒滴度；(F)RT-qPCR检测PEDV基因表达水平。
图2为小肠黏液总蛋白中具有抗病毒活性蛋白的筛选鉴定。(A)用非变性胶分离小肠黏液蛋白；采用Amicon超离过滤装置(截断量：100kDa)，将小肠黏液中小于100kDa的蛋白通过非变性PAGE分离，收集为4个组分(I-IV)；(B)空斑抑制试验测定各蛋白组分的抗病毒活性；(C)排查蛋白组分III抑制PEDV感染的具体阶段；(D)测定蛋白组分III处理后培养上清中(D)和细胞内(E)病毒含量，图中数字与图(C)中各组编号对应。
图3为钙蛋白酶-1介导黏液蛋白组分III的抗病毒作用。(A)通过SEC-150凝胶过滤柱收集黏液蛋白组分III的主峰，其分子量在70KD左右；(B-D)纯化蛋白组分III以一定的浓度梯度与PEDV孵育1h后，将混合物接种于Vero E6细胞。培养1h后，洗去混合溶液，空斑抑制试验测定蛋白组分III的抗病毒活性(C)或继续用维持培养基培养24h，为检测PEDV感染情况，通过Western blot(B)(一抗：PEDV-N蛋白单克隆抗体；二抗：HRP-标记山羊抗鼠抗体)和RT-qPCR检测病毒蛋白和mRNA表达量(D)；(E)采用LC-MS/MS法测定纯化的蛋白组分III的氨基酸信息。根据它们的肽段信息在气泡图上显示匹配的蛋白。以蛋白质分子量为X轴，蛋白质覆盖率为Y轴，颜色代表打分值；(F-H)用钙蛋白酶-1抑制剂处理收集的纯化蛋白组分III后，空斑试验(H)和RT-qPCR(G)检测蛋白组分III的抗病毒作用；(I)SDS-PAGE分析亲和层析法从小肠黏液总蛋白中纯化的钙蛋白酶-1。(J-L)验证纯化的钙蛋白酶-1的抗病毒活性。用(I)中纯化的蛋白预处理PEDV 1h后接种于Vero E6细胞，恒温培养箱中孵育24h后，检测细胞中PEDV的蛋白(一抗：PEDV-N蛋白单克隆抗体；二抗：HRP-标记山羊抗鼠抗体)(L)与mRNA(J)表达水平，并测定培养上清液中的病毒滴度(K)。
图4为PEDV刺突蛋白(S)钙蛋白酶-1水解位点及相互作用位点预测。(A)PEDV经典株和变异株的spike(S)蛋白上钙蛋白酶-1切割位点的生物信息学预测，该裂解位点基于其氨基酸序列。柱状图中还显示了在不同毒株上测定的裂解得分值(高于默认的最大临界值0.654)；(B)利用ZDOCK算法预测了PEDV CV777 S蛋白与钙蛋白酶-1的结合构象。PEDVCV777 S蛋白由三个同源的亚基组成。Calpain-1与S1蛋白a、b、c结构域的详细结合作用分别如图(a)、(b)和(c)所示，绿色图为PEDV CV777的S1蛋白，紫色图为calpain-1，氢键相互作用用红色虚线表示。
图5为钙蛋白酶-1水解PEDV S1蛋白功能验证。(A-B)采用表面等离子体共振(SPR)验证钙蛋白酶-1与PEDV CV777和PEDV OH851 S1的相互作用；(C)将钙蛋白酶-1以1∶1和1∶100的比例，与PEDV经典毒株CV777和变异毒株OH851和AJ1102共孵育。通过Western blot检测钙蛋白酶-1对PEDV S1蛋白的裂解作用，以同样比例加入的BSA作为阴性对照；(D)钙离子浓度对钙蛋白酶-1裂解PEDV S1蛋白的影响，(E)孵育温度对钙蛋白酶-1裂解PEDV S1蛋白的影响；(F)透射电镜观察钙蛋白酶-1处理对PEDV冠状结构的影响；(比例尺＝100nm)。
图6为真核表达猪钙蛋白酶-1及其抗病毒活性检测。(A)真核表达质粒的构建及其鉴定。真核表达钙蛋白酶-1质粒转化至Top10，挑取阳性菌落PCR验证结果。(B-C)细胞沉淀用20mM PBS pH7.40破碎后，离心过Ni柱纯化，咪唑洗脱蛋白后分别进行SDS-PAGE电泳(B)和Western blot(一抗：抗猪钙蛋白酶-1多克隆抗体；二抗：HRP-标记山羊抗兔抗体)(C)验证纯化结果。(D)检测真核表达钙蛋白酶-1的裂解作用。浓度梯度的真核表达钙蛋白酶-1与PEDV S1蛋白37℃孵育1小时。用Western blot检测不同处理组的S1蛋白表达水平，以BSA作为阴性对照；(E-G)检测真核表达的钙蛋白酶-1的抗病毒作用。培养上清和细胞样品在24hpi下收集，空斑形成试验检测培养上清中的病毒滴度，并在柱状图中显示汇总结果(E)。(F)用Western blot检测PEDV N蛋白的表达(一抗：PEDV-N蛋白单克隆抗体；二抗：HRP-标记山羊抗鼠抗体)。(G)采用RT-qPCR对PEDV RNA基因进行定量。(H)真核表达的钙蛋白酶-1活性测定。
具体实施方式
现在详细地参照本发明的代表性实施方案描述本发明。这些实施方案仅仅是例示性的，不应理解为以任何方式限制本发明的范围。相反地，本发明意图涵盖权利要求书所限定的在本发明范围内的所有替代、修改和等同。
除非另外指明，本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。
下面通过具体的实施例和附图对本发明进一步说明。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。具体涉及的材料和试剂如下：
材料：Vero E6细胞(本实验室保存，是PEDV易感细胞)；新生仔猪的空肠，断奶仔猪的空肠；260日龄育肥猪的空肠黏液。
试剂：DMEM培养基(WISENT公司)；胎牛血清(gibco公司)；0.25％胰酶(碧云天生物技术有限公司)；RIPA强裂解液(Thermo Fisher Scientific)；Trizol(宝日医生物技术北京有限公司)；氯仿(深圳三品科技公司)；DEPC水(武汉市盖云天生物技术有限公司)；无水乙醇(深圳三品科技公司)；反转录试剂包(诺唯赞生物有限公司)；荧光定量试剂盒(诺唯赞生物有限公司)；10％蛋白预制胶(雅酶生物有限公司)；5×SDS-PAGE(武汉市盖云天生物技术有限公司)；L.M.P低熔点琼脂糖胶(Thermo Fisher Scientific公司)；4×非变性蛋白上样缓冲液(上海翊圣公司)；PEDV-N蛋白单克隆抗体(Medgene Labs公司)；抗猪钙蛋白酶-1多克隆抗体(英国Abbexa公司)；抗Trx-tag单克隆抗体(苏州百远生物科技有限公司)；HRP-标记的GAPDH(上海翊圣公司)；HRP-标记山羊抗兔(上海翊圣生物有限公司)；HRP-标记山羊抗鼠(上海翊圣生物有限公司)；猪钙蛋白酶-1蛋白(美国Abcam公司)；Calpain-1特异性抑制剂calpeptin(美国Selleck Chemicals公司)；猪胃Muc2(美国SIGMA公司)。
实施例1 猪小肠黏液的提取以及抗病毒效果的评价
1.1猪小肠黏液的制备
260日龄育肥猪在宰杀之前禁食3h，通过静脉注射戊巴比妥钠(100mg/kg)采取安乐死。当猪的角膜反射消失，呼吸停止，心脏停止跳动时，可以确认猪的死亡。随后，立即剖杀，取样。小肠黏液的收集根据之前的研究报道进行，并做了适当的调整，具体步骤如下：首先，剪取长约10cm左右的小肠，将小肠外翻后套在玻璃柱上，充分拉伸铺平后置于冰上预冷的玻璃培养皿中；随后，加入5ml预冷的PBS(含1％蛋白酶抑制剂Cocktail)，一分钟之后轻轻刮取黏液，注意尽量不破坏肠黏膜上皮，刮取黏液后，立即再补充5ml预冷的PBS(含1％蛋白酶抑制剂Cocktail)；最后，收集刮取的黏液，于8,000rpm低温离心30min以去除肠道中的食物残渣和粪便，用移液器吸取上清液，使用0.45μm滤器(Millipore Millicup)过滤后获得猪小肠黏液，将收集到的黏液样品置于-70℃冰箱冻存备用(图1A)。
1.2猪小肠黏液总蛋白的提取
猪小肠黏液12,000rpm低温离心15min以去除沉淀，得到上清后根据体积在室温条件(25℃)下加硫酸铵至45％浓度，添加过程先快后慢且伴随缓慢搅拌，待全部添加完毕后，缓慢搅拌30min，然后静置过夜。次日离心，沉淀用20mM PBS(PH 7.40)复溶，复溶后离心得上清，用20mM PBS(PH 7.40)透析，除去其中的硫酸铵。用BCA试剂盒(Biosharp BL521A)测所得黏液蛋白浓度。
1.3猪小肠黏液总蛋白的细胞毒性试验
提取的猪小肠黏液总蛋白用BCA试剂盒测浓度后，运用CCK8试验对不同浓度(0、0.1、1、10、100、1000μg/mL)的黏液总蛋白进行细胞毒性的检测，具体步骤如下：
1)将PEDV易感细胞Vero E6以每孔大约1×104的细胞量接种96孔细胞培养板。并于恒温培养箱中培养至细胞长到80％以上；
2)向96孔细胞板中加入10μL不同浓度的猪小肠黏液总蛋白(0、0.1、1、10、100、1000μg/mL)，将培养板在恒温培养箱(37℃，5％CO2)中培养12h；
3)向每孔加入10μL CCK8溶液(在加的过程中注意不要生成气泡，否则会影响最终结果)，将96孔培养板在恒温培养箱中孵育2h；用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
4)结果如图1B所示，与空白对照组相比，最高浓度(10mg/mL)的黏液总蛋白可造成部分细胞病变，细胞病变率在60％左右。而其他几个浓度，与空白对照组相比均未出现明显的病理变化。因此，试验选取0.1、1、10、100、1000μg/mL五个浓度进行接下来的抗病毒试验。
1.4猪小肠黏液总蛋白的抗病毒效果的评价
将猪小肠黏液总蛋白以及BSA对照(0.1、1、10、100、1000μg/mL)，在感染前与等体积的103PFU的PEDV充分混合(37℃，1小时)，将病毒与小肠黏液总蛋白的混合物加入到12孔细胞培养板中，然后将培养板在恒温培养箱(37℃，5％CO2)中孵育1h；洗掉未黏附的混合物后，加入0.8％的琼脂糖低熔点胶(DMEM稀释)。待琼脂糖凝胶凝固后，置于恒温培养箱中培养72h，在12孔细胞培养板中加入4％的多聚甲醛，固定1h，弃掉多聚甲醛和琼脂糖凝胶，加入适量的0.5％的结晶紫染色2h，结果显示黏液总蛋白表现出明显的抗病毒效果(图1C)；而且10μg/mL的黏液总蛋白其对病毒的抑制效果可达到90％以上。表明猪小肠黏液总蛋白与PEDV孵育能够显著抑制PEDV在细胞中的感染。
1.5猪小肠黏液蛋白的抗病毒阶段和作用方式排查
为初步摸查猪小肠黏液抗PEDV作用的具体作用阶段和具体方式，选择1mg/mL的猪小肠黏液蛋白进行以下试验：
将猪小肠黏液蛋白以及BSA对照，在感染前加入细胞或病毒，或4℃吸附过程、病毒入侵过程(37℃，1小时)、病毒复制过程(1～24hpi)，在感染后24小时收集样品(图1D)，检测细胞中病毒RNA(图1E)水平，并检测培养基上清中感染性颗粒(图1F)，结果显示黏液蛋白与PEDV在37℃提前孵育1h后或者在黏液蛋白存在于所有阶段的情况下，小肠黏液蛋白能够显著抑制PEDV在细胞中的复制和子代病毒的产生；而在病毒复制阶段加入黏液，其对病毒感染的抑制效果消失。
实施例2 猪小肠黏液中各组分蛋白的抗病毒活性的鉴定
2.1猪小肠黏液中各蛋白组分的分离
将实施例1中制备的猪小肠黏液总蛋白(10mg/mL)加入Amicon Ultra 100kDa超滤管，通过离心将黏液总蛋白分为高分子量蛋白(HMWPs)和低分子量蛋白(LMWPs)，对获得的HMWPs和LMWPs进行以下处理：1)使用Protein A/G亲和柱去除HMWPs中的免疫球蛋白，以排除免疫球蛋白对后续抗病毒效果检测的干扰；2)通过非变性胶分离将LMWPs分为分成4个蛋白质组分(I-IV)，切胶回收各蛋白组分后使用电洗脱法进行纯化和收集(图2A)。
2.2猪小肠黏液中各蛋白组分抗病毒效果的检测
通过空斑抑制试验初步检测黏液低分子量蛋白(LMWPs)中各蛋白组分的抗病毒效果(图2B)，结果可见LMWPs组分III具有显著的抗病毒效果。进一步探究了LMWPs组分III的抗病毒阶段(图2C)：将LMWPs蛋白组分III以及BSA对照，分别于PEDV的入侵(1)和复制阶段(2)加入，24h后收集细胞和上清样品；同时在接种病毒前将黏液蛋白组分III以及BSA对照分别与PEDV(104PFU)37℃孵育1h(3)，孵育完成后将混合物接种Vero E6细胞孵育1h，用空白DMEM培养基洗去未结合的病毒和残留的蛋白，加入维持培养基(含2％FBS的DMEM)培养至24小时收集细胞和上清样品。如图2D-E可见黏液蛋白组分III与PEDV孵育后能显著抑制PEDV对Vero E6细胞的感染，胞内病毒的蛋白水平显著降低，同时子代病毒的产生也受到明显抑制，而在其他阶段添加蛋白组分III对PEDV感染并没有明显影响。
实施例3 猪小肠黏液LMWPs组分III中具有抗病毒活性蛋白的鉴定
使用分子筛(SEC，Zenix SEC-150)分析并纯化LMWPs组分III中的蛋白，在第8.313s检测到蛋白吸收主峰，约占蛋白质组分III总面积的74.79％(图3A)。收集主峰蛋白后，经SDS-PAGE电泳后发现其蛋白分子量在70kD左右，进一步对收集蛋白的抗病毒活性进行验证。纯化蛋白组分III以一定的浓度梯度(1，10，50，100μg/mL)与等体积PEDV(104PFU)孵育1h，将混合物接种于Vero E6细胞。培养1h后，洗去混合溶液，空斑抑制试验测定蛋白组分III的抗病毒活性，由图3C结果显示收集蛋白能显著抑制PEDV对Vero E6细胞的感染，该作用具有明显的剂量依赖性，在浓度为100ug/mL时，能使PEDV感染水平下降70％。同时，重复对Vero E6细胞的上述处理后，继续用维持培养基培养24h后，弃掉培养板中的液体。每孔加入200μL的含有1％PMSF的RIPA强裂解液，吹吸混匀；将含有细胞样品的RIPA裂解液转移到1.5mL离心管，加入5×SDS Loading Buffer，煮沸变性样品，随后进行凝胶电泳；切取对应凝胶，湿转蛋白条带至活化的PVDF膜；5％脱脂奶常温封闭2h；TBST洗去残留的脱脂奶，加PEDVN蛋白单克隆抗体或HPR-GAPDH抗体，4℃孵育过夜；TBST洗去残留的抗体，加HRP-标记的山羊抗鼠IgG常温孵育2h；ECL超敏发光液显色、曝光(按说明书配制)图3B显示病毒蛋白表达水平明显降低。同样图3D显示出PEDV的mRNA的表达水平与上述结果一致，证明收集的蛋白具有显著的抗病毒效果。为了鉴定出主峰蛋白中具有抗病毒活性的具体成分，通过液相色谱串联质谱分析主峰蛋白。基于UniProt-数据库共识别了142种蛋白质的873个肽段。根据肽段覆盖率，蛋白质匹配度以及蛋白分子量，将排名靠前的10种蛋白以气泡图展示(图3E)。通过不同蛋白抑制剂筛选验证，特异性猪钙蛋白酶-1抑制剂calpeptin(25μM，50μM)处理后蛋白组分III后(图3F)，将混合物与PEDV等体积孵育1h后接种于Vero E6细胞。空斑试验(3H)和RT-qPCR(3G)检测蛋白组分III的抗病毒作用(检测步骤同3D与3F)。由此得出钙蛋白酶-1可能是猪小肠黏液中蛋白组分III中发挥抗病毒功能的主要成分。
实施例4 猪小肠黏液中钙蛋白酶-1的分离、纯化以及抗病毒活性验证
4.1亲和纯化猪小肠黏液中的钙蛋白酶-1并检测其抗病毒效果
使用NHS活化介质(NHS-activated QZT 4FF)耦连抗猪钙蛋白酶-1多克隆抗体，制得亲和介质保存于4℃、20％乙醇溶液中备用。首先制备猪小肠黏液总蛋白中LMWPs组分III(实施例2和3)，其次使用制备的亲和介质通过亲和层析的方法从LMWPs组分III中纯化获得猪钙蛋白酶-1，如图3I所示，目的蛋白分子量为70KDa，大部分被0.1M甘氨酸(pH＝2)洗脱。将纯化获得的猪钙蛋白酶-1与病毒孵育后，检测病毒的感染能力(同实施例2的步骤2.2)，如图3J-L所示，纯化获得的猪钙蛋白酶-1处理能显著抑制病毒对Vero E6细胞的感染(蛋白和基因水平)以及上清中病毒颗粒的释放。此外，相比于LMWPs组分III，纯化获得的钙蛋白酶-1具有更强的抗病毒活性。
实施例5 猪钙蛋白酶-1抑制PEDV感染的机制
5.1 PEDV S蛋白上钙蛋白酶-1裂解位点的预测
PEDV进入细胞是由刺突蛋白(Spike S)介导的，它的三聚体结构介导病毒与靶细胞的黏附和随后的膜融合。钙蛋白酶-1只在病毒入侵阶段发挥抗病毒效果，其可能是通过影响病毒的S蛋白结构的稳定性，阻止病毒与受体的结合，进而影响病毒入侵过程中的膜融合。基于钙蛋白酶-1的属性和底物特征，我们使用GPS-CCD软件((http：//ccd.biocuckoo.org/))和GraphPad Prism 7.0以条形图的方式显示每个裂解位置的分数。由图4A可得，PEDV S蛋白的S1和S2区域均有钙蛋白酶-1的裂解位点分布。
为了进一步确钙蛋白酶-1在PEDV S蛋白上的作用位点，我们从不同的PEDV毒株中挑选了最具代表性的流行毒株(PEDV CV777)，将购买的猪钙蛋白酶-1蛋白(1.9mg/mL)(美国Abcam公司)与PEDV S蛋白进行分子对接，通过蛋白-蛋白分子对接及构象筛选，得到钙蛋白酶-1和PEDV CV777的最优结合构象(图4B)。钙蛋白酶-1的活性位点区域与PEDV CV777的S1蛋白结合，ZDock Score为29.98。PEDV CV777 S1蛋白由三个β-片状结构域组成(图4B)，分别记为a，b，c；进一步对钙蛋白酶-1的活性位点与PEDV CV777 S1蛋白结合分析。钙蛋白酶-1主要通过静电作用与S1蛋白结合。在a结构域上，Y205与钙蛋白酶-1的Y387形成π-π相互作用。T69、D97、S99、Y101、K183与钙蛋白酶-1的R473、R414、K229、E226形成氢键。F96与钙蛋白酶-1的R488形成π-阳离子相互作用。钙蛋白酶-1的活性位点主要与S1蛋白的b结构域结合。在b域，Y382、E329、T376-S379、A336、L416、N297、H298、K399、N442与钙蛋白酶-1的L258、V257、E302、K270、Q109、A204、K79、K71形成氢键。Y377与钙蛋白酶-1的H272形成π-π相互作用。在c域上，T555、Y552、Q565和P629与钙蛋白酶-1的Q182、D172和K86形成氢键。H492和D578与钙蛋白酶-1的N76和Y81形成极性相互作用。综上可得，钙蛋白酶-1的活性位点主要与PEDV的S1蛋白相结合从而引起之后的裂解作用。
5.2猪钙蛋白酶-1对PEDV S1蛋白的裂解
表面等离子体共振(SPR)技术进一步检测猪钙蛋白酶-1蛋白(美国Abcam公司)与PEDV S1蛋白的结合。原核表达分别制备了PEDV OH851(NO.KJ399978)和PEDV CV777(NO.KT3239979)的S1重组蛋白并用于后续实验。首先由南京擎科生物公司合成PEDV OH851和PEDV CV777的S1基因片段后(S1的基因序列参见SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示)，经琼脂糖凝胶电泳后回收，使用限制性内切酶EcoRI和SalI双酶切片段后，通过T4连接酶与线性化的pET-32a载体相连。将连接产物转化到BL21感受态细菌中。通过菌落PCR获得阳性点摇菌测序正确(测序均由南京擎科生物公司完成)后用IPTG诱导重组PEDV OH851 S1蛋白和PEDV CV777 S1蛋白的表达，离心收集菌体后进行超声破碎。收集的液体过Ni柱纯化提取得到重组PEDV OH851 S1蛋白和PEDV CV777 S1蛋白。通过BCA法测定蛋白浓度，纯化后得到的蛋白浓度为PEDV OH851 S1：1.3mg/ml，PEDV CV777 S1：1.0mg/ml。
猪钙蛋白酶-1与PEDV S1蛋白实时相互作用的动态传感图如图5A-B所示，描述了蛋白结合和解离的整个动态过程。SPR动力学分析表明，钙蛋白酶-1与PEDV CV777 S1蛋白具有亲和性，其平衡解离常数(KD)为1.074-6M。此外，钙蛋白酶-1与PEDV变异毒株OH851 S1蛋白相互作用的亲和力较高，KD值为7.872-7M。
为了再次确认PEDV S1蛋白是猪钙蛋白酶-1的底物，我们通过商品化猪钙蛋白酶-1分别与PEDV OH851 S1、PEDV AJ1102 S1和PEDV CV777 S1蛋白以1∶1；1∶100的比例孵育(BSA组作为阴性对照)进行裂解试验。结果表明，钙蛋白酶-1处理后三种PEDVS1蛋白水平(一抗：抗Trx-tag单克隆抗；体二抗：HRP-标记山羊抗鼠抗体)均显著降低，并存在剂量依赖(图5C)。钙蛋白酶-1对PEDV S1蛋白的裂解作用与钙离子浓度也有关(图5D)。值得注意的是，钙蛋白酶-1即使在4℃也保持水解活性，而在高温下(100℃)则失去了活性(图5E)。通过透射电镜观察钙蛋白酶-1处理PEDV后其冠状结构的变化，为钙蛋白酶-1的裂解作用提供更多的证据(图5F)。BSA处理后不影响其形态结构，S蛋白在病毒表面有序排列。然而，钙蛋白酶-1处理后则导致病毒颗粒表面S蛋白明显脱落，尤其是在较高的钙蛋白酶-1浓度时。这进一步说明了钙蛋白酶-1通过结合并水解S1蛋白，影响病毒S蛋白结构完整性
实施例6 钙蛋白酶-1的真核表达及抗病毒活性的鉴定
6.1真核表达质粒的构建及其鉴定
为了研究PEDV与钙蛋白酶-1的关系，我们对猪钙蛋白酶-1进行了真核表达与纯化。根据GenBank中calpain-1基因序列基因全合成猪calpain-1，基因序列见表1。自主设计特异性引物P1和P2进行PCR扩增，
P1：5‘-ATAGGATCCCTGGGACGACATGAGAAC-3’，
P2：5‘-GTGCTCGAGTTATGCGAACATAGTGAGCTGG-3’。
扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳并在紫外灯下快速割取含目的片段的凝胶，按DNA凝胶回收试剂盒说明书操作回收，得到目的基因calpain-1。合成与测序均由南京擎科生物公司完成。
将扩增的calpain-1插入真核表达载体pcDNA 3.4的多克隆位点。用HindIII和XhoI限制性内切酶对质粒进行酶切，胶回收目的片段和真核表达载体片段后，于16℃过夜连接，连接产物转入TOP10感受态细胞。将转化菌Top10接种于50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养12h。挑选单个菌落，接种于含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h。按质粒小量抽提试剂盒提取质粒DNA，并进行BamHI和XhoI双酶切分析和PCR鉴定(图6A)，挑取PCR鉴定正确的阳性克隆送南京擎科生物科技有限公司测序，测序后将连接方式及碱基序列100％正确的质粒命名为pcDNA 3.4-calpain-1(HOCA质粒)。
6.2 293F细胞培养及转染
在37℃，5％CO2恒温培养箱中，用DMEM培养基+10％胎牛血清(FBS)的培养基培养293T细胞，待细胞融合度达到70％-90％且生长状态正常时可进行质粒转染；转染前使用Endo-ffee Plasmid Mini Kit II试剂盒提取去内毒素HOCA质粒，使用3000 Transfection Kit试剂盒将2μg去内毒素质粒HOCA转染至293F细胞中，具体操作按试剂盒说明书进行；转染后孵育2h，加入培养基，置于37℃恒温细胞培养箱中培养。
6.3猪钙蛋白酶-1的纯化及验证
转染48h后，收取上清进行Western blot验证诱导表达的上清中有钙蛋白酶-1，证明诱导表达成功，然后进行纯化。
预先制备四种缓冲液，分别为：平衡缓冲液：20mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH8.0；预洗缓冲液：20mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH8.0；洗脱缓冲液1：20mM Tris-HCl，300mMNaCl，20mM Imi(咪唑)，pH8.0；洗脱缓冲液2：20mM Tris-HCl，300mM NaCl，80mM Imi(咪唑)，pH8.0；洗脱缓冲液3：20mM Tris-HCl，300mM NaCl，500mM Imi(咪唑)，pH8.0；透析缓冲液：20mM Tris-HCl，pH8.0。
HOCA质粒转染293F细胞12h后，用空白DMEM培养基继续培养48h后，收集细胞培养液。细胞上清透析过夜后离心，留取上清，过Ni柱纯化。细胞沉淀用20mM PBS pH7.40破碎后，离心过Ni柱纯化。根据Ni-NTA Spin Kit说明书，将两种上清分别与预先平衡好的Ni-NTA于4℃旋转孵育3h。用洗脱缓冲液2洗涤，收集沉淀，之后与洗脱缓冲液3洗脱目的蛋白。离心，将上清放入透析袋，透析8h。最后透析袋中蛋白溶液为纯化的目的蛋白。用SDS-PAGE电泳和Western blot进一步鉴定纯化的蛋白(图6B-C)。
6.4猪钙蛋白酶-1活性的检测
根据制造商的说明，使用商用钙蛋白酶活性荧光测定试剂盒(Biovision，Mountain View，California)对表达的猪钙蛋白酶-1活性进行测定。将表达的钙蛋白酶-1稀释到85μL缓冲液中，在85μL缓冲液中加入1～2μL活性钙蛋白酶-1作为阳性对照。阴性对照为添加1μL钙蛋白酶抑制剂的钙蛋白酶-1缓冲液。加入10μL的10X反应缓冲液和5μL的钙蛋白酶底物，避光孵育1小时后将体系转移至96孔板中，在装有400nm激发滤光片和505nm发射滤光片的荧光仪中读取样品荧光值。由图6H比较样品和阴性对照的结果，样品平均荧光值为21544.3，阴性对照荧光值为273，阳性对照荧光值为50784，可以确定原核表达的钙蛋白酶-1具有较高的活性。
6.5纯化的猪钙蛋白酶-1抗病毒活性的鉴定
为了验证纯化的猪钙蛋白酶-1在体外是否具有裂解PEDV S1蛋白的活性，将真核表达的猪钙蛋白酶-1与PEDV OH851 S1，PEDVAJ1102 S1或PEDV CV777 S1以1∶1的比例于37℃孵育1h(BSA组作为阴性对照)，使用抗Trx-tag抗体，我们通过比较图6C的Western blot结果研究了所产生的片段，当使用100μg/mL真核表达的钙蛋白酶-1处理后PEDV S1蛋白被抑制40％。这表明真核表达的猪钙蛋白酶-1具有裂解PEDV S1蛋白的活性。
为了验证真核表达的猪钙蛋白酶-1对PEDV感染的抑制作用。将BSA(阴性对照)，真核表达的猪钙蛋白酶-1(1，10，100μg/mL)与分别与等体积PEDV(103PFU)37℃孵育1h，孵育完成后将混合物接种Vero E6细胞孵育1h，用空白DMEM培养基洗去未结合的病毒和残留的蛋白，加入维持培养基(含2％FBS的DMEM)培养至24小时收集细胞和上清样品。如图6E-G可见，与对照组相比，真核表达的猪钙蛋白酶-1与PEDV孵育后能显著抑制PEDV对Vero E6细胞的感染，胞内病毒的蛋白和mRNA水平均显著降低，同时子代病毒的产生也受到明显抑制。这些数据表明真核表达的猪钙蛋白酶-1具有抑制PEDV感染的活性。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 钙蛋白酶-1在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2181
<212> DNA
<213> 钙蛋白酶-1(Calpain-1)
<400> 1
aagcttgcca ccatggcaga agaagttatt acccccgttt attgcacagg cgtttcagcc 60
caagttcaga agctcagagc taaagagctg ggactgggac gacatgagaa cgccattaag 120
tacttgggcc aggactatga acaactcaga gctcactgtc tccagtctgg ctcactgttt 180
cgcgatgagg cttttccacc cgtgcctcag agtctcgggt ttaaggagct gggccccaat 240
tccagcaaaa catacggggt gaagtggaag cggccgactg aactcttctc taacccccag 300
ttcatcgtcg atggggccac aaggacagat atttgtcagg gcgctctcgg agactgttgg 360
ctgctcgcag ccatcgctag tctgacactg aacgacactc tgctgcaccg cgtggtgcca 420
catggacagt cattccagaa tgggtacgct ggcattttcc acttccagct ctggcagttc 480
ggggagtggg tggatgtagt tgttgacgac ttgctgccaa caaaggacgg caagctggta 540
ttcgtgcaca gcgcacaggg caatgagttc tggtccgccc tgctggaaaa ggcatacgcc 600
aaagtgaatg gctcatacga agctctgtct ggcggttcca caagtgaagg ttttgaggat 660
tttacgggag gagtgacaga gtggtacgaa ctccgaaaag caccttccga cctgtatagc 720
atcatcctga aggcacttga gcgaggcagc ttgctggggt gcagcattga catcagcagc 780
gtgctcgaca tggaggctgt gactttcaag aagctcgtaa agggacatgc ttactccgtg 840
accggggcca aacaagtcaa ttatcagggc cagatggtga acctcatcag aatgcgaaac 900
ccctggggtg aggtggagtg gacaggcgcc tggtctgatg gctcttccga gtggaatggg 960
gtggacccct accagcgcga ccaactgcgg gtgaggatgg aagacgggga gttttggatg 1020
tcattcagag actttctgcg cgagttcaca agacttgaga tctgcaacct cacacccgac 1080
gctctgaaaa gtcagcgcgt gcgcaattgg aacaccacgc tgtatgaagg gacatggagg 1140
cgggggagca cagcaggagg gtgtaggaat tatcccgcta ccttttgggt caatccgcaa 1200
ttcaagatca ggctggagga aacggatgac ccagaggatg attatggtgg cagagagagt 1260
ggatgctcct ttgttcttgc actcatgcag aagcatcggc ggagggaaag acggttcggc 1320
agggatatgg agacgatcgg cttcgccgtc tacgaagtcc cacctgagct cgtgggtcag 1380
ccagtgcacc tcaagcggga cttcttcttg gcaaacgcga gtcgggccag gtcagaacag 1440
tttatcaacc ttcgcgaagt gtccactagg tttcgcctgc ctcccggaga atacgtggtg 1500
gttccgtcaa catttgagcc gaacaaagaa ggcgatttcg ttctgcgatt tttcagtgag 1560
aaaaaggcgg gcactcagga gcttgatgat caggtccagg ctatcctccc ggacgaacag 1620
gtgctgtcag aggaggagat tgacgagaac ttcaaagcac tcttccggca gctggcaggg 1680
gaagatatgg agatctcagt acgagagctg cggaccatat tgaatcgaat aatatcaaag 1740
cataaggacc tgaggacaaa ggggtttagc ttggaaagtt gcaggagcat ggtgaatctg 1800
atggacagag atggcaacgg aaaattggga ctggtggaat ttaacatact gtggaatcgc 1860
atccgaaact acttgtcaat ctttagaaaa tttgacctgg acaagtcagg cagcatgtcc 1920
gcatacgaaa tgagaatggc catcgagtca gctgggttta agctgaataa gaaactgttc 1980
gaactgatca ttacaaggta ttctgagcct gatctggccg tcgatttcga taattttgtg 2040
tgttgtctcg tgcggctgga aacaatgttc agatttttca agacactgga taccgacctt 2100
gacggggtcg tcacctttga tctcttcaaa tggctccagc tcactatgtt cgcacatcat 2160
caccatcacc attaactcga g 2181
<210> 2
<211> 724
<212> PRT
<213> 钙蛋白酶-1(Calpain-1)
<400> 2
Lys Leu Ala Thr Met Ala Glu Glu Val Ile Thr Pro Val Tyr Cys Thr
1 5 10 15
Gly Val Ser Ala Gln Val Gln Lys Leu Arg Ala Lys Glu Leu Gly Leu
20 25 30
Gly Arg His Glu Asn Ala Ile Lys Tyr Leu Gly Gln Asp Tyr Glu Gln
35 40 45
Leu Arg Ala His Cys Leu Gln Ser Gly Ser Leu Phe Arg Asp Glu Ala
50 55 60
Phe Pro Pro Val Pro Gln Ser Leu Gly Phe Lys Glu Leu Gly Pro Asn
65 70 75 80
Ser Ser Lys Thr Tyr Gly Val Lys Trp Lys Arg Pro Thr Glu Leu Phe
85 90 95
Ser Asn Pro Gln Phe Ile Val Asp Gly Ala Thr Arg Thr Asp Ile Cys
100 105 110
Gln Gly Ala Leu Gly Asp Cys Trp Leu Leu Ala Ala Ile Ala Ser Leu
115 120 125
Thr Leu Asn Asp Thr Leu Leu His Arg Val Val Pro His Gly Gln Ser
130 135 140
Phe Gln Asn Gly Tyr Ala Gly Ile Phe His Phe Gln Leu Trp Gln Phe
145 150 155 160
Gly Glu Trp Val Asp Val Val Val Asp Asp Leu Leu Pro Thr Lys Asp
165 170 175
Gly Lys Leu Val Phe Val His Ser Ala Gln Gly Asn Glu Phe Trp Ser
180 185 190
Ala Leu Leu Glu Lys Ala Tyr Ala Lys Val Asn Gly Ser Tyr Glu Ala
195 200 205
Leu Ser Gly Gly Ser Thr Ser Glu Gly Phe Glu Asp Phe Thr Gly Gly
210 215 220
Val Thr Glu Trp Tyr Glu Leu Arg Lys Ala Pro Ser Asp Leu Tyr Ser
225 230 235 240
Ile Ile Leu Lys Ala Leu Glu Arg Gly Ser Leu Leu Gly Cys Ser Ile
245 250 255
Asp Ile Ser Ser Val Leu Asp Met Glu Ala Val Thr Phe Lys Lys Leu
260 265 270
Val Lys Gly His Ala Tyr Ser Val Thr Gly Ala Lys Gln Val Asn Tyr
275 280 285
Gln Gly Gln Met Val Asn Leu Ile Arg Met Arg Asn Pro Trp Gly Glu
290 295 300
Val Glu Trp Thr Gly Ala Trp Ser Asp Gly Ser Ser Glu Trp Asn Gly
305 310 315 320
Val Asp Pro Tyr Gln Arg Asp Gln Leu Arg Val Arg Met Glu Asp Gly
325 330 335
Glu Phe Trp Met Ser Phe Arg Asp Phe Leu Arg Glu Phe Thr Arg Leu
340 345 350
Glu Ile Cys Asn Leu Thr Pro Asp Ala Leu Lys Ser Gln Arg Val Arg
355 360 365
Asn Trp Asn Thr Thr Leu Tyr Glu Gly Thr Trp Arg Arg Gly Ser Thr
370 375 380
Ala Gly Gly Cys Arg Asn Tyr Pro Ala Thr Phe Trp Val Asn Pro Gln
385 390 395 400
Phe Lys Ile Arg Leu Glu Glu Thr Asp Asp Pro Glu Asp Asp Tyr Gly
405 410 415
Gly Arg Glu Ser Gly Cys Ser Phe Val Leu Ala Leu Met Gln Lys His
420 425 430
Arg Arg Arg Glu Arg Arg Phe Gly Arg Asp Met Glu Thr Ile Gly Phe
435 440 445
Ala Val Tyr Glu Val Pro Pro Glu Leu Val Gly Gln Pro Val His Leu
450 455 460
Lys Arg Asp Phe Phe Leu Ala Asn Ala Ser Arg Ala Arg Ser Glu Gln
465 470 475 480
Phe Ile Asn Leu Arg Glu Val Ser Thr Arg Phe Arg Leu Pro Pro Gly
485 490 495
Glu Tyr Val Val Val Pro Ser Thr Phe Glu Pro Asn Lys Glu Gly Asp
500 505 510
Phe Val Leu Arg Phe Phe Ser Glu Lys Lys Ala Gly Thr Gln Glu Leu
515 520 525
Asp Asp Gln Val Gln Ala Ile Leu Pro Asp Glu Gln Val Leu Ser Glu
530 535 540
Glu Glu Ile Asp Glu Asn Phe Lys Ala Leu Phe Arg Gln Leu Ala Gly
545 550 555 560
Glu Asp Met Glu Ile Ser Val Arg Glu Leu Arg Thr Ile Leu Asn Arg
565 570 575
Ile Ile Ser Lys His Lys Asp Leu Arg Thr Lys Gly Phe Ser Leu Glu
580 585 590
Ser Cys Arg Ser Met Val Asn Leu Met Asp Arg Asp Gly Asn Gly Lys
595 600 605
Leu Gly Leu Val Glu Phe Asn Ile Leu Trp Asn Arg Ile Arg Asn Tyr
610 615 620
Leu Ser Ile Phe Arg Lys Phe Asp Leu Asp Lys Ser Gly Ser Met Ser
625 630 635 640
Ala Tyr Glu Met Arg Met Ala Ile Glu Ser Ala Gly Phe Lys Leu Asn
645 650 655
Lys Lys Leu Phe Glu Leu Ile Ile Thr Arg Tyr Ser Glu Pro Asp Leu
660 665 670
Ala Val Asp Phe Asp Asn Phe Val Cys Cys Leu Val Arg Leu Glu Thr
675 680 685
Met Phe Arg Phe Phe Lys Thr Leu Asp Thr Asp Leu Asp Gly Val Val
690 695 700
Thr Phe Asp Leu Phe Lys Trp Leu Gln Leu Thr Met Phe Ala His His
705 710 715 720
His His His His
<210> 3
<211> 2048
<212> DNA
<213> PEDV OH851 S1 (S1)
<400> 3
atgaagtctc tgaactattt ttggctgttt ctgccggtgc tgtctactct gagcctgccg 60
caagacgtta cccgctgtca gagcaccatc aacttccgcc gtttcttttc caaattcaat 120
gtgcaggccc ctgccgtcgt ggttctgggt ggttacctgc cgtccatgaa ctcttccagc 180
tggtactgtg gcaccggcct ggaaaccgca tccggtgtac acggcatttt cctgtcttac 240
atcgatgcag gccagggttt cgaaatcggt atcagccagg agccgtttga cccttctggc 300
tatcagctgt acctgcataa agccaccaac ggcaaccata acgctatcgc tcgcctgcgc 360
atttgtcagt tcccggataa caaaaccctg ggtccgaccg tcaacgatgt tactaccggt 420
cgtaactgcc tgtttaataa ggcgatcccg gcttacatgc aggacggtaa gaacatcgtt 480
gtaggtatta cgtgggataa cgaccgtgtc acggtgttcg cggataagat ctaccacttc 540
tacctgaaaa acgactggtc ccgtgtcgca acccgctgct acaataaacg ttcctgtgct 600
atgcagtacg tgtacacccc gacttactat atgctgaacg taacctccgc aggcgaagac 660
ggcatttatt acgaaccgtg tacggcgaac tgctctggct atgccgctaa cgtgttcgcc 720
accgactcta acggccacat ccctgagggt ttttccttca acaactggtt tctgctgtcc 780
aacgattcca ccctgctgca tggtaaagtg gtttctaacc agccgctgct ggtaaactgc 840
ctgctggcga ttcctaaaat ctatggcctg ggtcagtttt tcagcttcaa ccaaaccatg 900
gacggtgtat gcaacggtgc ggctgctcag cgtgcaccgg aagcactgcg cttcaacatc 960
aacgatacct ctgttatcct ggcggaaggc tccatcgtac tgcacacggc tctgggtacc 1020
aacctgtcct tcgtttgcag caactctagc gacccgcatc tggctacttt tgccatcccg 1080
ctgggtgcca ctcaggtacc atattattgc ttcctgaaag ttgatactta caatagcacc 1140
gtctacaaat ttctggcagt tctgccgcca acggtgcgtg agatcgtaat caccaaatac 1200
ggcgatgtat atgttaatgg ttttggttat ctgcacctgg gtctgctgga cgctgttacc 1260
attaacttca ccggccacgg tactgacgac gacgtcagcg gcttctggac tattgcctcc 1320
accaactttg tagatgcgct gatcgaagtt cagggtaccg caattcagcg tatcctgtac 1380
tgtgacgacc cagtgtctca gctgaaatgc agccaagtag cattcgatct ggacgacggc 1440
ttctatccaa tcagcagccg caatctgctg tctcacgaac agccgatcag ctttgttacc 1500
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cacagcggcg ctaacctgat tgcttccgac accaccatta acggtttctc cagcttctgc 1620
gttgataccc gtcagttcac catctctctg ttttataacg tgaccaacag ctatggttac 1680
gtcagcaaaa gccaagatag caactgcccg ttcactctgc agagcgtaaa cgattacctg 1740
tctttctcta aattctgcgt atctactagc ctgctggcca gcgcgtgtac catcgacctg 1800
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aagggcgaac tgatcaccgg taccccgaaa ccgctggaag gcgtaaccga cgtctccttt 1920
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accctgacta actctagctt cctggcgggc gtttactata ctagcgactc cggccaactg 2040
ctggcgtt 2048
<210> 4
<211> 2373
<212> DNA
<213> PEDV CV777 S1(S1)
<400> 4
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ttcaacgttc aggcaccggc ggttgttgtt ctgggcggct acctgccatc catgaactct 180
agctcctggt actgtggtac cggtatcgaa actgcgtctg gcgttcacgg tattttcctg 240
tcctacattg actctggtca gggtttcgag atcggcatct ctcaggaacc gttcgatccg 300
tctggctacc agctgtacct gcacaaagca actaacggca acaccaacgc aatcgctcgt 360
ctgcgtatct gtcagtttcc ggacaacaaa accctgggcc cgacggtgaa cgatgtaact 420
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cacttctatc tgaaaaacga ctggtctcgt gttgcgaccc gttgttacaa ccgtcgtagc 600
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aactgcctgc tggccatccc gaaaatctac ggtctgggtc agttcttcag cttcaaccac 900
accatggacg gtgtttgtaa cggtgcagcc gtggaccgtg cgccggaagc tctgcgtttt 960
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gccagcacga acttcgttga cgcgctgatc gaagtccaag gcacgtccat tcagcgtatc 1380
ctgtactgtg acgatccggt atcccagctg aaatgctctc aggtcgcttt tgatctggat 1440
gacggttttt accctatttc tagccgtaac ctgctgtccc acgaacagcc gatttccttt 1500
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tacctgtctt tctccaaatt ctgtgtttct acctctctgc tggcaggcgc ttgtacgatc 1800
gatctgttcg gctatccagc tttcggctct ggtgttaaac tgacgtccct gtatttccag 1860
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atcattactc tgaccaactc ttccattctg gccggtgttt attacaccag cgactccggc 2040
cagctgctgg cgtttaagaa cgttaccagc ggtgcggtgt actctgtgac cccgtgttcc 2100
tttagcgaac aggcagcgta tgttaacgac gacattgtcg gcgtcatttc ttccctgtct 2160
aattccacct tcaacaacac tcgtgaactg ccgggtttct tttaccactc taacgacggc 2220
tctaactgta ctgaaccagt gctggtttac agcaacattg gcgtttgtaa aagcggttcc 2280
atcggttacg taccgtccca gtacggtcag gtcaaaatcg caccgaccgt cactggtaac 2340
atctctatcc caaccaactt ctcctaactc gag 2373
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